三七花治療阿爾茲海默病的網絡藥理學分析及分子對接

胡 靖，郭 琰，馬雅鴿，趙聲蘭

（云南中醫藥大學，云南 昆明 650500）

阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD），是一種中樞神經系統退行性疾病，臨床特征為學習記憶障礙和認知功能減退[1]。阿爾茨海默病是老年人最為常見的一種癡呆類型，也是老年人最常見的慢性疾病之一，因而，又被稱為老年癡呆。AD發病機制包括β淀粉樣蛋白的沉積[2]、tau蛋白異常過度磷酸化[3-4]、膽堿能損傷、興奮性氨基酸毒性和免疫炎癥反應等[5-7]。目前，有膽堿酯酶抑制劑以及非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑（美金剛），但仍無理想的臨床新型抗阿爾茨海默病藥物[8]。近年來的相關研究表明，傳統中藥三七（Notoginseng Flos）對治療阿爾茲海默病具有良好的療效。孫天賜等[9]基于系統生物學的角度對三七防治AD的作用機理進行研究；鐘振國等[10]以D-半乳糖腹腔注射致亞急性損傷合并鵝膏蕈氨酸損毀雙側大腦Meynert基底核建立AD大鼠動物模型，使用三七總皂苷進行治療，發現三七總皂苷對AD大鼠模型大腦膽堿能神經的病理損害具有保護作用；范亞軍等[11]利用蛋白磷酸酶抑制劑岡田酸（OA）模擬AD病細胞損傷模型，研究表明三七總皂苷對OA引起的神經細胞凋亡具有一定的保護作用。三七花是否具有治療阿爾茲海默病的效果，尚未見有報道，本文利用網絡藥理學及分子對接技術對三七花治療阿爾茲海默病的物質基礎以及潛在的作用機制進行探索和預測分析研究，以期為三七花防治老年癡呆提供理論依據。

1 數據來源及分析方法

1.1 三七花活性成分及作用靶點的收集 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine database and analysis platform，TCMSP），（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）輸入關鍵詞“三七花”檢索。口服生物利用度是藥物篩選的關鍵參數[12]，因為三七花在日常生活中大多以飲品來使用，故選擇口服生物利用度作為篩選關鍵參數，根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥15%進行篩選[13]，得到三七花的主要化學成分，并匹配相應的作用靶點。

1.2 疾病靶點收集 利用DisGeNET數據庫（疾病基因數據庫，http：//www.disgenet.org/） 和 GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/），以“Alzheimer's disease”為關鍵詞檢索阿爾茲海默病相關靶點，將2個數據庫的靶點進行歸并得到與阿爾茲海默病相關的基因和靶蛋白信息。

1.3 三七花化合物-靶點的網絡構建 將三七花活性成分對應的靶點和阿爾茲海默病相關的靶點進行比較，獲得二者共有的靶點，然后使用Cytoscape 8.0圖形化網絡分析和編輯軟件，進行“三七花活性化合物-疾病靶點”的網絡構建，網絡中的節點表示三七花活性成分、疾病相關靶點，網絡中的邊用來連接藥物與活性成分、活性成分與關鍵靶點，疾病與關鍵靶點；網絡中一個節點的度表示和節點相連的條數，度值越大說明這個節點越可能是關鍵節點[14]。

1.4 GO功能富集和KEGG信號通路分析 利用Metascape數據庫對三七花改善阿爾茲海默病的靶點進行GO功能富集和KEGG通路分析，將所交集后的基因靶點名輸入Multiple Gene List，上傳后選擇“H.sapiens”進行個性化分析，點擊Enrichment選擇通路進行分析。

1.5 蛋白互做網絡的構建 STRING是搜索已知蛋白和未知蛋白相互作用的數據庫，為了闡述三七花改善阿爾茲海默病的相互作用關系，將1.3得到三七花改善阿爾茲海默病靶點輸入STRING數據庫，物種選擇“human”，該數據庫可以對蛋白質的相互作用關系進行打分，分值越高表明相互作用的置信度越高[15]，本文將相互作用評分設置為中置信度（0.400），得到三七花改善阿爾茲海默病的相互作用關系圖（PPI）。

