DNA基因甲基化檢測在大腸癌診斷中的研究進展*

張德文,張 麗 綜述,朱喜丹 審校

1.自貢市第三人民醫院檢驗科,四川自貢 643020;2.內江衛生與健康職業學院基礎醫學部,四川內江 641100;3.西南醫科大學附屬醫院醫學檢驗部,四川瀘州646000

大腸癌(CRC)作為常見的惡性腫瘤,包括結腸癌和直腸癌。據國家癌癥中心2022年發布的數據顯示,肺癌、結腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌是排名前5的癌癥,占新發病例總數的57.4%[1]。有研究表明,CRC患者在早期無明顯臨床癥狀,85%以上的患者一經發現就已經是晚期。CRC患者早期進行臨床治療,約90%的患者不需要化療,5年生存率可達95%[2],由此提示開展有組織的早期篩查有助于降低CRC的病死率?，F代腫瘤學研究認為,腫瘤的發生與抑癌基因的丟失和失活有關,發生表觀遺傳學的累積改變,該改變可以在癌癥早期通過高靈敏度技術檢測到[3]。DNA甲基化是目前最早被發現、研究最深入的表觀遺傳調控機制之一[4]。抑癌基因啟動子區域胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)島的高甲基化,是諸多癌癥發生早期的重要事件之一。因此,DNA甲基化相關標志物的檢測有望成為CRC早期診斷的重要手段。本文就近年來DNA甲基化在CRC早期診斷中的應用展開綜述,以期為后續研究CRC的早期診斷提供相關理論依據。

1 表觀遺傳學、甲基化及其在CRC中的作用

廣義的表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的情況下,通過DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA表達等方式發生可遺傳的表型變化。表觀遺傳學控制的基因表達模式破壞會導致自身免疫性疾病、癌癥和各種其他疾病。表觀遺傳的畸變在疾病早期就可以被檢測出來[5],并且相比遺傳變化的難以逆轉,表觀遺傳所導致的變化可以在藥物干預下發生一定逆轉。隨著靶向基因表達調控中所涉及的特定表觀遺傳機制藥物的發展,表觀遺傳工具的開發和利用是一種可應用于各種疾病治療的有效方法。因此,表觀遺傳學可作為新興工具用于癌癥的診斷和治療。

DNA甲基化是生物體內普遍存在的表觀遺傳調節方式[6]。甲基化是DNA重要的修飾方式之一,是指在DNA甲基化轉移酶的作用下,S-腺苷甲硫氨酸中的甲基基團共價結合到基因組DNA序列上CpG島的二核苷酸胞嘧啶的5′C端,進而轉變為5-甲基胞嘧啶的過程[7]。其中CpG島是指基因組中一段含有大量C和G的重復序列區域。CRC抑癌基因中的CpG島甲基化通常位于基因組C、G含量大于50%的啟動子區域[8]。相對于結腸鏡檢測,CRC中基因甲基化的檢測具有無創傷性、無侵入性、無飲食限制等優點,并且與早期診斷、預后、復發情況均密切相關[9]。

2 CRC早期診斷的常用DNA甲基化基因

2.1黏結蛋白聚糖2(SDC2)基因 SDC2基因屬于Syndecans家族,該家族由進化保守的4個不同基因編碼的Ⅰ型跨膜蛋白聚糖構成,其中SDC2由糖胺聚糖鏈共價連接的蛋白質核心組成[8]。有研究表明,SDC2主要在間充質細胞,如成纖維細胞和平滑肌細胞中表達,具有調節組織發育與穩態的功能,包括細胞增殖、分化、黏附、細胞骨架組織、遷移、傷口愈合、細胞基質通信、血管生成,還與炎癥反應和癌癥的發生有關[9-10]。眾所周知,大多數癌癥是由息肉引起的,息肉癌變過程需要10～15年,開始于異常的隱窩,演變為腫瘤前期病變(息肉),最終發展為結直腸癌[3]。2017年,OH等[11]通過單向線性靶標富集(LTE)和SDC2的定量甲基化特異性實時聚合酶鏈反應(qMSP)檢測不同分期(Ⅰ～Ⅳ期)CRC患者(n=50)和癌前病變患者(n=21)及健康體檢者(n=22)糞便中SDC2甲基化的DNA,其檢測CRC的總體靈敏度為90.0%,檢測小息肉的總體靈敏度為33.3%,特異度為90.9%。HAN等[12]通過對245例CRC患者糞便DNA中SDC2基因進行LTE和qMSP檢測,CRC(0～Ⅳ期)的總體靈敏度為90.2%,特異度為90.2%;早期(0～Ⅱ期)的靈敏度為89.1%(114/128);晚期和非晚期腺瘤的檢出率分別為66.7%(2/3)和24.4%(10/41),表明SDC2甲基化具備作為CRC早期檢測的潛力。

