雪上一枝蒿多糖調控調節性T細胞抑制肝癌肺轉移機制的研究

彭 磊，張 霞，左愛學，張建英，李斯文，方肇勤*，萬春平*

（1.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203；2.云南中醫藥大學，云南 昆明 650021；3.個舊市人民醫院，云南 個舊 661000）

雪上一枝蒿（Aconiturn brachypodum Diels，短柄烏頭）為毛茛科烏頭屬植物短柄烏頭的干燥塊根，性溫，味苦、辛，有大毒，功能祛風除濕、消腫止痛、通利關節。云南的東北部、西北部以及四川的西南部是其主要的分布產地，系重要的南藥品種之一。雪上一枝蒿具有廣泛藥理作用，主要活性成分是烏頭類生物堿。現代藥理學研究已表明，烏頭類生物堿具有多種藥理作用，如鎮痛、抗炎、抗腫瘤等[1-4]。然而目前關于其多糖成分報道較少，利用率較低，在提取過程中多糖成分通常也作為廢棄物棄用。課題組前期研究以云南東川產雪上一枝蒿作為原材料，從中提取、分離、純化出一種雪上一枝蒿的多糖組分XP-10，免疫活性測試實驗結果顯示XP-10具有顯著的免疫調節活性。相關研究成果已取得發明專利（專利號：CN107936130 B，雪上一枝蒿多糖及提取方法以及應用）。鑒此，本研究擬通過構建原發性肝癌肺轉移小鼠動物模型，進一步研究雪上一枝蒿多糖XP-10對于原發性肝癌肺轉移的抑制作用及其作用機理，為雪上一枝蒿多糖抗腫瘤免疫療法及南藥植物資源的合理開發提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料 BALB/c小鼠，雄性，7～8周齡，體質量18～20 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK2017-0004。飼養條件：SPF級動物房，恒溫（22±1）℃，恒濕（55±5）%，飼料、飲水均消毒，自由攝取。實驗動物進行1周以上適應性飼養后使用。嚴格按照實驗動物相關管理條例進行所有動物實驗。

雪上一枝蒿多糖XP-10由左愛學博士（云南中醫藥大學中藥學院）提供，該化合物性狀：焦糖色固體，純度＞75%，易溶于水，具有黏性。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA）和噻唑蘭（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）均購自美國 Sigma公司；Anti-CD3抗體、Anti-Mouse IL-7A-APC、Anti-Mouse Foxp3-Alexa FluorTM488、PEcy7-CD4、Anti-Mouse CD3-APC抗體均購自美國Biolegend公司；RPMI1640培養基購自美國 Gbico公司；青霉素購自山東魯抗醫藥股份有限公司。

H22小鼠肝癌細胞，購自中國科學院昆明動物研究所。

CO2細胞培養箱（Thermo-fisher，美國）、CantoII流式細胞儀（BD，美國）、SpectraMax i3X酶標儀（MD，美國）。

1.2 肝癌肺轉移小鼠模型的構建、分組及給藥 肝癌肺轉移小鼠模型的構建參照文獻[5]，采用尾靜脈注射腫瘤細胞的方法構建肝癌肺轉移小鼠模型。BALB/c小鼠適應性喂養后，用75%乙醇消毒小鼠尾部，尾靜脈注射H22腹水瘤細胞懸液，5×105個/只。2 h后，隨機分為3組，即：肝癌肺轉移病理模型組、XP-10低劑量組（250 mg/kg）和 XP-10高劑量組（500 mg/kg），每組8只。以上各組每天灌胃給藥1次，連續11 d，每天記錄小鼠的生存狀態和體重。

1.3 肺內轉移灶數目統計 藥物干預后，處死小鼠，取出全肺，剝離肺臟，用 Bouin氏液固定24 h，無水乙醇漂洗至黃色褪去，鏡下觀察肺內腫瘤情況，以單盲法計數肺轉移瘤結節數。

1.4 脾淋巴細胞懸液的制備 小鼠酒精消毒后，取其脾臟，無菌載玻片輕輕研磨，濾膜過濾，離心10 min，小心吸棄上清，在每只樣本試管中各加入紅細胞裂解液1 mL，混勻，以使紅細胞充分裂解，加入1640培養基終止裂解，PBS洗2次，最后加入10% RPMI-1640培養基，并將脾淋巴細胞濃度調至4×105個/mL，備用。

1.5 MTT法檢測各組淋巴細胞增殖功能 常規制備各組脾淋巴細胞懸液，按照4×105個/孔接種于96孔板，同時加入2.5 μg/mL絲裂原刀豆蛋白 A（Con A）刺激細胞，放入培養箱中培養48 h，采用MTT法測定各組OD值，以檢測脾淋巴細胞的活力。

