草烏甲素對大鼠膠原誘導性關節炎的作用*

楊建浩 楊云皓 喻雙雨 何成松

(西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科,四川 瀘州 646000)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性、進行性炎性疾病,其主要表現為對稱性的多關節炎,可能會導致關節和關節周圍結構損傷和系統性炎癥[1]。RA的病理特征主要包括滑膜組織增生、炎癥細胞浸潤以及關節軟骨的破壞三個方面[2]。既往有研究顯示,RA在全球范圍內的患病率約為0.24%[3],而在我國RA的患病率為0.36%～0.42%[4]。目前的研究對RA發病機制有了較深的認識,但是在臨床治療方面仍存在較多困難,缺乏較為安全有效的治療方法。草烏甲素是一種現代植物藥,其具有抗炎、鎮痛和一定免疫調節作用,廣泛用于治療慢性疼痛的患者[5]。本研究采用膠原誘導性關節炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠作為本研究的實驗動物模型,其與RA的發病機制在諸多方面存在著相似之處,包括滑膜增生、炎癥浸潤等,是目前研究RA的模型之一[6]。本研究旨在探究草烏甲素對大鼠膠原誘導性關節炎的作用,同時為臨床上使用該藥治療RA提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡雄性SD大鼠20只,體質量為180～220 g,由西南醫科大學實驗動物中心提供,飼養等級為SPF級,動物許可證編號:SCXK(川)2018-17。本動物實驗經西南醫科大學實驗動物倫理委員會討論審議通過(批準文號:SWMU20220023)。

1.2 主要藥品、試劑與儀器 草烏甲素(白色粉末,純度大于98%)購于成都曼思特生物科技有限公司,弗氏完全佐劑及牛Ⅱ型膠原蛋白購于上海碧云天生物技術研究公司,膠原蛋白購于上海金穗生物科技有限公司,IL-6試劑盒、TNF-α試劑盒、MMP-3試劑盒以及HE染色試劑盒購于武漢恒意賽生物科技有限公司。臺式離心機(上海安亭科學儀器廠),恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司),PCR儀(杭州博日科技)。

1.3 方法

1.3.1 建立CIA大鼠模型 將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于0.5%的冰醋酸中,提前預冷,終濃度為4 mg/mL,隔夜4 ℃,在冰浴條件下,將上述溶液加入相同體積的完全弗氏佐劑,使兩者充分乳化;首次免疫在大鼠的足、尾根部多點皮內注射牛型膠原乳劑(按0.3 mL/只)進行[7],首次免疫7 d后在足、尾根再次使用上述乳劑加強免疫;加強免疫21 d后,使用CIA模型評分進行評估,評分大于6分表示造模成功。關節炎指數評分標準[6]如下。0分:無關節腫脹;1分:單個關節腫脹;2分: 2個關節腫脹;3分:2個以上的關節腫脹評;4分:全部關節腫脹。

1.3.2 實驗分組 20只SPF級SD大鼠隨機分為對照組(5只)和誘導模型組(15只)。將誘導模型組中造模成功的CIA大鼠隨機分為模型組、低劑量草烏甲素治療組、高劑量草烏甲素治療組。低劑量草烏甲素治療組和高劑量草烏甲素治療組分別按照50、100 μg/kg腹腔注射草烏甲素溶液,同時于對照組和模型組的大鼠腹腔內注射同等劑量的生理鹽水,每日1次,連續給藥30 d。第31天時處死大鼠,取大鼠的腹主動脈血,高速離心后獲取上層血清,同時獲取大鼠后踝關節滑膜組織保存備用。

1.3.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)測定TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3水平 解凍血清,4 ℃ 條件下2000 g離心15 min,吸取上清液。按照ELISA 試劑盒說明書,測定每組大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3的水平。

