鈦表面時間相關性老化及生物活性再激活的研究進展

楊凱 李瀟

在現代種植系統中，鈦及鈦合金由于良好的耐腐蝕性、抗疲勞強度以及較低的彈性模量已被廣泛應用于口腔種植修復及重建[1]。此外鈦表面還能進行各種處理，如酸蝕噴砂、陽極氧化等；負載表面涂層如功能肽、羥基磷灰石及其他鈣磷化合物涂層等可進一步促進種植體的骨結合作用[2]。盡管如此，鈦牙種植體的5 年成功率仍然只有90.1%～96.5%[3]。制約種植體成功率無法達到100%的因素不僅有材料性能的限制，時間也是一個重要因素。在新鈦表面，生物活性會隨著時間的推移而降低，這種與時間相關的生物性能衰退稱為鈦的時間相關性老化（Time-dependent degradation）[4]。由于種植體從生產到臨床植入存在存儲運輸的時間，那么延緩甚至提升因老化而降低的生物活性是非常有必要的。故本研究圍繞可能導致生物老化現象的物理化學性質、預防措施進行綜述，希望對理解這種現象并進一步改善種植體表面生物活性提供不一樣的角度。

1 鈦金屬的時間相關性老化

鈦的時間相關性老化指鈦金屬及鈦合金表面隨著時間的推移，逐漸發生表面物理化學性質的變化，包括親水性下降、碳氫化合物的吸附、電荷狀態的改變等[5，6]，進而導致其生物學性能下降。有研究表明，4 周老化后的鈦片表面成骨細胞行為和反應以及早期骨結合強度均下降一半以上[6～8]，而這些細胞行為與反應和老化鈦片表面的物理化學性質的改變關系密切。

親水性作為材料表面的代表標志物，吸引血液為種植體愈合提供營養和氧氣，對種植體早期骨形成、穩定性、周圍骨再生和軟組織愈合都有一定積極作用[9]。許多研究證明，鈦表面老化最明顯的特征是表面親水性的下降，剛制備出的鈦片表面水接觸角（Contact angle，CA）＜5°，而在4 周后往往超過60°[5，6，10]。

細胞粘附水平還跟鈦表面碳百分比緊密相關[11]。空氣中儲存的鈦金屬表面會不斷地從大氣、水和清潔溶液中吸附有機雜質，例如碳氫化合物。表面能相對高的新鈦表面不僅吸引水分子還容易吸附相對低能的碳氫化合物[12]，從而轉變成低能表面并降低親水性。鈦片在空氣中儲存4 周后碳含量上升至60%左右[7]，而市場上無菌包裝的鈦種植體表面碳含量為32%～52%[13]。

在4 周老化的鈦片表面的蛋白質吸附量相較于新制備表面顯著下降[5]。蛋白質可以通過Arg-Gly-Asp（RGD）氨基酸序列選擇性識別將細胞吸附在鈦表面，進而增加細胞黏附，材料表面電荷狀態可以決定蛋白質吸附能力，研究證明老化后的鈦表面呈現負電[6]，在生理pH 值下人血清白蛋白也帶負電，同性相斥導致白蛋白難以黏附在鈦表面。

目前醫用植入物的生產、銷售和儲存還沒有公認標準，這種老化現象也沒有引起臨床醫生的足夠重視，但時間導致的生物活性衰退是確實存在的，如何預防這種老化現象無疑是一個值得我們重視的問題。

2 表面處理

由于老化現象貫穿種植體生產、儲存、運輸的整個過程，在不同階段可以采取不同的預防措施來減小甚至抵消老化帶來的生物活性下降。在種植體生產時一般會進行各種表面處理或負載表面涂層，來改善種植體的骨結合作用，同理可通過改性和涂層等方法隔絕空氣污染來使種植體保持長期親水性。

2.1 表面改性在陽極氧化中，非晶銳鈦礦不斷生成的同時產生中間產物活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），如羥基自由基及親水性COO-和OH-氧化產物，這有利于保持鈦表面親水性[14]。Shibata 等[15]發現陽極氧化鈦片即使在4 周后都有較低的水接觸角（＜5°）以及較高水平的細胞黏附和成骨基因表達。