1.6 流式細胞術檢測淋巴細胞表面分子和胞內表達水平 流式細胞術檢測參考文獻[6]。對淋巴細胞表面分子標志的染色：各組分別取2×106個脾淋巴細胞懸液，1 200 rpm離心5 min，棄上清，封閉FcR，再加入帶熒光標記的抗體，室溫15 min，進行淋巴細胞表面分子標志染色，FAC冼液清冼1次，收集細胞，完成上機檢測。對淋巴細胞內細胞因子的染色：各組分別取2×106個小鼠脾淋巴細胞，加入刺激素PMA、Ionomycin以及阻斷劑BFA，放入細胞培養箱中培養4 h，收集細胞，洗液清冼2次，棄上清，封閉FcR，進行淋巴細胞內細胞因子的染色。固定液固定、穿膜液清洗，加入帶有熒光標記的抗干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）和白介素 17A（interleukin-17A，IL-17A）抗體。流式細胞儀檢測胞內特異性轉錄因子Foxp3，Flowjo軟件進行分析。

1.7 統計學處理 采用SPSS進行數據分析處理，組間差異使用One-Way ANOVA單因素方差分析；若方差不齊，采用LSD法分析；所有實驗數據以表示，P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著統計學差異。

2 結果

2.1 XP-10干預能減少肝癌肺轉移模型小鼠的肺轉移病灶結節數 體外免疫活性篩選結果提示：XP-10具有顯著的免疫增強活性。為進一步評價XP-10體內給藥抗腫瘤免疫作用，我們構建了肝癌肺轉移小鼠模型。結果顯示，與模型組比較，XP-10（250 mg/kg和500 mg/kg）組顯著減少肝癌肺轉移模型小鼠肺轉移病灶結節數，差異均具有統計學意義（P<0.01），結果見圖1和表1。結果提示：雪上一枝蒿的多糖組分XP-10對H22原發性肝癌肺轉移具有明顯抑制作用且療效顯著，預測XP-10的臨床應用價值較好，具有開發前景。

圖1 XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠肺轉移結節數的影響

表1 XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠肺轉移病灶結節數的影響（±s，n=8)

表1 XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠肺轉移病灶結節數的影響（±s，n=8)

注：與模型組比較，**P<0.01。

組別 劑量（mg/kg） 腫瘤結節（個）模型對照組 - 13.63±4.14 XP-10 250 7.00±2.51**500 6.17±4.40**

2.2 XP-10能促進肝癌肺轉移模型小鼠脾淋巴細胞的增殖 采用MTT法測定各組細胞在570 nm的OD值，以檢測肝癌肺轉移模型小鼠脾淋巴細胞的活力，結果見圖2。結果顯示：與模型組比較，XP-10低劑量（250 mg/kg）和高劑量（500 mg/kg）組肝癌肺轉移模型小鼠的脾淋巴細胞的活力得到顯著提高（P<0.01）。結果提示：雪上一枝蒿的多糖組分XP-10可能是通過提高機體的抗腫瘤免疫能力而發揮抑制H22原發性肝癌肺轉移的作用。

圖2 MTT法檢測XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

2.3 XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠CD3+、CD4+T淋巴細胞的表達無明顯影響 在機體的抗腫瘤免疫效應中，T淋巴細胞，尤其是CD4 T細胞亞群起到至關重要的作用，與腫瘤密切相關。采用流式細胞術對XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠的CD3+、CD4+T淋巴細胞的表達情況進行檢測，結果如圖3所示：與模型組比較，XP-10低劑量（250 mg/kg）和XP-10高劑量（500 mg/kg）組肝癌肺轉移模型小鼠的CD3+、CD4+T淋巴細胞的比例均沒有受到明顯影響，沒有顯著變化（P＞0.05）。提示：XP-10主要影響肝癌肺轉移模型小鼠T淋巴細胞增殖功能，而對CD3+、CD4+T淋巴細胞表達無明顯影響。

圖3 流式細胞技術檢測XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠CD3+、CD4+T淋巴細胞表達的影響

2.4 XP-10能夠顯著下調肝癌肺轉移模型小鼠Treg細胞的表達水平 調節性T細胞（Tregulatorycells，Treg）是T細胞的一個亞群，發揮重要的免疫抑制作用，在免疫逃逸、抗腫瘤免疫及誘導免疫耐受等方面起著很重要的作用。采用流式細胞技術進行檢測，結果如圖4所示：相較于模型組，XP-10兩個劑量灌胃組Treg細胞（Foxp3+CD4+T細胞）的表達均出現下調，其中XP-10低劑量（250 mg/kg）給藥組差異具有統計學意義P<0.05）。

