SIX2在骨肉瘤組織中表達及其對細胞血管生成與阿霉素耐藥逆轉的影響*

王熠欣 張世才 黃海燕 陳晨 張斯 劉穎 王有南

(華北醫療健康集團峰峰總醫院,河北 邯鄲 056201)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是侵襲力極強的惡性腫瘤之一,目前臨床上OS患者5年內的生存率不足20%[1-2]。臨床治療骨肉瘤時化療雖能提高骨肉瘤患者生存率,且5年內患者存活率高達80%,但大部分患者仍出現骨肉瘤復發[3]。在臨床上阿霉素(Doxorubicin,Dox)是化療常用的藥物,其可發揮對腫瘤細胞的殺傷作用起到治療腫瘤的作用[4-5]。有學者研究證實患者長期使用阿霉素治療會出現耐藥性,具有高轉移和高復發的風險[6]。因此探究骨肉瘤的耐藥機制,并尋找新的治療骨肉瘤的方法是十分必要的。同源異性蛋白家族SIX屬于轉錄因子中的一種,介導腫瘤的多種生物學活性[7]。目前,SIX家族中研究最多的成員為SIX1,與胃癌、胰腺癌、結腸癌等腫瘤密切相關,尤其在乳腺癌中SIX1能通過介導糖酵解基因的表達促進腫瘤生長[8]。且有研究證實,通過降低骨肉瘤細胞中SIX1高表達可有效調控其生活學活性,SIX2與SIX1為同一家族轉錄因子,相似度極高[9]。但目前對SIX2在腫瘤中的研究較少,且其對骨肉瘤細胞的生物活性尚不明確。因此,本研究探討骨肉瘤組織中SIX2的表達及其對骨肉瘤細胞血管生成及阿霉素耐藥的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年3月—2021年12月我院行骨肉瘤手術切除的105例患者的組織標本,將新鮮的骨肉瘤組織和癌旁組織標本存于-80℃的冰箱中。選擇病理學診斷為骨肉瘤的患者,且患者未經過任何治療。骨肉瘤患者組織標本中,男性51例,女性54例;患者年齡10～45歲。

1.2 細胞系、試劑與儀器 人骨肉瘤細胞系MG-63購自中國醫學科學院基礎學細胞中心,人臍靜脈內皮細胞(HUVCEs)購自陸軍軍醫大學第二附屬醫院病理科實驗室。干擾SIX2表達的特異性siRNA(si-SIX2)質粒,合成的非特異性RNA(si-NC)質粒、LipofectamineTM2000(上海吉瑪制藥技術有限公司),注射用阿霉素(北京百奧萊博科技有限公司),DMEM高糖培養基、青霉素-鏈霉素(雙抗)(美國Gibco公司),TRIzol、MTT試劑盒(美國Sigma公司),高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)。

1.3 免疫組化染色觀察骨肉瘤組織及癌旁正常組織SIX2的染色情況 將骨肉瘤組織及癌旁正常組織標本固定于10%福爾馬林溶液中,包埋組織并切成5 μm組織切片,烤箱烘干。用檸檬酸緩沖液浸泡組織薄片,修復組織3 min后孵育,15 min后將組織薄片用BSA封閉1 h,加入一抗SIX2和CD31即用型,4 ℃繼續孵育組織過夜;后將二抗加入到組織中,孵育20 min后用DAB顯色液顯色組織,用蘇木素充分染色組織,封片后于顯光鏡下觀察組織薄片變化。根據半定量積分法[10]對陽性結果判定:首先將骨肉瘤組織切片置于顯微鏡下觀察,分別計算陽性細胞數量及細胞總數量,并計算二者間比值。總分數=陽性細胞數占細胞總數比評分和染色強度評分的乘積(表1)。MVD計數:本實驗根據文獻[11]中Weidner法計數MVD,選標本中3個微血管富集區域,用顯微鏡觀察標本中微血管的數量,MVD值為平均值。

表1 分數評分表

1.4 RT-PCR檢測SIX2基因表達水平 將凍存于-80 ℃冰箱中的骨肉瘤組織標本和癌旁組織標本取出,各100 mg。將組織標本充分剪碎,于冰上裂解組織并提取RNA。根據試劑盒中的反轉錄法操作,得到cDNA模板后進行熒光反應實驗,內參為GAPDH。在95 ℃ 3 min,95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s的反應條件下,對SIX2基因進行擴增。2-△△CT法計算組織匯總SIX2表達。引物序列見表2。