梁霞等[13]通過比較56例原發性CRC患者與50例健康體檢者的SDC2甲基化表達量、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)水平發現,SDC2甲基化基因在CRC組織中呈高表達,并且SDC2甲基化基因診斷CRC的靈敏度和特異度均高于CEA、CA19-9及CEA聯合CA-199的診斷結果。同時,MA等[14]以一種新的實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測試劑用于102例CRC患者中SDC2 CpG島中含有2個差異甲基化區域的檢測,結果顯示,單獨通過甲基化SDC2-A檢測CRC的靈敏度為85.3%,特異度為96.2%;單獨甲基化SDC2-B檢測的靈敏度為83.3%,特異度為97.7%。然而,當甲基化SDC2-A和甲基化SDC2-B合并時,檢測CRC的靈敏度提高至87.3%,特異度降低為94.6%。這預示著對SDC2 CpG島中多個差異甲基化區域進行同時檢測將更有助于CRC的早期診斷,并且檢測結果相比腫瘤標志物更準確。事實上,CRC發生前期,腫瘤細胞脫落到結直腸腔的頻率是正常大腸細胞的4～5倍,且早于血管侵襲[15],因此,從理論上講,糞便SDC2基因檢測比血液更適合作為早期發現大腸腫瘤的標本,NIU等[7]的研究結果也證明了這一結論。

2.2胞裂蛋白9(SEPT9)基因 SEPT9基因屬于細胞骨架三磷酸鳥苷結合蛋白家族[16]。目前,在哺乳動物中已鑒定出13個SEPT基因(SEPT1～SEPT12和SEPT14),可以分為4個亞組(SEPT2、SEPT3、SEPT6和SEPT7)。其中SEPT9是一種細胞周期相關蛋白,在細胞分裂過程中協調肌球蛋白和運動蛋白[17]。當SEPT9基因在體內異常表達或出現缺失時,細胞分裂會受到嚴重影響,在一定程度上導致惡性腫瘤發生。AMIR等[18]提出,SEPT9過表達可抑制缺氧誘導因子-1(HIF-1)的泛素化和降解,提高HIF-1的轉錄活性和下游基因,如血管內皮生長因子的表達。血管內皮生長因子過表達會促進腫瘤組織的血管生成,這為腫瘤的增殖和浸潤奠定了基礎。在CRC中,當SEPT9基因啟動子區域CpG島出現高度甲基化時,會阻斷SEPT9基因的表達,導致其抗癌功能喪失。2008年以來,已有許多研究團隊發表了一系列通過檢測SEPT9基因甲基化來監測CRC的臨床數據。TTH等[19]使用EpiproColon2.0 RT-PCR定性檢測93例結直腸癌患者和94例健康體檢者的血標本,相對于糞便隱血試驗、癌胚抗原(CEA)和EpiproColon1.0 RT-PCR的檢測,EpiproColon2.0 RT-PCR檢測CRC的靈敏度為79.3%,特異度為98.9%,其中對Ⅰ期CRC的靈敏度為95.6%,特異度為84.8%,對Ⅱ～Ⅳ期CRC的靈敏度可達100.0%,特異度為98.9%。這表明SEPT9基因比糞便隱血試驗和CEA更敏感和特異,也更適合于CRC Ⅱ～Ⅳ期患者的評估。

2.3分泌型卷曲相關蛋白1(SFRP1)基因 SFRP1基因屬于SFRPs家族,是新近發現的對Wnt信號通路有抑制作用的候選抑癌基因[20]。SFRP1基因啟動子區域的高度甲基化是基因失活的重要原因,Wnt信號通路的異常激活會使CRC中細胞凋亡受到抑制,腫瘤細胞出現大量增殖[21]。SFRP1基因不僅在早期CRC中會出現高度甲基化,而且在大腸息肉患者中也會出現。銀廣悅等[22]選取32例健康體檢者(對照組)與50例CRC患者(CRC組)、30例大腸增生性息肉患者(增生組)、36例大腸腺瘤患者(腺瘤組)作為研究對象,分析糞便中Wnt抑制因子-1(WIF-1)及SFRP1基因甲基化情況后發現,CRC組WIF-1及SFRP1基因甲基化率為60.0%及64.0%,增生組為20.0%及20.0%,腺瘤組為44.4%及52.8%。聯合WIF-1及SFRP1檢測對大腸腺瘤及CRC的靈敏度分別為66.7%及76.0%,且2個基因在腺瘤組及CRC組中的甲基化水平均高于對照組及增生組。

3 DNA甲基化基因與其他技術聯合診斷CRC

目前,CRC的診斷方法較多,包括糞便隱血試驗、結直腸鏡檢查、血清腫瘤標志物篩查、糞便DNA檢查、病理組織活檢等。DNA甲基化作為近年來越來越受認可的CRC診斷方法,雖然其具備無創性、無侵入性、較高的靈敏度和特異度,但是標本質量容易受到患者飲食、藥物等因素的影響,且標本處理,尤其是糞便標本的處理較為復雜,限制其用于大范圍人群的篩查。因此,采用DNA甲基化檢測與其他檢測方法聯合診斷CRC,可提高檢測的診斷價值。

