氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷含量的不確定度評(píng)定*

曾永明，周靜萱，黃小芮，莫麗嚴(yán)，馮沁雄，欒 潔

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002)

板栗(學(xué)名：Castaneamollissima)，別名栗、栗子、風(fēng)臘，是山毛櫸科栗屬的植物，有7～9種。目前，我國大部分板栗果園還處于粗放經(jīng)營階段，農(nóng)藥的大量施用使環(huán)境受到污染。環(huán)境中的農(nóng)藥通過食物鏈傳遞并富集，進(jìn)入人體，長期食用農(nóng)殘超標(biāo)的食品將造成對(duì)人體健康的危害。因此，通過板栗中農(nóng)殘污染物的監(jiān)測，對(duì)推動(dòng)綠色種植板栗，保障板栗質(zhì)量安全，具有一定作用。

亞胺硫磷(phosemet)純品為白色無臭晶體，熔點(diǎn)72～72.7 ℃。工業(yè)品為白色或淺褐色晶體，熔點(diǎn)59～63 ℃，具有特殊刺激性臭味。20世紀(jì)70-80年代迅速發(fā)展起來的有機(jī)磷類殺蟲劑，化學(xué)名稱為O，O-二甲基-S-(酞酰亞胺基甲基)二硫代磷酸酯，化學(xué)式為C11H12NO4PS2，在世界各國廣泛使用。在食品安全監(jiān)測工作中，能夠準(zhǔn)確的測量農(nóng)產(chǎn)品中亞胺硫磷含量，對(duì)維護(hù)食品安全具有重要意義。因此，目前需要依靠第三方檢測機(jī)構(gòu)的測量結(jié)果的準(zhǔn)確性來幫助維護(hù)食品安全工作，而測量過程中人為操作因素、環(huán)境因素、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和儀器設(shè)備等方面都會(huì)對(duì)結(jié)果的不確定度造成影響[1-2]，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留量的測量結(jié)果不準(zhǔn)確。為了提高測量結(jié)果的可靠性，找出影響測量結(jié)果的最主要因素，本文參照J(rèn)JF 1059.1-2012《測量不確定度評(píng)定與表示》[3]，采用氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷的含量，通過評(píng)定不確定度的方式對(duì)測量過程中可能造成誤差的操作均進(jìn)行測算，確定了影響測量結(jié)果的最主要因素以改進(jìn)農(nóng)殘測量的精準(zhǔn)性，對(duì)保障板栗質(zhì)量安全，具有一定作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1)儀器設(shè)備：MS 3 basis旋渦混合器(IKA儀器有限公司)；離心機(jī)TD5A-WS(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；M32自動(dòng)高通量平行濃縮儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；GC-2010Plus氣相色譜儀(日本島津公司)，配備火焰光度檢測器(FPD)，色譜柱：SH-Rtx-1701(30 m×0.25 mm×0.25 μm 毛細(xì)色譜柱)。

2)測量儀器：電子天平，最大允許誤差為 ±0.5 mg；瓶口分液器，最大允許誤差為0.03%；10 mL 移液管，精度 0.02 mL；0.1～1 mL 移液槍，誤差范圍為±1%；20～200 μL 移液槍，誤差范圍為±1%；10 mL 容量瓶，精度 0.10 mL；FPD檢測器的定量允差1.9%等。

3)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：亞胺硫磷，購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科學(xué)監(jiān)測研究所，質(zhì)量濃度為 100 μg/mL，不確定度U=±3%(k=2)。

4)化學(xué)試劑：乙腈(色譜純，上海安譜公司)；丙酮(色譜純，上海安譜公司)；氯化鈉(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；二級(jí)水(自制)。

5)耗材：13 mm×0.2 μm 有機(jī)濾膜(上海安譜公司)。

6)測定樣品：板栗粉，來自國家林業(yè)和草原局科技司組織的能力驗(yàn)證機(jī)構(gòu)。

1.2 方法

1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置：從冰箱取出質(zhì)量濃度為 100 μg/mL 的亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，放在室溫為 25 ℃ 的實(shí)驗(yàn)室回溫 4 h 后，用20～200 μL 移液槍移取 100 μL 亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液于 5 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為 2 μg/mL 的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液(此工作標(biāo)準(zhǔn)溶液保存在 4 ℃ 冰箱中，有效期一周)。檢測時(shí)通過稀釋在室溫為 25 ℃ 的實(shí)驗(yàn)室回溫 4 h 后工作標(biāo)準(zhǔn)溶液得到0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 μg/mL 共5個(gè)梯度質(zhì)量濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用GC-2010Plus氣相色譜儀進(jìn)行亞胺硫磷含量測定，每一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液分別進(jìn)樣3次，得到相應(yīng)的色譜峰面積，用最小二乘法擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