表2 引物序列表

1.5 細胞培養 復蘇MG-63和HUVECs細胞,均接種于6孔板中,分別加入含雙抗的DMEM培養基和ECM培養基,均培養于37 ℃、5%CO2的培養箱中。

1.6 阿霉素耐藥細胞株建立 將處于對數期的MG-63細胞培養于培養基中,先在培養基中加入0.1 μg/mL的阿霉素48 h,棄掉培養基繼續培養細胞于不含阿霉素的培養基中,細胞傳代后,將MG-63細胞培養于含濃度為0.2 μg/mL的阿霉素培養基中48 h;根據以上方法逐漸增加阿霉素濃度,直至阿霉素濃度為5 μg/mL時MG-63細胞穩定生長停止誘導,得到的細胞即為骨肉瘤阿霉素耐藥細胞株MG-63/R。

1.7 細胞轉染和分組 胰蛋白酶消化骨肉瘤細胞株MG-63和阿霉素耐藥細胞株MG-63/R,培養細胞于6孔板中24 h,當細胞融合度為80%以上時加入無血清的培養基終止消化,根據轉染試劑轉染并分組。將MG-63細胞分為MG-63組(不轉染任何質粒)、si-NC A組(MG-63細胞中轉染si-NC空病毒載體)、si-SIX2 A組(MG-63細胞中轉染si-SIX2慢病毒)。將MG-63/R細胞分為MG-63/R組(不轉染任何質粒)、si-NC B組(MG-63/R細胞中轉染siRNA-NC空病毒載體)、si-SIX2 B組(MG-63/R細胞中轉染siRNA-SIX2慢病毒)。培養各組細胞24 h后用于實驗。

1.8 MG-63細胞條件培養基的制備 取處于對數期的MG-63細胞,消化細胞為懸液,將細胞懸液接種于含DMEM培養基中的6孔板內,孵育細胞懸液24 h,在孔板的每孔中分別加入不含血清的DMEM培養基,培養48 h后收集培養液,離心機離心后沉淀,收集上清液即為培養基,于-20 ℃冰箱保存。

1.9 HUVCEs小管形成試驗 在96孔板內培養細胞,在孔板內加入Matrigel基質膠和無血清DMEN培養基,充分混勻后孵育培養板30 min,待基質膠成半固體且基質膠表面無殘留的液體。在交替凝固時,取出HUVECs細胞并消化,加入1.8中各組培養基,按照1∶1的比例和內皮細胞充分混合至培養液,重懸后加入到孔板中的每孔中,8 h后用顯微鏡觀察小管的形成能力。

1.10 MTT檢測MG-63/R細胞耐藥敏感性 取各組MG-63/R細胞接種于96孔板中,培養貼壁,加入終濃度為5 μg/mL的阿霉培養48 h,在孔板內加入MTT溶液,孵育細胞4 h,將孔板內MTT溶液替換成DMSO溶液,檢測各孔吸光度值(OD),并計算IC50和耐藥逆轉倍數(FR)。

1.11 克隆實驗檢測細胞增殖 取各組MG-63/R細胞,消化細胞并培養于常規培養箱。梯度稀釋懸液,在恒溫的培養皿中降細胞懸液稀釋,孵育懸液14 d,后結晶紫染色細胞。洗滌后將培養皿倒置并覆蓋在透明網格上,在顯微鏡下(低倍率)計數大于10個細胞的克隆,后計算集落形成率。

1.12 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力 消化各組MG-63/R細胞至懸液。取Transwell小室,在上室中加入懸液300 μL,下室加入含血清培養基,孵育小室24 h。將小室取出置于甲醛中,25 min后加入結晶紫,讓細胞均勻染色。用顯微鏡觀察細胞穿模數量。

1.13 流式細胞術檢測細胞凋亡能力 用96孔板培養MG-63/R細胞24 h,加入1× binding buffer,10 μL Annexin V和20 μL PI于孔板內,配置Annexin V/PI 染色工作液后將原有的培養基全部棄掉。將細胞置于孵育箱中,加入胰蛋白酶裂解細胞,后離心取上清液,孵育15 min后檢測凋亡情況。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中SIX2免疫組化染色情況比較 與癌旁正常組織相比,骨肉瘤組織SIX2陽性表達率明顯升高(P<0.001),見圖1和表3。

圖1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中SIX2免疫組化染色(200×)

表3 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中SIX2陽性率比較[n(×10-2)]

2.2 SIX2表達與骨肉瘤MVD的相關性 骨肉瘤組織中SIX2陽性表達患者MVD值明顯高于骨肉瘤組織中SIX2呈陰性患者(P<0.05),見表4、圖2。提示骨肉瘤組織微血管生成與SIX2高表達相關。

圖2 CD31染色微血管密度變化(200×)