1.6 分子對接 為了確定網絡藥理學預測三七花改善記憶靶點的準確性，采用分子對接技術進行驗證。將蛋白互作網絡中評分較高的蛋白與KEGG結果中靠前的通路進行比較分析，得到準備驗證的關鍵靶點，將靶點輸入PDB數據庫，選擇最佳的蛋白晶體結構，并從PubChem數據庫中下載三七花化學成分2D結構式，通過chem3D軟件將其優化，將關鍵靶點的蛋白結構、三七花主要成分結構式導入到AutoDock－Tools在線平臺進行分子對接前處理，之后使用命令提示符進行對接，預測潛在蛋白質的結合位點，使用Vinascore軟件對其打分，查看其分子對接的親和力，用PyMOL軟件進行分子對接并作圖。

2 結果與分析

2.1 三七花活性成分及其潛在作用靶點篩選結果從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）通過OB≥15%篩選得到三七花化學成分共38種，其中血腦屏障透過率（BBB）較好的有beta-bourbonene（β-波旁烯）、alpha-cubebene（Alpha-蓽澄茄油烯）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）等成分。血腦屏障透過率較低的可通過修飾和劑型選擇加以提高。通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）得到上述已知三七花38種成分中有作用靶點的成分25個，使用uniprot數據庫匹配相應的作用靶點，得到64個作用靶點（見表1）。

2.2 疾病相關的靶點 利用DisGeNET數據庫，以“Alzheimer's disease”為關鍵詞檢索阿爾茲海默病相關靶點，獲取到已知與阿爾茲海默病相關的基因和靶蛋白信息123個。同時利用GeneCards數據庫，以“Alzheimer's disease”為關鍵詞檢索阿爾茲海默病相關靶點，以score大于1為條件篩選，獲取到已知與阿爾茲海默病相關的基因和靶蛋白信息有3 508個。

2.3 三七花活性成分作用靶點-疾病靶點的交集 將三七花活性成分對應的作用靶點和疾病相關的靶點進行交集，交集后的得到交集靶點34個（如表2所示）。

表2 三七花活性成分與老年癡呆疾病的交集靶點

2.4 三七花活性成分-疾病靶點網絡構建 構建“中藥化合物-疾病靶點”網絡[16]，如圖1。網絡中共有3部分內容，紅色為通過TCMSP數據庫篩選出來的活性成分25個，其中與疾病靶點相交的成分有23個；藍色為阿爾茲海默病；綠色為活性成分作用靶點與疾病相關靶點相交互的靶點34個，分別是CHRM1、CHRM2、PTGS2、ADRB2、SLC6A4、PTGS1、RELA、IL10、CALM1、MAOB、HTR3A、SLC6A2、ADRA1A、BAX、EIF6、TP53、CCNB1、RHOA、BCL2、SLC6A3、ADH1C、ADH1A、PIK3CG、HTR2A、OPRM1、TNF、CASP9、JUN、IL6、CASP8、PON1、CASP3、MAP2、BCHE。通過Cytoscape計算網絡參數，得到三七花活性成分和靶點作用關系[17]。三七花中化學成分按節點度值排序由高到低依次是 β-谷甾醇（19）、β-欖香烯（12）、β-石竹烯（9）、（-）-異香木蘭烯（8）、β-桂烯（8）、西多糖苷（7）、棕櫚酸甲酯（7）、β-波旁烯（6）、冰片（6）、β-立方體蛋白（5）、（1R，4aR，8aS）-1-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-2，3，4a，5，6，8a-六氫-1H-萘（5）、EEE（4）、蓽澄茄油烯（4）、糠醇（3）、T-依蘭油烯（3）、糠醛（3）、苯乙醛（3）、（1R）-（+）-樟腦（3）、α-古蕓烯（3）、正庚烷（2）、甲酸混酯（2）、辛酸乙酯（2）、甲酸丙酯（2）。這些化學成分被諸多學者認為可能是改善阿爾茲海默病的物質基礎。

圖1 三七花活性成分-疾病靶點網絡

同時節點度值較高的靶點是CHRM1（毒蕈堿乙酰膽堿受體M1）、CHRM2（毒蕈堿乙酰膽堿受體M2）、PTGS2（前列腺素 G/H 合成酶 2）、PTGS1（前列腺素G/H合成酶1）、ADH1C（醇類脫氫酶1C）等。詳細參數見圖2。