潘輝等[23]經過對64例CRC患者糞便標本進行甲基化特異性 PCR檢測后,糞便基因SDC2和BMP3聯合檢測結直腸癌的診斷效能優于BMP3檢測。譚琪等[24]采用熒光PCR同步檢測外周血血漿游離SEPT9、SDC2、支鏈氨基酸氨基轉移酶1(BCAT1)3種基因中甲基化狀態發現,血漿SEPT9、SDC2、BCAT1甲基化聯合檢測在CRC組中Ⅰ～Ⅳ期的陽性率分別為72.7%(16/22)、87.2%(34/39)、85.7%(30/35)和96.0%(24/25),其在結直腸癌Ⅰ～Ⅲ期陽性率明顯高于CEA,差異均有統計學意義(P<0.05),在此研究中可以發現,聯合分子標記物檢測可在一定程度上提高靈敏度,但臨床早期CRC的診斷還需要結合其他檢測方法和臨床癥狀進行綜合判斷。

李建等[25]通過收集47例CRC患者和33例非結直腸癌體檢者的外周血對其進行SFRP1、SEPT9基因甲基化和糞便隱血試驗結合檢測,結果顯示,SFRP1和SEPT9基因甲基化診斷結直腸癌的靈敏度為80.0%,特異度為95.3%,糞便隱血試驗的靈敏度為86.3%,特異度為54.3%,二者聯合檢測的靈敏度為97.6%,特異度為96.8%,明顯高于單項檢測。李建等[25]研究表明,DNA甲基化與糞便隱血試驗聯合檢測具有無創、采樣簡單、依從性好、實驗方法穩定等特點,更適合于臨床。吳秀方等[26]評估對照組、腺瘤組、早期癌組、進展期癌組患者血漿中SEPT9基因甲基化、血清CEA單項及二者聯合檢測后發現,早期癌組患者血漿SEPT9甲基化和血清CEA檢測的陽性率分別為33.3%和16.7%,二者聯合檢測的陽性率可提高至41.7%;進展期癌組患者血漿SEPT9甲基化和血清CEA檢測的陽性率分別為88.9%和55.6%,二者聯合檢測的陽性率可達到100.0%,表明血漿SEPT9甲基化單項檢測用于鑒別腺瘤和早期癌癥價值有限,在早期和進展期CRC患者中,血漿SEPT9甲基化檢測陽性率均高于血清CEA,二者聯合檢測的診斷價值更高。高海鋒等[27]在血漿SEPT9甲基化、血清CEA的基礎上,聯合糖類抗原(CA)724診斷CRC發現,血清CEA檢測診斷CRC的靈敏度不及血漿SEPT9基因甲基化,但特異度和陰性預測值均最高,可以彌補SEPT9基因甲基化和CA724診斷過程中誤診率高的不足;CA724檢測雖然靈敏度較低,但特異度較SEPT9基因甲基化高,亦可彌補SEPT9基因甲基化誤診率高的不足。SEPT9甲基化、血清CEA、CA724聯合檢測,很好地實現了優勢互補,快速、準確、靈敏度高、患者依從性好及適于普查等優點,極大地提高了CRC的診斷效率。

梁霞等[13]經過比較SDC2和SEPT9基因甲基化檢測的陽性率及二者聯合結腸鏡檢查對進展性CRC的檢出率,在1 000例篩查對象中,糞便SDC2基因甲基化檢測陽性率明顯高于血漿SEPT9基因甲基化,糞便SDC2基因甲基化檢測聯合結腸鏡檢查的檢出率均明顯高于血漿SEPT9基因甲基化檢測聯合結腸鏡檢查的篩查率,表明糞便SDC2甲基化檢測聯合結腸鏡檢查可作為CRC早期篩查的策略之一。龔志贇等[28]選取結直腸癌患者51例、結直腸腺瘤患者22例、健康體檢者39例的糞便和血清標本,分析結果后發現,血清CEA聯合糞便SDC2基因甲基化檢測可將SDC2基因甲基化單項檢測CRC陽性率從84.3%提高至90.2%,有效提升了CRC的檢出率。

4 小 結

CRC是目前中國男性發病率排名第3的癌癥[1],以早期無明顯的臨床病理癥狀,一經發現就已經是中晚期為主要特點,對其進行有效早期診斷、預后、復發的檢測十分必要。目前,雖然檢測方法較多,但各有優缺點。糞便隱血試驗診斷CRC的特異度較低,且檢測結果易受到食物、藥物等因素的影響而不穩定;結直腸鏡是侵入性檢查,患者依從性較差,且易引起腸穿孔、感染等并發癥,不易被患者接受;血清腫瘤標志物檢測雖然是常規篩查手段,但其靈敏度和特異度較低,對于早期病變診斷價值不大;DNA甲基化無創傷、無侵入,靈敏度和特異度較高,但標本質量容易受到患者飲食、藥物等因素的影響。SDC2甲基化在早期結直腸癌患者的血液和糞便標本中檢出率高,并且糞便標本SDC2甲基化具備更易檢出,可作為CRC早期檢測指標。但SDC2甲基化單位點檢測的特異度、靈敏度不如多位點,即聯合檢測診斷能更快、更準確地監測CRC的發生和發展。本研究認為,采用DNA甲基化多位點與其他方法聯合檢測對CRC進行診斷,可提高早期診斷價值。