黃連解毒湯通過促進自噬減輕膿毒癥大鼠心肌損傷

江桂通 王 臘 田維毅*

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550000；2.貴州省岑鞏縣人民醫院，貴州 岑鞏 556000

迄今為止，膿毒癥仍是一個世界公共衛生問題，其發病率及病死率雙高仍困擾著全球的醫務工作者[1]。膿毒癥病理過程異常復雜，目前仍尚未完全闡明，涉及炎癥的失控、機體免疫系統抑制及凝血功能障礙等多個方面[2]。膿毒癥誘導宿主多器官功能障礙綜合征與其高死亡率息息相關，其中心臟功能障礙是關鍵[3]。膿毒癥誘導的心肌病其特征包括心肌細胞死亡以及過度炎癥反應等。自噬(Autophagy)作為細胞的一種自我保護機制[4]，在應激條件下，Beclin-1復合物與唯一具有跨膜結構的自噬核心調控蛋白(ATG9)調控自噬泡的形成與自噬膜延伸的過程[5-6]，將受損的蛋白質轉運至溶酶體，底物蛋白P62也隨之降解，以維持細胞內環境的穩定，促使細胞存活。自噬泡的形成到自噬體與溶酶體相結合，涉及到LC3-I/LC3-II的比率及P62蛋白的表達水平，這是評估自噬活化程度的主要方式[7]。目前公認自噬作為細胞適應機制能減輕細胞損傷和凋亡，膿毒癥中自噬的維持可能有助于減輕膿毒癥引起的器官損傷[8]。因此，探索自噬現象對炎癥性疾病的治療具有重大的意義[9]。

膿毒癥在中醫學古籍中雖沒有具體的病名記載，但根據其發病的主癥，歸納其病因、病機，可歸屬于“熱毒”“溫毒”一類[10]。熱毒貫穿于膿毒癥發病之始終為基礎，清熱解毒是膿毒癥治療的核心環節，并在疾病的發生發展中起著決定作用[10-12]。黃連解毒湯始載于唐代王燾《外臺秘要》一書中，由黃連、梔子、黃芩及黃柏組成，具有瀉火解毒之功效，為清熱解毒的代表方之一。課題組前期研究[13]發現，黃連解毒湯含藥血清能顯著降低脂多糖(LPS)誘導的膿毒癥細胞模型炎癥因子(TNF-α、IL-6)表達水平，誘導RAW264.7巨噬細胞自噬相關基因Beclin-1的表達[14]，為本研究提供了前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 35只SPF級SD雄性大鼠，體重在150～180 g之間，購買于湖北省預防醫學科學院，許可證號SYXK(黔)2018-0001。實驗前適應性飼養1周，分籠飼養于貴州中醫藥大學東垣樓。本實驗由貴州中醫藥大學倫理委員會批準，實驗操作及過程嚴格執行倫理委員會的相關規定。Affinity抗體江蘇常州艾菲爾生物科技(LC3、Beclin-1、P62)，兔源，貨號分別為[AF5402，AF5128，AF5384]。3-18K型低溫離心機(德國Sigma公司)；Bio-Rad蛋白凝膠電泳儀、Bio-Rad凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 藥材與制備水煎劑 按王燾《外臺秘要》黃連解毒湯原方比例配伍(黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g)，購自北京同仁堂貴陽店。按課題組常規方法制備水煎劑，加熱濃縮至含生藥濃度為1 g/mL存放4 ℃保存備用[15]。

1.3 實驗分組 35只SPF級SD雄性大鼠隨機分組。①Sham組(n=7)；②CLP組(n=7)；③HLJDD+CLP(HLJDD)組(n=7)；④HLJDD+Rap+CLP(H+RAP)組(n=7)；⑤HLJDD+3-MA+CLP(H+3MA)組(n=7)。在CLP手術前1周，給予HLJDD：灌胃給藥3.5g·kg-1·d-1藥液灌胃，1 mL/100 g體重，每天1次，持續7d[15]。Sham組及CLP組給予同等體積的生理鹽水灌胃。雷帕霉素、3-甲基腺苷溶于二甲亞砜，在CLP手術后1 h內腹腔注射。在Sham、CLP和HLJDD組腹腔注射相同體積的生理鹽水。雷帕霉素(RAP，3 mg/kg，MedChemExpress，新澤西，美國)、3-甲基腺嘌呤(3-MA，30 mg/kg，MedChemExpress，新澤西，美國)、二甲亞砜(DMSO，Sigma-Aldrich，美國)。

