莪術醇通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路介導的自噬抑制乳腺癌細胞的增殖活性

亓新峰，馮緒強，王建鳳

（1.濟南市第二婦幼保健院藥劑科，山東濟南 271100；2.高密市中醫院藥劑科，山東高密 261599）

莪術是我國傳統中藥，具有行氣破血、消積止痛等功效，在多種疾病發生發展過程中發揮抗炎、抗氧化等多種藥理作用[1-2]。莪術中富含揮發油，具有良好抗炎、抗病毒及抗腫瘤活性，莪術醇是莪術揮發油的主要成分之一，已被證實在鼻咽癌、肝癌中具有抗腫瘤效果[3-4]。另外，也有研究表明，莪術醇對乳腺癌細胞具有增殖抑制作用，但其具體作用機制尚不明確[5]。自噬是細胞維持生存的重要機制之一，通過吞噬自身異常或受損的蛋白、細胞質或細胞器，維持細胞穩態。自噬在腫瘤中既可發揮促癌作用，亦可通過多種途徑發揮抑瘤作用。研究顯示，在電離輻射等應激條件下，可誘導乳腺癌細胞自噬，調控相關信號通路，誘導細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用[6]。本研究通過莪術醇作用于乳腺癌細胞，探討其對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，并從自噬角度探索其作用機制，旨在為臨床開發莪術醇抗乳腺癌相關藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

人乳腺癌細胞株MCF-7，購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器

莪術醇（≥96.7%）購自海門德思行藥業科技有限公司，Annexin Ⅴ凋亡試劑盒購自美國BD Bioscience公司，單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）自噬檢測試劑盒購自美國Sigma公司，Hoechst 33258染色試劑盒購自北京吉美生物技術有限公司，740Y-P購自美國medchemexpress公司；兔抗人Beclin1，p62，微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）B、脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、p-Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR 一抗和HRP 標記的山羊抗兔IgG 均購自美國Abcam 公司。MK3 酶標儀購自美國Thermo 公司，Power PAC2000 電泳儀和Gel Doc EZ 凝膠成像分析系統購自美國Bio-Rad 公司，Cytomics FC 500 流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，BX51TF熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

MCF-7 細胞置于37 ℃水浴鍋中復蘇，接種于RPMI 1640 培養基（含有體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素），置于體積分數5% CO2培養箱中，37 ℃條件下培養，選取生長良好對數增殖期細胞用于后續實驗。

1.2.2 MTT 法檢測不同濃度莪術醇對MCF-7 細胞增殖的影響

使用無水乙醇溶解莪術醇，配制成1×104μmol/L濃度的母液備用。取對數增殖期MCF-7細胞，PBS重懸后調整細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板，細胞融合達80%時，加入12.5、25、50、100、200 μmol/L濃度的莪術醇（使用RPMI 1640培養基稀釋），另設不含莪術醇的空白組，各設5 個復孔。培養24 h 后，每孔避光加入5 g/L 的MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后棄去上清，每孔加入150 μL 的DMSO，充分振蕩10 min，使用酶標儀于490 nm 處讀取各孔吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-藥物組A值/空白組A值）×100%，計算半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 細胞分組

取對數增殖期MCF-7 細胞，分為對照組、莪術醇組、740Y-P 組和莪術醇+740Y-P 組，莪術醇組加入50 μmol/L 的莪術醇，740Y-P 組加入10 μmol/L 的740Y-P，莪術醇+740Y-P 組分別加入上述濃度莪術醇和740Y-P，繼續培養24 h。

1.2.4 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力

調整各組細胞密度為4×102個/mL，接種于培養皿，每2 d 換液1 次，培養14 d 后，棄去培養基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結晶紫染色20 min，吸出染色液，PBS 清洗，晾干，拍照觀察，計數每組細胞克隆形成數。

1.2.5 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡情況

取各組細胞，調整細胞密度1×105個/mL，接種于6 孔板中，培養24 h 后，棄去培養液，胰酶消化，PBS清 洗2 次，4% 多聚甲醛固定15 min，加入5 μL Hoechst 33258 染液和5 μL PI 染液，4 ℃孵育30 min，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，顯示藍色熒光表示細胞凋亡。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

各組細胞調整密度為1×105個/mL，接種于6孔板，24 h后，收集各組細胞，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS 清洗，加入100 μL Binding Buffer重懸細胞，加入195 μLAnnexin-Ⅴ4 ℃搖床避光孵育15 min，加入5 μL PI染液混勻，4 ℃孵育5 min。上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。重復3次，取平均值。

1.2.7 MDC染色觀察細胞自噬

各組細胞調整密度為1×105個/mL，接種于6 孔板，24 h 后，棄去培養基，PBS 清洗，加入0.05 mml/L的MDC 染液，37 ℃孵育60 min，棄去染液，PBS 清洗，熒光顯微鏡下觀察細胞自噬情況，細胞內出現點狀熒光染色表示為自噬泡。