圖4 流式細胞技術檢測XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠Treg細胞表達水平的影響

2.5 XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠Th1和Th17細胞的表達水平無明顯影響 T淋巴細胞作為細胞免疫功能的承擔者，在生物體的免疫反應中占據重要地位，同時T淋巴細胞亦是免疫應答的調節者，具有多種生物學功能。其中Th1和Th17細胞在機體抗腫瘤免疫方面發揮著至關重要的作用。采用流式細胞技術檢測CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+的表達，結果如圖5所示：與模型組比較，XP-10干預后，Th1細胞（IFNγ+CD4）和 Th17細胞（IL-17+CD4）表達無顯著變化（P＞0.05）。

圖5 流式細胞技術檢測XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠Th1、Th17表達水平的影響

3 討論

肝癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，死亡率高，在常見消化道腫瘤中排名第3[7]。肝癌也是最難治的惡性腫瘤之一，其難治性表現除惡性程度高，起病隱匿，病情進展快等常見惡腫瘤特征外，主要還體現于其高復發性和高轉移性。肺部器官中血管和淋巴管豐富，因此肺是最常見的肝外轉移器官，占肝外轉移的39.5%～53.8%，一旦發生肺轉移則治療棘手，嚴重影響患者預后，死亡率高[8]。目前西醫臨床尚無可靠的肝癌肺轉移防治方法。大量研究已表明，中醫藥在對抗化療誘導的副作用、增效減毒和防復發轉移等方面具有獨特優勢。熱毒、瘀毒證候是肝癌中醫學臨床基本證候之一，毒邪致病峻烈、頑固、易相兼為病，臨床治療集中體現為其難治性。研究雪上一枝蒿多糖對于肝癌肺轉移的作用及機制可在一定程度上豐富肝癌中醫證候、治法方藥等方面的理論依據與科學證據。

為評價雪上一枝蒿的多糖組分XP-10對肝癌肺轉移的影響，我們通過小鼠尾靜脈注射H22肝腹水瘤細胞成功構建肺轉移腫瘤動物模型，造模后可見模型小鼠肺上腫瘤結節，體現H22腹水瘤細胞在體內的轉移情況。該方法造模簡單，成模率高，是評價肝癌肺轉移模型經典模型[3]。從研究結果來看，使用雪上一枝蒿多糖組分XP-10對肝癌肺轉移模型小鼠進行藥物干預，能顯著減少肝癌肺轉移的病灶結節數。結果提示：XP-10能夠針對H22原發性肝癌肺轉移起到顯著療效。腫瘤的發生與轉歸與機體的免疫功能密切相關，MTT法檢測淋巴細胞增殖功能顯示，XP-10灌胃給藥顯著激活模型小鼠脾淋巴細胞的增殖反應，提示XP-10具有顯著抗肝癌肺轉移效應，其作用機制與提高荷瘤小鼠抗腫瘤免疫效應有關。

T淋巴細胞在機體的抗腫瘤免疫反應中發揮著至關重要的作用。在不同刺激因素的作用下，CD4+T細胞能夠進一步分化為Th1、Th17、Treg等功能性T細胞亞群，從而誘導產生不同的免疫效應，在機體的免疫反應中發揮不同的功能。Th1細胞亞群主要在細胞因子IFN-γ+與IL-12條件下分化，介導機體的細胞免疫反應。Th17主要分泌細胞因子IL-17，其主要功能是介導機體的炎性反應（防御胞外病原菌的感染），具有高致病性[9]。Treg細胞主要通過分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β發揮免疫負調節作用，其主要功能介導機體免疫耐受和維持內環境的穩定性[10]。大量的研究已表明，這些CD4+T細胞亞群之間的平衡與抗腫瘤免疫反應息息相關。流式細胞技術檢測結果顯示，雪上一枝蒿多糖組分XP-10能顯著下調肝癌肺轉移模型小鼠調節性 T細胞（CD4+Foxp3+Treg細胞），然而對介導炎癥反應Th17細胞（CD4+IL-17A+T細胞）和Th1細胞（CD4+IFN-γ+T細胞）免疫反應無明顯的影響。在肝腫瘤組織和肝轉移癌中，CD4+Foxp3+調節性T細胞大量聚集腫瘤微環境，這些Treg細胞被特異激活，高表達GITR和 ICOS，抑制腫瘤特異性CD4+T細胞的反應，這些結果表明腫瘤相關性Treg細胞與腫瘤逃逸和轉移密切相關[11-12]。雪上一枝蒿多糖組分XP-10可能通過抑制Treg細胞的表達這一途徑來誘導機體的免疫效應，從而起到抑制肝癌肺轉移的作用。該研究為我國具有自主知識產權中藥組分-雪上一枝蒿多糖XP-10治療肝癌轉移提供了一定科學基礎。