1.4 建立膿毒癥大鼠模型 盲腸結扎穿孔術[16](CLP)建立膿毒癥動物模型。大致步驟如下：腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定，腹中線1.5 cm切口暴露盲腸，絲線結扎于回盲瓣的四分之一處，用20號針頭進行兩次盲腸穿刺擠出糞便后擦拭，將暴露的盲腸放回腹腔，用無菌的6.0手術縫線將腹壁分層縫合。術后，用3 mL預熱的無菌鹽水皮下注射進行液體復蘇，自由飲食、活動。對Sham組大鼠進行同樣的操作但盲腸無結節及穿孔。

1.5 大鼠模型血常規檢測 術后3 d仍存活的大鼠，麻醉后采血經獸用全自動血液細胞分析儀檢測，選取指標有白細胞(WBC)計數；中性粒細胞數目(Gran)；中性粒細胞百分比(Gran%)。

1.6 HE染色觀察心臟組織病理變化 將心臟組織用甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm厚片。切片在二甲苯中孵育5 min。然后，將樣品依次在100%，95%，80%，75%乙醇梯度孵育；蒸餾水沖洗2 min，切片用蘇木精染色5 min，再漂洗，在伊紅溶液中孵育2 min。最后，切片脫水，密封，并在顯微鏡下檢查。

1.7 蛋白印跡法檢測心臟組織中自噬蛋白LC3、Beclin-1、P62表達水平 提取大鼠心臟組織總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質經凝膠電泳后轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。用兔來源的單克隆抗體(LC3 1∶1000、Beclin-1 1∶1 000、P62 1∶1000)在4 ℃孵育過夜。搖床TBST洗膜15 min/次，共3次，然后將PVDF膜與鼠源抗兔二級單克隆抗體(1∶2000)在37 ℃孵育1h。同樣方法洗滌后，配置ECL顯影液顯影，曝光采集條帶圖象保存，以GAPDH為內參，Image Lab軟件分析各目的蛋白條帶的灰度值。

1.8 檢測大鼠心臟組織中ATG9 mRNA的表達水平 采用Q-PCR法檢測大鼠心臟組織中ATG9 m RNA的表達差異。稱取各組大鼠心臟組織研磨，Trizol法提取總RNA，逆轉錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR。按照試劑盒說明進行操，引物由上海生工公司設計合成，以GAPDH為內參(F5’ACAGCAACAGGGTGGTGGAC3’;R5’TTTGAGGGTGCAGCGAACTT3’)檢測各組大鼠心臟中ATG9 mRNA(F5’TTACTGTGGAGGTCGTCGGTGTGGG3’;R5’ GGATGTGAAAAGGGCATTCTCTGGG3’)。以2-ΔΔCt計算目的m RNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 觀察黃連解毒湯對膿毒癥大鼠心臟病理情況 HE染色結果顯示：Sham組大鼠心肌細胞結構清晰完整，排列整齊，染色均勻。CLP組大鼠心肌細胞排列紊亂可見炎性細胞浸潤，染色加深，部分心肌細胞腫脹明顯并有壞死。HLJDD組與CLP組相比較，心肌肌纖維排列相對規則，心肌間間隙變小，炎癥細胞浸潤減弱。H+RAP組心肌細胞形態結構邊界較HLJDD組明顯改善，而H+3MA組則心肌細胞排列紊亂、壞死程度增加。如圖1所示。

圖1 各組大鼠心臟組織病理圖(HE染色，×200)

2.2 黃連解毒湯對膿毒癥大鼠血常規的影響 與Sham組相比，CLP組大鼠全血中(WBC、Gran#、Gran%)均明顯上調(P<0.05)。與CLP組相比，HLJDD組大鼠的(WBC、Gran#、Gran%)均明顯下調，H+RAP組指標進一步下降，而H+3MA組則呈現相反的趨勢(P<0.05)。見表1。

表1 黃連解毒湯對膿毒大鼠血常規的影響

2.3 黃連解毒湯對自噬相關蛋白(LC-3、Beclin-1、P62)的影響 與Sham組比較，CLP組大鼠心臟組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達顯著降低，P62蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與CLP組比較，HLJDD組大鼠心臟組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達明顯上調，P62蛋白表達明顯降低，H+RAP組的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達則顯著上調，P62蛋白表達顯著降低。而H+3MA組則呈現相反的趨勢，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達則顯著降低，P62蛋白表達顯著增加(P<0.05)。見表2和如圖2所示。