1.2.8 Western blot檢測細胞中相關蛋白表達

收集各組細胞，胰酶消化，PBS 洗滌，加入RIPA細胞裂解液充分混勻，置于冰上裂解，12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA 法測定蛋白濃度。100 ℃水浴5 min 使蛋白變性，加樣、進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉至PVDF膜，將條帶放入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗 膜15 min×2 次，將膜放入稀釋好的PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、p62、LC3B 一抗中，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜15 min×3次，將膜放入稀釋好的HRP 標記的二抗中，室溫搖床孵育2 h，TBST 洗膜15 min×3 次。將ECL 工作液滴入PDVF 膜上，避光孵育3 min，放入凝膠成像系統，曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白和內參GAPDH 蛋白條帶灰度比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS25.0軟件對數據進行分析，計量資料

2 結果

2.1 不同濃度莪術醇對MCF-7細胞的增殖抑制作用

隨著莪術醇濃度升高，細胞增殖抑制率增加，呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖1。莪術醇作用于MCF-7 細胞的IC50為50.63 μmol/L，后續實驗選取莪術醇濃度為50 μmol/L。

圖1 不同濃度莪術醇對MCF-7細胞的增殖抑制作用

2.2 各組細胞克隆形成數比較

與對照組（113.69±12.16 個）比較，740Y-P 組細胞克隆形成數（184.13±8.52 個）增加，莪術醇組細胞克隆形成數（26.19±7.58 個）減少（P＜0.05）；莪術醇+740Y-P組細胞克隆形成數（52.47±10.82個）較740Y-P組減少，較莪術醇組增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞克隆形成結果

2.3 Hoechs 33258染色結果

熒光顯微鏡下可見，對照組和740Y-P 組細胞數量較多，藍色熒光較弱，生長良好，染色均勻，凋亡細胞較少；莪術醇組細胞數量減少，可見大量較強藍色熒光，細胞形態皺縮，發生解體；莪術醇+740Y-P 組細胞數量較莪術醇組增加，可見較多藍色熒光，部分細胞解體。見圖3。

圖3 各組細胞Hoechs 33258染色結果（×100）

2.4 各組細胞凋亡率比較

與對照組（[3.21±0.74）%]比較，740Y-P 組細胞凋亡率[（1.65±0.68）%]降低，莪術醇組細胞凋亡率（[25.68±1.47）%]升高（P＜0.05）；莪術醇+740Y-P 組細胞凋亡率（[12.27±1.36）%]較740Y-P 組升高，較莪術醇組降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組細胞流式細胞術檢測結果

2.5 MDC染色結果

MDC 染色顯示，對照組、740Y-P 組熒光強度較弱；莪術醇組出現大量綠色熒光增強的自噬泡，莪術醇+740Y-P組自噬泡較莪術醇組減少。見圖5。

圖5 各組細胞MDC染色結果（×400）

2.6 各組細胞中自噬相關蛋白表達水平比較

Beclin1、p62、LC3Ⅱ/LCⅠ在各組之間存在差異。與對照組比較，740Y-P 組細胞中Beclin1 蛋白表達水平、LC3Ⅱ/LCⅠ降低，P62 蛋白表達水平升高，莪術醇組細胞中Beclin1 蛋白表達水平、LC3Ⅱ/LCⅠ升高，P62 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；莪術醇+740YP 組細胞中Beclin1 蛋白表達水平、LC3Ⅱ/LCⅠ較740Y-P 組升高，較莪術醇組降低，p62 蛋白表達水平較740Y-P 組降低，較莪術醇組升高（P＜0.05）。見表1，圖6。

表1 各組細胞中自噬相關蛋白表達水平比較

圖6 各組細胞中自噬相關蛋白表達電泳圖

2.7 各組細胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關蛋白表達水平比較

除Akt和mTOR 外，其他檢測指標在各組之間存在差異。與對照組比較，740Y-P 組細胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達水平升高，莪術醇組細胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；莪術醇+740Y-P 組細胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達水平較740Y-P 組降低，較莪術醇組升高（P＜0.05）。見表2，圖7。

表2 各組細胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關蛋白表達水平比較（，n=5）

表2 各組細胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關蛋白表達水平比較（，n=5）

注：（1）與對照組比較，P＜0.05；（2）與740Y-P組比較，P＜0.05；（3）與莪術醇組比較，P＜0.05。

圖7 各組細胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達電泳圖

3 討論

乳腺癌細胞通過無限增殖，促進腫瘤生長，侵襲鄰近組織和器官，向遠處轉移，并可對傳統化療藥物產生抗藥性，影響治療效果，預后不佳。自噬參與腫瘤細胞生存、分化等多個生理過程，在維持細胞穩態過程中發揮重要作用。同時有研究顯示，自噬可消化水解毒性蛋白，與腫瘤細胞耐藥密切相關[7]。自噬與凋亡存在相互關系，參與調控腫瘤細胞凋亡過程，通過誘導自噬，提高腫瘤細胞自身降解，進而抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，輔助增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，對于臨床治療腫瘤具有重要意義[8]。