2)供試品溶液的制備：本次實(shí)驗(yàn)的樣品為已粉碎的板栗樣品，并由國家林草局組織的能力驗(yàn)證機(jī)構(gòu)加入亞胺硫磷農(nóng)藥。

準(zhǔn)確稱取板栗樣品和空白樣品各 2 g(精確到 0.01 g)于 50 mL 離心管中，加入 5 mL 蒸餾水渦旋 1 min 復(fù)原至板栗鮮樣狀態(tài)，靜止 30 min 使板栗充分浸潤，然后加入 20 mL 的乙腈和3～5 g 氯化鈉，用渦旋混合器進(jìn)行渦旋 2 min，采用TD5A-WS離心機(jī) 4000 r/min 離心 5 min。用 10 mL 移液管吸取 10 mL 上層乙腈溶液到 15 mL 離心管中，調(diào)節(jié)M32自動(dòng)高通量平行濃縮儀水浴溫度不大于 40 ℃，氮?dú)饬髁繛?40 kPa 吹至近干，加入 1 mL 丙酮，在渦旋混合器渦旋 1 min，過 0.2 μm 有機(jī)濾膜，裝瓶上機(jī)測定。

3)氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱：SH-Rtx-1701 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；設(shè)定升溫程序如下：初始溫度 200 ℃，以 5 ℃/min 速度升至 220 ℃，不保持，再以 40 ℃/min 升至 280 ℃，保持 6 min；進(jìn)樣體積：1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；不分流進(jìn)樣；FPD檢測器溫度：280 ℃，氫氣流量：62.5 mL/min，空氣流量：90 mL/min；氮?dú)饬髁浚?0 mL/min；柱流量：2 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

分別稱取10組試樣，進(jìn)行平行試驗(yàn)，外標(biāo)法定性和定量，試樣中農(nóng)藥殘留量計(jì)算公式如下：

(1)

式中：w為試樣中農(nóng)藥殘留量質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥的質(zhì)量濃度，mg/L；A為樣品溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；As為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；V1為提取溶劑總體積，mL；V2為吸取出用于檢測的提取溶液的體積，mL；V3為樣品溶液定容體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

2.2 測定不確定度分量來源分析

根據(jù)測量過程和公式(1)，板栗中亞胺硫磷含量測定不確定度的來源如下：

1)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)引入的不確定度U1，rel，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度U1，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋過程中移液器引入的不確定度U2，容量瓶容量引入的不確定度U3，定容時(shí)人為讀數(shù)誤差引入的不確定度U4，定容時(shí)溫度變化引入的不確定度U5[4-7]；

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度U2，rel[8]；

3)稱樣時(shí)電子天平引入的不確定度U3，rel；

4)添加萃取溶劑時(shí)瓶口分液器引入的不確定度U4，rel；

5)移取萃取溶液時(shí) 10 mL 刻度吸管引入的不確定度U5，rel；

6)樣品定容時(shí) 1 mL 移液槍引入的不確定度U6，rel；

7)氣相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣引入的不確定度U7，rel；

8)FPD檢測器響應(yīng)值引入的不確定度U8，rel；

9)重復(fù)測量的相對(duì)不確定度U9，rel(A類)。

試驗(yàn)所用試劑均為色譜純，因而空白樣品測定所致的測定不確定度影響很小，可忽略不計(jì)。

2.3 各不確定度的評(píng)定

2.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)引入的不確定度U1，rel

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度U1[9-10]

2)標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過程中移液槍引入的不確定度U2

3)標(biāo)準(zhǔn)溶液定容過程中容量瓶容量引入的不確定度U3

4)定容時(shí)讀數(shù)誤差引入的相對(duì)不確定度U4

定容時(shí)人為讀數(shù)誤差引入的不確定度可根據(jù)重復(fù)讀取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。表1為 10 mL 容量瓶重復(fù)6次定容實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)計(jì)算得：