表2 黃連解毒湯對膿毒癥大鼠自噬相關蛋白的影響

圖2 各組大鼠心臟組織自噬相關蛋白電泳圖

2.4 黃連解毒湯對膿毒癥大鼠自噬基因ATG9 m RNA的影響 與Sham組比較，CLP組大鼠心臟組織中自噬基因ATG9 m RNA表達顯著降低(P<0.05)。與CLP組比較，HLJDD組大鼠的表達明顯上調，H+RAP組的進一步上調。而H+3MA組則呈現相反的趨勢，ATG9 m RNA表達顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 膿毒癥大鼠心肌組織自噬基因ATG9 m RNA的表達

3 討論

膿毒癥是一種由感染引起的全身性炎癥反應綜合征，其中誘發的心肌病治療耗資頗大且療效欠佳，目前其病死率仍居高不下[17]。臨床研究[18]發現，罹患膿毒癥患者的死亡超過70%是由器官衰竭引起的，其中超過50%表現出心肌功能障礙。膿毒癥期間不受控制的炎癥因子直接抑制心臟，是誘發心肌病的主要機制，伴隨著嚴重的心臟功能障礙對患者造成致命打擊[19]。巨噬細胞作為人體中最主要的免疫細胞，在膿毒癥期間被過度激活并釋放出大量炎性因子 (IL-1、IL-6、TNF-α)。在團隊前期研究[13]發現，黃連解毒湯能顯著地提高CLP誘導的膿毒癥動物模型生存率、降低炎癥因子(TNF-α、IL-6)，表現出明顯的抗炎作用。這些研究結果與黃鑫等[20]和李翀等[21]的研究結果相符。白細胞、中性粒細胞是機體抵御微生物侵襲的第一道防線，是免疫防御以及解決過度炎癥所必需的，可以評估膿毒癥病程嚴重狀態的指標[22-23]。此次實驗筆者采用血常規檢測大鼠全血中感染指標，證實了黃連解毒湯減輕膿毒癥大鼠的感染的顯著作用(表1)。在細胞和分子水平上，炎癥和細胞的凋亡被認為是膿毒癥心功能障礙的關鍵病理生理學現象[24]。筆者在光鏡下觀察膿毒癥大鼠心臟HE病理切片。結果顯示：黃連解毒湯能減輕膿毒癥大鼠心臟組織局部炎癥，減輕心肌細胞的損傷情況。細胞自噬可以降解受損蛋白質以維持正常功能的途徑[25]。但在心血管疾病中，特別是膿毒癥誘導的急性心肌損傷中，自噬的作用機制尚不明確。有研究[26]發現，小干擾RNA(siRNA)沉默自噬基因ATG5和3-甲基腺嘌呤抑制自噬，增加了心肌細胞凋亡的發生。然而，糾正自噬受損，改善舒張期充盈增加心臟收縮力，減少心肌細胞凋亡[27-28]。本研究發現黃連解毒湯促進了膿毒癥大鼠心臟自噬通量的增加，從血常規結果及觀察心臟病理切片，自噬的增加進一步減輕了膿毒癥大鼠的心肌損傷程度，而自噬受阻則加重其損傷程度(圖2、表2、表3)，這些結果與WU等[29]的研究相符。

膿毒癥臨床證候復雜多變，主次真偽變化多端。治病必求本，辨證必求因。《素問·至真要大論》指出“必伏其所主，而先其所因”。熱毒貫穿于膿毒癥之始終，并在疾病的發生發展起主導作用。清·汪讱庵曰：“毒者，即火邪之盛也。”黃連解毒湯是清熱解毒治法代表方劑之一，方中黃連為君清中焦之火；黃芩為臣輔以清上焦之火；黃柏佐助清下焦；梔子通瀉三焦，引熱下行，從小腸膀胱而出；四藥合力，三焦兼顧。

綜述所述，本研究發現，黃連解毒湯有減輕膿毒癥大鼠炎癥水平及心臟組織的損傷作用，可能是通過增加自噬的途徑。然而，黃連解毒湯對于自噬具體的調控機制尚且不清楚，有待于后續的研究。