莪術醇活性廣泛，可通過調控相關促癌或抑癌基因表達、減弱腫瘤組織血管生成能力、影響細胞分化，抑制腫瘤細胞增殖，阻止腫瘤發生侵襲和轉移，具有明顯抗腫瘤活性[9]。本研究采用不同濃度莪術醇作用于MCF-7 細胞，結果顯示，莪術醇以劑量依賴方式不同程度抑制細胞的增殖，證實了莪術醇對乳腺癌細胞的增殖抑制作用。Ning 等[10]報道，莪術醇可調節微小RNA 表達，抑制黑色素瘤小鼠腫瘤細胞增殖和轉移。Cai 等[11]研究表明，莪術醇可增加塞來昔布對非小細胞肺癌的抑制作用，減少肺組織腫瘤轉移結節。本研究采用克隆形成實驗、Hoechst33258染色及流式細胞術分別檢測細胞克隆形成能力、形態改變及凋亡情況，結果顯示莪術醇組細胞克隆形成數較對照組明顯減少，細胞形態發生明顯改變，凋亡率明顯升高，進一步證實莪術醇可抑制乳腺癌細胞增殖并促進細胞凋亡。

自噬通過在溶酶體中降解內吞蛋白質或受損細胞器，提供能量來源，有助于細胞生存，然而過度自噬可導致細胞自噬性死亡，對細胞具有促進生存及誘導死亡的雙重作用。激活自噬被認為是抗腫瘤的新途徑，通過增加細胞自噬通量，促進細胞死亡，可有針對性地逆轉乳腺癌細胞耐藥性，發揮抗腫瘤作用[12]。Beclin1 蛋白參與介導吞噬泡的形成，其表達降低則自噬體形成受限；LC3B 是檢測自噬活性標志性蛋白，包括Ⅰ型和Ⅱ型，發生自噬時，LC3 Ⅰ經泛素樣修飾形成LC3 Ⅱ，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ與自噬活性密切相關；p62 蛋白可反映自噬的強弱，與自噬水平呈負相關。本研究結果顯示莪術醇組細胞MDC 染色自噬水平，Beclin1 蛋白表達、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ較對照組明顯升高，p62 蛋白表達明顯降低，提示莪術醇可誘導MCF-7 細胞發生自噬，可能是其抑制細胞增殖誘導細胞凋亡的相關機制之一。Zhang 等[13]證實，在骨肉瘤MG-63 細胞中，莪術醇可通過誘導自噬，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。此外，劉發英等[14]研究顯示，莪術醇在宮頸癌-HCC94 細胞中同樣可發揮誘導自噬，促進凋亡的作用。本研究結果與以上研究一致，提示莪術醇通過誘導自噬，增加MCF-7 細胞自噬通量，促進自身降解，發揮潛在抗腫瘤作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡等過程，與腫瘤細胞自噬密切相關，抑制該通路是抗腫瘤的重要途徑。PI3K 是上游通路關鍵信號分子，參與調節細胞增殖和細胞周期，Akt 是PI3K 下游重要靶蛋白，可被其磷酸化活化為p-Akt，進一步激活下游mTOR 為p-mTOR，抑制細胞自噬和凋亡，促進腫瘤細胞增殖和細胞周期進程加速，在腫瘤形成及侵襲過程中發揮關鍵作用[15]。莪術醇通過何種機制誘導MCF-7 細胞自噬，尚需進一步研究探討，本研究使用PI3K 激活劑740Y-P 干預MCF-7 細胞，結果顯示PI3K/Akt/mTOR 信號通路激活，細胞自噬被抑制，而莪術醇組PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達較對照組明顯下降，自噬水平升高，提示莪術醇可能具有抑制該通路激活自噬的作用。進一步在莪術醇干預的基礎上聯合使用740Y-P，結果顯示，740Y-P可減弱莪術醇對PI3K/Akt/mTOR 信號通路的抑制作用，同時自噬相關蛋白表達也發生明顯逆轉，結果證實莪術醇可抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，提示莪術醇抑制MCF-細胞增殖、誘導細胞凋亡，可能與調控PI3K/Akt/mTOR信號通路介導的自噬有關。

綜上，莪術醇可抑制乳腺癌MCF-7 細胞增殖，促進細胞凋亡，可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路關鍵蛋白表達，進而激活自噬有關，這可為臨床乳腺癌相關藥物開發提供實驗依據。此外，本研究僅局限在細胞水平，尚需在動物實驗進一步驗證以上結論。