圖2 靶點節點度值

2.5 GO和KEGG富集分析 用Metascape數據庫對三七花改善阿爾茲海默病的靶點進行GO功能富集和 KEGG通路分析，得到圖3，GO分析得到的主要通路為對異物刺激的反應（response to xenobiotic stimulus）、細胞對有機環狀化合物的反應（cellular respose to organic cyclic compound）、對糖皮質激素的反應（response to glucocorticoid）、對無機物的反應（response to inorganic substance）、離子運輸的調節（regulation of ion transport）、調節神經元的凋亡過程（regulation of neuron apoptotic process）、膜筏（membrane raft）以及蛋白質磷酸化的正向調節（positive regulation of protein phosphorylation） 等；KEGG 富集主要通路為脂質和動脈硬化（lipid and atherosclerosis）、C型凝集素受體信號傳導途徑（C-type lectin receptor signaling pathway）、5-羥色胺突觸（serotonergic synapse）以及神經營養劑（neurotrophin signaling pathway）等。詳細參數見表3。

圖3 圖a為GO分析，圖b為KEGG富集分析

表3 GO分析與KEGG富集分析參數

2.6 PPI網絡的構建及核心基因分析 將三七花改善阿爾茲海默病的靶點輸入到String數據庫進行分析，獲得靶點蛋白相互作用關系網絡圖（見圖4），共有34個節點和132條相互作用連線，節點平均數為7.76。將圖導入Cytoscape，依據網絡節點度值排序，得到前五個關鍵靶點蛋白依次為IL6（白介素-6）、TNF（腫瘤壞死因子）、CASP3（鈣化酶-3）、TP53（細胞腫瘤抗原P53）、PTGS2（前列腺素G/H合成酶和環氧酶2）。由PPI圖4可知這些關系來自3大類：已知交互，預測的相互作用以及其它。已知交互多來自于數據庫和實驗證明，預測的相互作用來自基因共同產生，其他來自于文本挖掘。

圖4 三七花改善阿爾茲海默病靶蛋白互做（PPI）網絡圖

2.7 分子對接 蛋白互作網絡（PPI）中評分較高的蛋白可以認為起到重要作用，將評分較高的潛在蛋白相對應的靶點與KEGG通路分析結果進行比較分析，將三七花改善阿爾茲海默病的潛在靶點PTGS2（前列腺素G/H合酶2）和CHRM2（毒蕈堿乙酰膽堿受體M2）作為分子對接的對象，導入PDB數據庫，通過數據庫自帶排練方式，得分由高到低選擇，得到PTGS2、BCL2分辨率較高的蛋白結構5f19、5yc8。在“活性成分–疾病靶點”中選擇度值較高的三七花活性成分，西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（betasitosterol）作為對接分子，在AutoDockTools在線平臺處理配體和受體，并得到運行參數，通過命令提示符進行對接處理，得到Vinascore得分分別為-7.3和-7.7。之后在PyMOL軟件上將處理好的配體和受體對接，得到圖5。Vina是以相應的口袋參數對受體和配體進行分子對接所得到復合物的得分，這個值越低代表受體和配體親和力越高，對接結果越好。結果發現篩選得到的活性成分與預測的靶點均有結合。其中西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）與PTGS2、CHRM2靶點有較強的親和力。

圖5 活性成分與靶點蛋白的分子對接

3 討論

中醫是我國的國粹，老年人對中藥有較高的信任度，近年來關于中藥用于改善癡呆患者癥狀的研究日益增多，目前主要為活血化瘀、改善循環類藥物。中藥個體化方案靈活性高，患者依從性較好，但目前缺乏臨床隨機雙盲試驗，且樣本量較小，有不同程度的毒副作用，故中藥多為輔助用藥。喬森等[18]研究認為，血管相關病變是AD的重要原因，血瘀既是病理產物又是致病因素，從“瘀”進行治療，取得不錯的臨床效果。三七花性甘涼，具有清熱平肝、生津止渴、活血化瘀等功效，適用于頭暈、目眩、耳鳴等癥[19]。葉長青等[20]通過網絡藥理學及分子對接技術，發現西多糖苷（sitogluside）與靶點PTGS2結合較好，可能是治療AD的關鍵。同時大量網絡藥理學發現，β-谷甾醇[21-23]是治療AD的關鍵成分。

本研究采用網絡藥理學的方法，篩選出23個三七花活性成分交集到34個AD靶點，通過Cytoscape 8.0軟件構建“活性成分-靶點”關聯網絡，對關鍵靶點進行GO功能富集和KEGG通路分析表明，主要通過西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、β-欖香烯等活性成分調控 CHRM1、CHRM2、PTGS2等AD靶點。分子對接表明三七花的活性成分西多糖苷（sitogluside）[20]、β-谷甾醇（beta-sitosterol）[20-21]與老年癡呆的PTGS2、CHRM2等靶點有較強的結合，為三七花防治AD的提供了理論基礎。