1.3.4 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)測定大鼠關節滑膜組織中MMP-3 mRNA的表達水平 引物購自武漢金開瑞生物工程有限公司,經人工合成提供。GAPDH上游引物序列:AACAGCAACTCCCA TTCTTCC,下游引物序列:TGGTCCAGGGTTTCT TACTCC;MMP-3上游引物序列:AGTTCCTTGGG CTGAAGATGAC,下游引物序列:CCTGGAGAAT GTGAGTGGGG。提取各組大鼠滑膜組織總RNA,利用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(ELK Biotechnology,EQ002)合成cDNA。利用QuFast SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(ELKRT-Biotechnology,EQ001)檢測MMP-3 mRNA表達水平,反應條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 45 s,共40個循環。根據計算公式2-ΔΔCt得出MMP-3 mRNA相對表達量。

1.3.5 Western Blot檢測關節滑膜組織中MMP-3蛋白表達水平 使用BCA蛋白濃度測定試劑盒,對滑膜組織進行蛋白濃度測定。用SDS-PAGE凝膠電泳分離相同蛋白量的血清蛋白樣本,同時轉移至PVDF膜上,室溫下加入封閉液孵育PVDF膜1 h后,加入抗MMP-3(武漢三鷹,17873-1-AP)、GAPDH(美國abcam公司,ab181602)的特異性一抗在4 ℃過夜孵育。次日加入對應的二抗常溫孵育1 h。用ECL化學發光法檢測蛋白熒光信號。以GAPDH作為內參蛋白計算MMP-3蛋白的相對表達量。

1.3.6 HE染色觀察滑膜組織病理情況 給藥至第31天處死大鼠,獲取大鼠的后踝關節滑膜組織,通過固定、脫鈣、石蠟包埋及切片進行處理。HE染色:將準備好的切片,經二甲苯、梯度濃度酒精脫蠟后,用蘇木素染色10 min,蒸餾水沖洗,酸性乙醇分化3 s,蒸餾水沖洗1 min,入伊紅染色3 min,蒸餾水沖洗、脫水、透明、封片,最后在顯微鏡下觀察切片。

2 結果

2.1 草烏甲素對大鼠血清中IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-3的影響 與對照組相比,模型組大鼠血清中的IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-3水平明顯升高(均P<0.05)。草烏甲素治療組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-3水平較模型組明顯降低(均P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05),當草烏甲素的劑量達到最高水平(100 μg/kg)時,對IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-3表達水平的抑制作用最為顯著。見表1。

表1 草烏甲素對CIA模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3含量的比較

2.2 草烏甲素對大鼠滑膜組織中MMP-3 mRNA表達的影響 與對照組相比,模型組大鼠滑膜組織的MMP-3 mRNA水平升高(均P<0.05)。予以草烏甲素治療后大鼠滑膜組織中的MMP-3 mRNA水平降低(均P<0.05),其中對MMP-3 mRNA的調節作用呈劑量依賴性(均P<0.05)。見圖1。

圖1 草烏甲素對CIA模型大鼠滑膜組織MMP-3mRNA表達的影響

2.3 草烏甲素對大鼠滑膜組織中MMP-3蛋白水平的影響 與對照組相比,模型組大鼠滑膜組織中的MMP-3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。予以草烏甲素治療后的大鼠滑膜組織中的MMP-3蛋白表達水平降低(均P<0.05)。見圖2。

圖2 草烏甲素對CIA模型大鼠滑膜組織中MMP-3蛋白水平的影響

2.4 草烏甲素對大鼠踝關節組織病理學的影響 HE染色后觀察大鼠踝關節滑膜組織增生及炎癥細胞浸潤的情況,與對照組相比,模型組滑膜組織增生明顯伴有炎癥細胞大量浸潤;與模型組相比,高劑量草烏甲素組滑膜組織未見明顯增生伴有少量炎癥細胞浸潤,見圖3。提示,草烏甲素可以改善CIA大鼠關節滑膜處的滑膜增生和炎癥浸潤。

圖3 HE染色觀察草烏甲素對CIA模型大鼠踝關節滑膜組織病理學的影響(100×)