2.2 表面涂層4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）是一種非揮發性的兩性離子緩沖劑，主要用于細胞培養試劑和儲存生物分子和細胞[16]。Suzuki 等[17]認為HEPES 可以將鈦與空氣隔絕，免受來自大氣的碳氫化合物污染。于是他們將pH 為7.4 的HEPES緩沖液涂覆在鈦片表面并在黑暗中存儲，發現在3個月后HEPES 涂層鈦片表面依然表現為超親水性，同時表現出與新鈦表面相當的體外生物活性和體內骨結合能力。但是HEPES 作為一種化學制劑，尚不清楚在臨床植入后對成骨細胞的長期活性是否存在不利影響。

Morra 等[18]發現在種植體表面嫁接親水性分子也能賦予種植體良好的親水性，有透明質酸納米分子層的種植體表面即使在儲存1 年后仍能促進種植體表面良好的血液攀附。具有透明質酸的表面納米層的新型牙科種植體已經過臨床檢驗，證明透明質酸表面分子層種植體與傳統商用種植體的臨床療效無明顯差別[19]。

3 儲存介質

傳統商用種植體在生產滅菌后常封裝入常溫常壓的無菌空氣包裝中，雖然能隔絕微生物的污染，但對避免空氣中碳氫化合物的污染無能為力，也無法阻止親水性的下降，于是可以在儲存時通過將空氣與鈦表面有效隔開以延緩老化的速度。

3.1 真空包裝Kamo 等[20]將堿熱處理鈦片封裝入＜50kPa 的鋁真空袋中，即使在52 周后鈦片仍保持高親水性（CA＞10°），其表面蛋白質吸附力和磷灰石形成能力也沒有受到時間的影響。而Choi 等[21]將紫外線處理15min 的鈦片封入＜32kPa 的低真空無菌干燥器中，發現在28 天后鈦片表面蛋白質粘附能力依然保持，但細胞粘附與伸展面積等細胞行為和儲存在空氣中的鈦片相比沒有明顯差異。盡管儲存在真空中阻隔空氣污染效果十分顯著，但親水性以及殘留生物效應相較于水溶液儲存更低[21]。

3.2 水溶液儲存Ghassemi 等[22]將鈦片裝入0.9%NaCl 中6 周后發現除了成骨分化性能，其細胞附著能力和伸展面積都沒有得到增強。他們認為這與殘留在種植體表面的Na 和Cl 元素有關，這些無機元素會影響諸如細胞附著和增殖之類的細胞行為。純水（dH2O）和生理鹽水同為水溶液儲存方法，不僅防止大氣中碳氫污染以保持親水性，還排除了其他異質離子如Na+和Cl-的影響。Shen 等[23]發現儲存在dH2O 中的鈦片要比儲存在空氣中的鈦片保持有更高的細胞附著、增殖能力。Choi 等[24，25]發現dH2O 儲存后的鈦片表面的細胞附著能力和伸展面積等細胞行為都沒有因時間的流逝而有所損失。盡管如此水溶液儲存并不能完全防止而只能延緩碳沉積[22]，于是“預防”后還需進一步搭配“清除”才更能有效減少表面碳污染。

4 椅旁處理

臨床上一般將種植體從無菌包裝中取出后直接植入患者口腔內，而種植體在經過存儲運輸后的表面性能會有所下降，鈦的表面性能存在不同程度衰退，導致鈦種植體與骨的結合能力下降，因此，如何簡單快捷地在椅旁重新激活鈦表面的理化性能及生物活性具有重要的臨床意義。

4.1 紫外光照射（Ultraviolet treatment）鈦表面進行紫外光照射已被證明可以顯著加速并增強鈦植入物的骨傳導能力[24]，在不改變鈦表面形貌的同時與粗糙表面有協同促進成骨作用[25]。回顧性臨床研究也證明紫外線處理可以減少早期種植體的失敗，在大約2.5 年的功能負荷期間，光功能化種植體的成功率為97.6%[26]。Iwasa 等[27]對黑暗中儲存4周后的酸蝕鈦片表面進行48h 的照射，發現紫外線處理后鈦表面帶正電，從而增強蛋白質附著和細胞粘附。Guo 等[28]則發現紫外線處理能夠增強人牙髓干細胞在4 周老化鈦表面的附著能力和成骨活性。UV 處理與dH2O 儲存在對抗老化方面還具有協同效應，Shen 等[23]將dH2O 中儲存4 周的鈦片進行UV 處理，發現鈦片表面由于dH2O 儲存而得到增強的生物性能可以通過UV 處理得到進一步提高。

