苦膽草多糖活性炭脫色工藝研究

黃麗金 陳貴元，2*

（1大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000）

苦膽草（Andrographis paniculata）又稱印度草、穿心蓮、苦草、春蓮、秋蓮。穿心蓮因其食入一小片葉子，就可以感受到那直擊心靈的苦，故稱為“穿心蓮”[1]。該植物廣泛分布于我國福建、廣東等南方地區，有著“大南藥”之稱[2]。在民間這種植物可直接作為藥材使用，治療感染性疾病和解蛇毒。苦膽草中含有多種活性成分：多酚、蛋白質、內脂、多糖、黃酮等[3]，其中苦膽草內脂有著多種藥理作用，如抗血栓、鎮痛、清熱解毒、抗高血糖、抗癌、保護肝臟等活性[4]。在研究內脂抗癌機制中，屬結直腸癌和乳腺癌研究最多[5]。

多糖具有抗血糖[6]、降血脂[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]多種活性，徐兵[10]研究發現苦膽草多糖可以抑制視網膜母細胞增殖活性、遷移侵襲活性，并誘導腫瘤細胞凋亡。由于提取得到的多糖顏色較深，較難溶于水，且這些色素分子的存在會影響多糖發揮作用，這是因為未經處理的多糖分子量較大，體積大，且溶解后黏度大，妨礙了多糖通過機體屏障進入細胞，使其發揮不了生物學作用[11]，因此對多糖進行脫色素非常有必要。研究發現，多糖脫色素的方法常用的有樹脂吸附法[12]、活性炭法[13]、雙氧水法[14]等。活性炭作為一種吸附劑，是一種物理吸附法，其比表面積大、吸附性強、理化性質穩定、耐酸堿、內部空間發達[15]等獨特的優勢使其脫色素迅速又方便。苦膽草活性炭脫色暫無相關研究，故本研究將用活性炭進行多糖脫色，從單因素試驗方面，考察其脫色率和多糖保留率，選取最優試驗條件進行三因素三水平的Box-Behnken 設計試驗，并通過綜合評分，響應面分析法設計出最優脫色方案。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

苦膽草購于云南省大理市劍川縣農貿市場；活性炭購于上海化學試劑采購供應站經銷；蒽酮、濃硫酸、無水葡萄糖標準品均為國產分析純。

1.2 主要儀器和設備

THZ-82恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司），DL-8000C低俗冷凍離心機（上海安亭科學儀器公司），722E型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1苦膽草多糖的提取參照李月等[16]的方法。

1.3.2葡萄糖標準曲線的制作采用蒽酮濃硫酸法[17]。準確配制1 mg/mL 的標準儲備液，即稱取葡萄糖標準品粉末100 mg 加水定容至100 mL 的容量瓶中，取溶液配制成0.1 mg/mL 的標準葡萄糖溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標準液帶塞試管，蒸餾水補足至2 mL，在冰水浴中分別加入4 mL 0.5%的蒽酮濃硫酸試劑，試劑現配現用，避光保存于棕色瓶中。在水浴鍋90 ℃以上中沸騰10 min后，取出迅速冷卻，在常溫放置10 min。在620 nm處進行多糖吸光度的測量。

1.3.3單因素試驗取質量濃度為0.65 mg/mL的苦膽草多糖，離心取上清。在活性炭用量為0.3 g/30 mL、時間為40 min、溫度為50 ℃、震蕩頻率為120 r/min的基礎條件下，分別考察活性炭的脫色效果以及多糖保留的情況，每組試驗重復3次及以上。

1.3.4響應面試驗設計根據單因素試驗結果，在最優試驗條件下作為中心點設計Box-Behnken三因素三水平表（見表1），進一步研究活性炭用量（A）、脫色溫度（B）、脫色時間（C）之間的交互影響。使用Design-Expert 8.0 設計軟件優化設計多糖脫色工藝，以綜合評分（Y）為響應值評價多糖的脫色效果以及多糖保留率情況，并計算出最優的試驗條件。

表1 Box-Behnken試驗設計

1.3.5驗證試驗根據響應面得出的最優脫色工藝組合進行3 次平行試驗，以綜合評分為指標驗證響應面試驗數據是否可靠。

1.3.6脫色率、多糖保留率和綜合評分的測定和計算方法

（1）脫色率測定 將多糖溶液在200～1 200 nm紫外分光度計下掃描波長，結果未得到合適的最大吸收峰，根據顏色的互補定理[18]，該溶液為深褐色，選取560 nm 的波長進行后續的多糖脫色效果測定。按式（1）的計算方法計算脫色率：

（2）多糖保留率的測定 采用蒽酮濃硫酸法，在620 nm 處測定脫色前后多糖的OD 值，帶入葡萄糖標準曲線的方程計算出質量濃度，按式（2）的計算方法計算多糖保留率：

（3）綜合評分 綜合評分（Y）= 0.5 ×

1.4 數據統計與分析

采用Origin 9.0、Excel 2007、Design-Expert 8.0軟件對數據進行統計分析、繪圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