(2)

表1 10 mL容量瓶重復(fù)定容實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5)定容時(shí)溫度引起體積變化引入的不確定度U5

擬合以上5項(xiàng)得出配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)引入的不確定度為：

=0.0074

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度U2，rel

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過初篩，確定配置5個(gè)梯度質(zhì)量濃度點(diǎn)的亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 μg/mL。采用GC-2010Plus氣相色譜儀進(jìn)行亞胺硫磷含量測定，每一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣3次，得到相應(yīng)的色譜峰面積[2](n=15，詳見表2)。

用最小二乘法擬合得到線性回歸方程為Y=380335.51015x-3192.569488，r2=0.999[10-11]。同時(shí)對(duì)板栗樣品溶液中亞胺硫磷的濃度重復(fù)測定3次，由線性回歸方程計(jì)算得樣品溶液的質(zhì)量濃度分別為0.13、0.14、0.14 mg/kg，平均值為 0.14 mg/kg，則用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液濃度引入的相對(duì)不確定度按式 (3)計(jì)算：

(3)

U2，rel=0.024

2.3.3 樣品稱量時(shí)天平引入的相對(duì)不確定度U3，rel

2.3.4 添加萃取溶劑時(shí)瓶口分液器引入的不確定度U4，rel

2.3.5 移取萃取溶液時(shí) 10 mL 刻度吸管引入的不確定度U5，rel

1)移液管體積刻度的不確定度

2)液體充滿至移液管刻度線的估讀誤差

3)溫度變化引入體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成以上3項(xiàng)得出 10 mL 分刻度吸管不確定度為：

2.3.6 樣品定容時(shí) 1 mL 移液槍引入的不確定度U6，rel

2.3.7 氣相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣引入的不確定度U8，rel

2.3.8 FPD檢測器響應(yīng)值引入的不確定度U8，rel

氣相色譜儀靈敏度較高，故儀器穩(wěn)定性及測定值分散性是FPD檢測器測量不確定度的主要來源。采用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液連續(xù)測定8次，測得質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)見表3，以質(zhì)量濃度值的分散性計(jì)算相對(duì)不確定度：

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(4)

2.3.9 重復(fù)測量的相對(duì)不確定度U9，rel(A類)

測量板栗樣品中亞胺硫磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，共進(jìn)行了10次平行試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 平行試驗(yàn)結(jié)果值

U9=S(c)=0.0067 mg/kg

3 不確定度的合成與擴(kuò)展

3.1 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量來源、量值、貢獻(xiàn)率見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總

利用U1，rel～U10，rel不確定度分量結(jié)算結(jié)果計(jì)算合成相對(duì)不確定度[16]，得：

本實(shí)驗(yàn)測得板栗樣品中亞胺硫磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.14 mg/kg，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Uc(rel)=Urel×x=0.054×0.14 mg/kg=0.0076 mg/kg

由表5可知，測量板栗中亞胺硫磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)過程中，不確定度的來源影響大小為重復(fù)測量>標(biāo)準(zhǔn)工作曲線>標(biāo)準(zhǔn)溶液配置>FPD檢測器 >10 mL 分刻度吸管。其中，重復(fù)測量、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、標(biāo)準(zhǔn)溶液配置、FPD檢測器和 10 mL 分刻度吸管引入的不確定度較大，貢獻(xiàn)率達(dá)54.70%、27.35%、8.43%、5.24和3.53%。

3.2 擴(kuò)展不確定度

取95%的置信概率，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度U(x)=k×Uc(rel)=0.015 mg/kg，因此，采用氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，當(dāng)測量的數(shù)據(jù)為 0.14 mg/kg 時(shí)，測量的結(jié)果表示為(0.14±0.015)mg/kg，k=2。

4 結(jié)論與討論

4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用

檢驗(yàn)用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確性直接影響到定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源性至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用有證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本試驗(yàn)為農(nóng)藥殘留的能力驗(yàn)證活動(dòng)，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)溶液的要求相對(duì)來說是比較高的，具體有以下幾個(gè)方面：一是農(nóng)殘標(biāo)液應(yīng)該購買新生產(chǎn)的標(biāo)液，因?yàn)檗r(nóng)藥具有不穩(wěn)定性、在光、熱影響下容易發(fā)生分解及轉(zhuǎn)化；二是農(nóng)殘標(biāo)液應(yīng)在符合標(biāo)液證書的保存條件下進(jìn)行保存；三是農(nóng)殘的標(biāo)液不確定度相對(duì)來說比較大。因此最好采用液標(biāo)和固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制溶液進(jìn)行比較，以確保其可靠性；四是配制農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)要注意介質(zhì)的使用。根據(jù)母液與農(nóng)藥的溶解性、樣品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法中的提取液及定容上機(jī)的溶劑來進(jìn)行選擇。