關于處理時間，在1min 到16min 的尺度中，12min 紫外線處理[強度為0.15mW/cm2（λ=253.7nm）]可能是一個比較合適的時間[29]。而另一項研究證明要想恢復表面親水性和碳氫化合物的去除至少需要紫外線處理15min[3.5mW/cm2（λ=250nm）][30]。處理時間可能會因為設備條件、表面改性以及細胞種類的不同而變化，仍需要規范統一進行后續研究以確定最佳的處理時間。紫外線輻射對高度聚合的化合物沒有滲透性，因為它的波長相對較長，即最小為250nm。為了達到紫外線光功能化的目的，臨床醫生必須從塑料容器中取出植入物并對其進行至少15min 的紫外線照射，但這將面臨植入物被污染的風險。

4.2 非熱大氣壓等離子體（Nonthermal atmospheric pressure plasma，NTAPP）等離子體被稱為物質的第四態，是氣體分子被電場電離而產生的。NTAPP 也稱低溫大氣壓等離子體，氣體的表觀溫度通常比傳統等離子體低得多，甚至低至室溫，使得產生的化學反應可以在椅旁進行。NTAPP 能夠將多種官能團連接到材料表面，從而增強表面親水性以及細胞相容性[31]。Wang 等[28]以及Lei 等[32]使用低溫氬氧等離子體處理老化的鈦片，處理后的鈦片表面呈現更高的親水性以及更低的碳原子比例，老化鈦表面的細胞附著、增殖以及礦化都得到了增強。然而從經濟和臨床的角度來看可能需要用到更便宜且臨床上容易獲取的氣體，大多數牙椅都有內置的空氣壓縮機，所以空氣是更為理想的選擇。Choi 等[24]使用基于空氣的NTAPP 對鈦片處理10min 并儲存28d 后評估其生物性能隨時間的變化情況，發現基于空氣的NTAPP 處理同樣能夠增強鈦片上的蛋白吸附、成骨細胞附著和骨架發育。有研究證明NTAPP 的最佳處理時間是相對較短的1min[29]，較短的處理時間意味著較低的污染風險，這使得NTAPP 在椅旁處理方面有著巨大的應用潛力。

4.3 伽馬（γ）射線（Gamma ray）與紫外線類似，γ 射線能夠清除鈦表面的有機分子，同時在輻射中會產生自由基并提升親水性[33]。作為高能射線，γ 射線相比于紫外線以及等離子體最大的優勢在于它的高穿透性[34]，即使在密封包裝里依然可以穿透種植體產品，不需要破壞種植體密封包裝，這有利于保持種植體在植入前的無菌狀態。Ueno 等[35]對4 周老化的鈦片進行γ 射線處理（30kGy），其表面恢復了親水性并降低了碳原子含量，對蛋白質和細胞擁有高親和力并提高了骨結合強度。在劑量選擇上，由于醫療器械的γ 射線輻照劑量普遍為25～35kGy，并且在30kGy 和100kGy 劑量下的γ 射線處理后碳原子大致相同，所以選擇30kGy 可能是比較合適的輻照劑量[35]。γ 射線在克服生物老化上有其獨特的優勢，即高穿透性以及同樣優秀的生物活性誘導能力。但由于γ 射線對人體有較大損傷，這是將其應用于椅旁即刻處理的最大限制。

5 結語

鈦基種植體在制造完成后其表面的生物活性會隨著時間逐漸減弱，對于種植術后成功率有一定影響。而其生物活性主要受到親水性下降、碳氫化合物污染等因素的影響，在種植體生產到臨床植入之間采取隔絕或清除污染的預防措施以保持其表面活性：①種植體生產時表面涂敷生物相容性液體或親水性物質來隔絕大氣污染；②運輸存儲過程中進行碳隔絕性儲存如真空包裝或純水存儲等；③臨床植入前進行椅旁操作如紫外線、等離子體、伽馬射線照射等處理。臨床上通常是把種植體從無菌包裝中取出后直接植入患者口腔內，而不會進行其他的椅旁措施，雖然可以很好地保證無菌植入，但同時也錯失了提升種植體生物活性的最后機會。隨著椅旁措施的處理時間越來越短，臨床醫生可以結合患者意愿、全身健康狀況、口腔健康習慣以及口腔檢查與輔助檢查結果等具體情況適當選擇椅旁處理方案。