表4 骨肉瘤組織中SIX2表達與MVD相關性

2.3 骨肉瘤組織中SIX2 mRNA表達比較 骨肉瘤組織中SIX2 mRNA表達較癌旁正常組織中表達增加(P<0.05),見圖3。

圖3 骨肉瘤腫瘤組織和癌旁正常組織中SIX2 mRNA表達比較

2.4 骨肉瘤腫瘤組織中SIX2表達水平與臨床病理特征比較 骨肉瘤組織中SIX2表達與TNM、軟組織浸潤和淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。Ⅲ～Ⅳ骨肉瘤組織中SIX2水平高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05);有組織浸潤和淋巴結遠處轉移的骨肉瘤組織中SIX2表達高于無組織浸潤和淋巴結遠處轉移的骨肉瘤組織(P<0.05)。見表5。

2.5 敲低SIX2表達對HUVECs小管生成的影響 各組細胞由CM誘導HUVECs形成小管樣結構的能力相比,si-SIX2 A組顯著低于MG-63組(P<0.05),且si-NC A組和MG-63組比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖4。

圖4 敲低SIX2表達對HUVECs小管生成的影響

2.6 敲低SIX2表達對MG-63/R耐藥、增殖、凋亡、侵襲能力的影響 和MG-63/R組相比,si-SIX2 B組細胞IC50、細胞克隆數和細胞侵襲能力均顯著降低,細胞凋亡能力明顯增加,細胞耐藥指數逆轉倍數為2.51倍(P<0.05);MG-63/R組和si-NC B組細胞IC50、細胞克隆數、細胞侵襲能力、細胞凋亡能力相比較差異均無統計學意義(P>0.05),見圖5。

圖5 敲低SIX2表達對MG-63/R耐藥、增殖、凋亡、侵襲能力的影響

3 討論

目前,臨床采用手術切除來治療低級別的髓內型、表面型骨肉瘤,但對于高級別骨肉瘤或轉移性骨肉瘤患者的治療需先化療,再進行其他治療,因此化療骨肉瘤患者的治療尤為重要。文獻顯示,臨床化療骨肉瘤的一線藥物為阿霉素[12]。阿霉素雖然顯著提高骨肉瘤患者的生存率和保肢率,但阿霉素耐藥仍會影響骨肉瘤的治療效果[13]。有學者研究發現,骨肉瘤化療失敗的因素之一為腫瘤轉移[14]。文獻顯示,腫瘤中新生的血管會為腫瘤轉移提供條件[15-16]。就理論而言,手術、化療聯合抗血管生成治療可有效抑制晚期骨肉瘤轉移患者腫瘤轉移。但目前晚期骨肉瘤的分子機制尚不明確,血管靶向治療的臨床研究均未取得有效療效。因此,尋找抗骨肉瘤血管生成和逆轉骨肉瘤阿霉素耐藥的靶點是目前學者們研究的熱點。

SIX1是SIX家族成員之一其通過在多種惡性腫瘤,包括骨肉瘤細胞中的促癌作用介導細胞的分化、增殖和侵襲。SIX2和SIX1高度同源,有研究證實SIX1在腎母細胞瘤組織中表達顯著升高,因此推測二者具有相似性[9]。有研究發現,敲除腫瘤細胞中SIX1的表達不能抑制腫瘤細胞的惡性生物學活性,但卻檢測出了SIX2呈高表達,提示SIX2可能彌補SIX1在腫瘤中的作用[17]。有文獻顯示,SIX1在卵巢癌中的表達明顯高于正常卵巢組織,進一步證明了SIX1能夠促進卵巢癌腫瘤細胞的增殖[18]。本研究結果顯示,SIX2在骨肉瘤組織中高表達,且患者MVD值也顯著高于骨肉瘤組織中SIX2陰性患者,提示SIX2介導骨肉瘤的發生、發展。且骨肉瘤患者的TNM分期、軟組織浸潤和淋巴遠處轉移均影響骨肉瘤組織中SIX2表達,進一步證明了SIX2對骨肉瘤的進展有促進作用。隨后本研究通過體外實驗研究也證實了敲除SIX2能抑制腫瘤細胞的血管生成能力。丁帥等[19]研究證實,通過敲除骨肉瘤組織中SIX1基因表達,可有效調控骨肉瘤細胞的惡性生物學活性。

SIX2是一種發育調節的同源蛋白,在大多數正常成人組織中表達有限,在多種惡性腫瘤中經常錯誤表達,由SIX2誘導的腫瘤病變表現出不同的分化,并表現出腫瘤進展為侵襲性的惡性腫瘤[20]。本研究驗證了SIX2對骨肉瘤細胞生物活性的調控作用,為驗證SIX2為骨肉瘤阿霉素耐藥細胞的逆轉影響,本研究通過敲低SIX2表達發現,MG-63/R細胞株阿霉素耐藥得到了有效的逆轉,同時能有效調控MG-63/R細胞生物學活性。

4 結論

SIX2在骨肉瘤組織高表達和血管生成密切相關,可通過抑制SIX2表達抑制骨肉瘤血管生成能力,逆轉骨肉瘤細胞阿霉素耐藥。