4.2 樣品的保存和前處理

一是農(nóng)藥殘留量本身含量比較低，而且農(nóng)藥具有不穩(wěn)定的特性，因此實(shí)驗(yàn)室在接到樣品后應(yīng)立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，無法馬上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的應(yīng)將樣品處于(0～4)℃冷藏箱中避光保存；二是由于樣品是經(jīng)過冷藏的，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前最好將樣品放置至室溫后再進(jìn)行稱樣，否則易吸收空氣中的水分造成稱量誤差；三是樣品的前處理要根據(jù)檢驗(yàn)方法選擇合適的有機(jī)溶劑，提取方式、時(shí)間應(yīng)按照檢驗(yàn)方法的要求嚴(yán)格進(jìn)行，否則會(huì)出現(xiàn)提取不完全的情況；四是由于板栗樣品中的成分比較復(fù)雜、樣品中的色素及脂類成分都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以最好對(duì)提取液進(jìn)行有效的凈化處理，而且要進(jìn)行多次洗脫，使目標(biāo)組分全部轉(zhuǎn)移到提取溶液中，避免組分的損失。

4.3 儀器設(shè)備

一是農(nóng)殘分析對(duì)于儀器的要求比較高，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)該對(duì)儀器的進(jìn)樣針、氣路、色譜柱、檢測器等進(jìn)行清洗及凈化，使樣品分析過程中不受污染。二是分析檢測時(shí)分析儀器要確保處于穩(wěn)定狀態(tài)，參數(shù)設(shè)置及分析條件優(yōu)化到最佳狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所用儀器型號(hào)將儀器調(diào)整至最佳狀態(tài)。三是為了避免系統(tǒng)誤差，條件允許的情況下，可以用多臺(tái)儀器進(jìn)行結(jié)果比較，而且要注意進(jìn)樣過程中試劑的揮發(fā)對(duì)結(jié)果造成的影響。

4.4 檢驗(yàn)人員

一是檢驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)熟悉檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)，掌握檢測方法基本原理，實(shí)驗(yàn)過程要求做到操作規(guī)范、熟練嚴(yán)格按檢測方法的要求對(duì)樣品中的目標(biāo)組分進(jìn)行檢測；二是檢驗(yàn)人員應(yīng)熟知保證結(jié)果準(zhǔn)確性的驗(yàn)證方法，比如通過進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，將加標(biāo)實(shí)際結(jié)果與理論結(jié)果相比較，如果出現(xiàn)回收率過高或過低的情況應(yīng)及時(shí)進(jìn)行原因分析并糾正；三是檢測人員應(yīng)考慮農(nóng)殘的檢測中各種因素的影響，比如樣品中的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)農(nóng)殘結(jié)果影響是很大的。因此應(yīng)該通過基質(zhì)曲線加標(biāo)的方式將這個(gè)影響降低到最小。

因此，用氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷農(nóng)藥過程中應(yīng)選用有證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，精度較好的量器，規(guī)范移液管和容量瓶的操作，確保配置標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的準(zhǔn)確性；選擇擬合線性高的工作曲線進(jìn)行校準(zhǔn)；規(guī)范樣品的保存和前處理步驟；對(duì)分析儀器進(jìn)行日常維護(hù)和按時(shí)檢定；加強(qiáng)檢驗(yàn)人員的檢測技術(shù)培訓(xùn)，適當(dāng)增加平行樣來降低不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本試驗(yàn)采用氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷濃度，測量不確定度主要來源于重復(fù)測量、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、標(biāo)準(zhǔn)溶液配置、FPD檢測器和 10 mL 分刻度吸管，貢獻(xiàn)率分別為54.70%、27.35%、8.43%、5.24和3.53%，其中重復(fù)測量引入的不確定對(duì)測量結(jié)果的影響最大。