如圖1所示，以葡萄糖質量濃度（ug/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程：y= 0.012 9x-0.021 9，R2=0.993 9，表明10～60 ug/mL 范圍內的葡萄糖標準質量濃度與吸光度呈良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1活性炭用量在基礎條件下，分別考察活性炭用量為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 g/30 mL 的多糖脫色率與多糖保留率。如圖2 所示，在0.3 g/30 mL 用量之前，隨著活性炭用量的增加，脫色率呈陡峭曲線上升，表明在此范圍內，脫色率與活性炭使用量成正比關系；而在活性炭添加量0.3 g/30 mL 之后，脫色率曲線較之前曲線平緩，表明脫色效果在下降，這可能是隨著活性炭添加量的增加，活性炭逐漸與溶液中的色素分子的結合，呈飽和狀態；多糖分子隨著活性炭添加用量的增加不斷減少（圖3），這可能是由于活性炭的吸附為不定向，在吸附色素分子的同時也吸附了多糖分子。由此表明，活性炭取量在0.3 g/30 mL 時脫色效果和多糖保留率都處于良好狀態，故選擇用量0.3 g/30 mL為響應面活性炭用量的中心點。

圖2 活性炭用量對多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖3 活性炭用量對苦膽草多糖綜合評分的影響

2.2.2脫色時間在設置的基礎條件下，分別考察脫色時間20、30、40、50、70 min 的多糖脫色率與多糖保留率。由圖4、圖5 可知，隨著時間的增加，脫色率不斷增加，多糖保留率不斷下降。隨著時間的增加，脫色率上升的并不多，即在68%～76%，這表明活性炭脫色效果與時間的關系不是很大，隨著時間的增加，活性炭所吸附的分子越來越多，當基本填滿作用孔徑時，每個活性炭表面都吸附色素分子，空間變得擁擠、堵塞，造成吸附色素分子的能力下降，稱為“堵車”現象。為節省時間以及減少多糖分子不必要的損失，故選擇40 min 作為響應面脫色時間的中心點。

圖4 脫色時間對多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖5 脫色時間對苦膽草多糖綜合評分的影響

2.2.3脫色溫度在基礎條件下，分別考察脫色溫度30～70 ℃條件下的多糖脫色率和多糖保留率。如圖6、圖7所示，隨著脫色溫度的上升，脫色率不斷上升，基本與脫色溫度成正比關系，在70 ℃時，曲線變得較平直，這說明一定的溫度可以促進活性炭的吸附，但是活性炭會處于空間飽和狀態，所以過高的溫度對多糖脫色效果不明顯，只會更多地損耗多糖。從多糖保留率來看，隨著溫度的上升，多糖保留率不斷下降，由圖6 可知，為更多地保留多糖分子，因其多糖保留率40 ℃后出現驟減，故選擇40 ℃作為響應面脫色溫度的中心點。

圖6 脫色溫度對多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖7 脫色溫度對苦膽草多糖綜合評分的影響

2.3 響應面試驗設計結果

響應面試驗設計結果與方差分析表見表2、表3。由表2 數據得出二次回歸模型方程，Y=+69.25+3.52A+1.19B+0.44C+0.093AB+0.039AC+0.22BC-1.99A2+0.060B2+0.77C2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

表3 回歸模型的方差分析

其中Y（綜合評分），A（活性炭使用量），B（脫色時間），C（脫色溫度）。

2.4 驗證試驗結果

以綜合評分為指標，并通過回歸二次方程得出的最佳脫色工藝組合為活性炭用量0.4 g/30 mL、溫度45.23 ℃、時間49.92 min，綜合評分預測值為72.828 5，保留2位小數約72.83。

考慮到試驗的條件，最終驗證試驗條件改為用量0.4 g/30 mL，溫度45.20 ℃，時間50 min。在其他條件不變的情況下，試驗重復3次取均值，在此條件下多糖脫色率為80.49%，多糖保留率65.34%，綜合評分為72.91，與預測值的綜合評分72.83相差很小，相對誤差為0.11%。這表明該模型下提供的最優工藝參數具有可靠性，可應用到實際中。

3 結論

本文以活性炭對多糖進行脫色試驗，選取單因素試驗結果最佳試驗范圍，后通過響應面試驗設計，以綜合評分為指標篩選出了最優脫色工藝條件：活性炭用量0.4 g/30 mL、溫度45.2 ℃、時間50 min，在此條件下，多糖平均脫色率為80.49%，多糖保留率65.34%，綜合評分為72.91，接近預測值72.83。表明該工藝設計的條件以及得出的結果具有可靠性、精確性，可應用到實際工作中去，避免在實際工作中造成資源、成本的浪費。

活性炭在日常生活中具有脫色、凈化污水、吸附有毒氣體、凈化空氣等諸多作用，在多糖脫色這一塊，相校其他方法如過氧化氫法、大孔樹脂吸附法，具有成本低廉、脫色效率高、所耗時間短以及不改變多糖的性質、也不帶進別的物質的優點，非常適合工藝化的生產需求。不過活性炭也有不足的地方，活性炭的吸附不具有特定性，它沒有選擇性地吸附所有可吸附的東西，所以在多糖脫色時也會造成多糖的損耗，并且它本身是黑色粉末狀，自帶黑色物質，在脫色時，需要不斷離心、過濾才能清除黑色物質，在此過程中造成時間成本增加，試驗也變得繁瑣，故今后對活性炭的研究可以關注如何快速地除去活性炭本身的顏色以及控制活性炭在吸附色素時不吸附多糖分子。