3 討論

RA是一種慢性、系統性、侵蝕性、全身性自身免疫性疾病,以滑膜增生及炎性細胞浸潤為主要的病理特點[8]。臨床治療RA的藥物目前包括糖皮質激素、非甾體抗炎藥(NSAIDs)、疾病改善抗風濕藥物(DMARDs)以及生物制劑。糖皮質激素及非甾體抗炎藥可有效緩解RA疼痛及僵硬;DMARDs藥物包括羥氯喹、甲氨蝶呤、來氟米特等,可改善風濕病情;生物制劑是靶向抑制免疫和炎癥反應中的特定分子,進而改善風濕病情[9]。草烏甲素是一種從烏頭屬植物滇西嘟拉中分離得到的C-19二萜雙酯型生物堿,其具有鎮痛、抗炎作用,并有一定的免疫調節功能[10]。本研究選用CIA大鼠作為研究RA的實驗模型,因其在發病機制上與RA有很多相似之處,包括關節腫脹、滑膜增生、炎性細胞浸潤等[11]。龍麗等[12]研究表明草烏甲素能提高佐劑關節炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)的鎮痛作用,主要與血清PGE2及提升內源性β-內啡肽水平有關,其中AIA動物模型也是研究RA的動物模型之一,其主要表現為T細胞介導的細胞免疫反應。筆者本次使用的CIA動物模型則包括細胞免疫反應和體液免疫反應兩個方面,相比與AIA動物模型更與人類相似。

胡建楣等[13]研究表明高草烏甲素對佐劑性關節炎性大鼠足腫脹有顯著抑制作用,其主要是降低大鼠血清TNF-α、IL-2、CIA和PGEa水平而發揮抗炎作用。CIA大鼠模型建立成功后,使用不同劑量的草烏甲素處理CIA大鼠,病理結果顯示,草烏甲素治療組的CIA大鼠滑膜組織增生和炎癥細胞浸潤減輕,提示草烏甲素對大鼠膠原誘導性關節炎具有一定的治療作用。

TNF-α是炎癥因子,其主要是通過活化的單、巨噬細胞產生,具有殺傷和抑制腫瘤細胞,以及可以促進細胞增殖和分化的生物學特性,從而參與自身免疫疾病的發生和發展[14]。在RA患者體內,TNF-α是一種高表達的促炎因子[15]。TNF-α可以促進其他促炎因子的釋放,如IL-6同時進一步強化炎癥反應,在RA的疾病活動中有重要的作用[16]。既往有研究表明,IL-6在免疫調節、造血、炎癥和腫瘤等方面具有廣泛的生物學活性[17]。IL-17由輔助性T細胞產生,在體內可以促進粒細胞集落刺激因子和趨化因子的產生,具有強大的致炎作用[18]。隨著促炎因子的產生增多,增加的中性粒細胞參與誘發滑膜炎癥反應的機率,從而加劇體內了軟骨和骨的破壞[19]。基質金屬蛋白酶(MMPs)是屬于鋅依賴性的內肽酶,因其具有降解細胞外基質中各種蛋白質的作用,被認為是一類負責降解細胞外基質分子的酶,細胞外基質分子作為參與生物組織重塑中的重要調節因子[20]。有研究發現MMPs 可以在關節軟骨中表達,因為其具有降解Ⅲ～Ⅶ型膠原及多種纖維連接蛋白的作用,并且在RA疾病活動時表達進一步升高,從而被認為是參與軟骨降解最重要的蛋白酶[21]。MMP-3在RA患者中水平較高反映了疾病活動和結構損傷[22],被認為是RA疾病活動度、疾病結局可預測性和治療反應的可靠標志物[23]。

本實驗通過ELISA對大鼠血清中的細胞因子進行檢測,發現CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3水平均顯著高于正常大鼠,而接受草烏甲素治療的CIA大鼠TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3水平可顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性降低,提示草烏甲素具有一定抗炎作用。同時在本研究實驗中檢測CIA 大鼠滑膜組織中MMP-3的mRNA以及蛋白表達水平,發現CIA大鼠滑膜組織中 MMP-3的表達含量均顯著高于正常大鼠,而接受草烏甲素治療的CIA大鼠,MMP-3表達水平明顯下降(P<0.05)。由此可知草烏甲素對于 CIA 大鼠具有一定的治療作用,但其作用機制目前還尚不明確,可能與抗炎作用有關,有待進一步研究。

4 結論

草烏甲素可以抑制炎癥因子分泌和降低MMP-3的表達,對大鼠膠原誘導性關節炎具有一定的治療作用,在RA的治療上具有良好的應用前景。