西番蓮果皮多糖鋅的結構表征和益生元作用

楊 可，李 霞，李海鵬，姜鐵民，李 靜，關 媛，陳海珊，李麗芬,

（1.桂林理工大學化學與生物學院，廣西桂林 541006；2.廣西植物研究所，廣西桂林 541006）

西番蓮（Passiflora edulisSims），又稱百香果，雞蛋果，是一種熱帶攀緣藤本植物，主要分布于兩廣、福建、海南、臺灣等地，由于其獨特的風味和營養特征備受人們喜愛[1-3]。西番蓮果皮作為西番蓮工業生產的主要副產品，其比重占總果的45%～55%，包含豐富的膳食纖維以及活性物質，如多糖、黃酮、多酚和生物堿等[4-6]。多糖作為西番蓮果皮主要活性物質之一，具有良好的抗氧化、抗腸炎以及增強腸道保護等多種生物活性[7-10]。西番蓮果皮多糖還具有益生元作用，在羧甲基化修飾后，其益生元作用有所提升[11]。

鋅作為人體必不可少的微量元素之一，在維持蛋白質和DNA 合成、調節細胞生長、增殖和代謝等方面發揮著重要作用[12-13]。鋅不能在體內合成，只能通過膳食補充劑攝入，缺鋅會導致各種高危疾病的患病率增加，如侏儒癥[14-15]、冠心病、糖尿病、厭食癥、心腦血管疾病、慢性腎臟疾病和癌癥等[16-17]疾病，鋅攝入量不足、排泄過多[18]和使用障礙是導致人體患有上述疾病的常見原因。多糖鋅配合物是由多糖與鋅離子配合而成，與無機鋅相比，其副作用小、利用率高、對胃腸道刺激小、生物活性高[19-21]。有研究發現，黃芪多糖鋅對糖尿病大鼠具有較強的降血糖作用[22]，杏鮑菇菌絲多糖鋅具有預防高脂血癥的作用[23]，南瓜果皮多糖鋅對斑馬魚炎癥細胞具有較好的抑制作用[24]，但是關于天然多糖鋅復合物的益生元作用的研究鮮有報道。

本研究將西番蓮果皮多糖與七水硫酸鋅配合得到西番蓮果皮多糖鋅，對西番蓮果皮多糖鋅的理化性質與結構進行了檢測分析，并探究了其益生元作用。本研究為西番蓮資源的有效利用提供了新的方向，為多糖鋅在功能食品領域的開發以及在益生領域的探索提供了一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西番蓮（Passiflora edulisSims） 廣西桂林市，十月份采摘；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii（subsp.）bulgaricus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus） 廣東省微生物菌種保藏中心；低聚果糖（Fructooligosaccharides，FOS）、大豆蛋白胨 上海源葉生物科技有限公司；大豆卵磷脂 上海賢鼎生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS） 上海凜恩科技發展有限公司；剛果紅 上海麥克林生化科技股份有限公司；磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸 西隴科學股份有限公司；酵母浸粉 北京陸橋技術有限責任公司；牛肉浸粉 青島高科園海博生物科技有限公司；乙酸鈉等其他試劑 均為分析級及以上。

YKSL-1200X 馬弗爐 合肥科晶材料技術有限公司；ALPHA1-2 LD 冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；YK722PC 可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；LRH-250-Z 振蕩培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司；3000Da 透析袋 北京瑞達恒輝科技發展有限公司；SDT Q600 熱重-差熱分析儀 美國TA Instrument 公司；XPert3Power X-射線衍射儀 荷蘭帕納科公司；IS10 傅立葉紅外光譜儀 美國Thermo Fisher 公司；YK722PC 紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；iMark酶標儀 Bio-Rad Laboratories；S-5000 電鏡掃描儀日立有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖鋅配合物的制備 根據Guan 等[25]的方法，用水提法制備得到西番蓮果皮粗多糖（Water extracted polysaccharide fromPassiflora edulisSims peel，WPEP）。將1.0 g WPEP 溶于250 mL 蒸餾水中，加入0.88 g ZnSO4·7 H2O（溶于20 mL 0.1 mol/L HCl 中），調節pH 至6.0，于60 ℃條件下反應2 h，流水透析48 h，濃縮并冷凍干燥得到西番蓮果皮多糖鋅配合物（WPEP-Zn）。

1.2.2 理化性質檢測

1.2.2.1 鋅含量的測定 取100 mg WPEP-Zn 在馬弗爐中高溫灰化3.5 h，溫度設置為550 ℃?；一蟮腤PEP-Zn 溶于少量稀硝酸，加水至10 mL 備用。取一定量ZnSO4·7H2O 配制濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/L 的鋅標準溶液備用[26]。采用可見分光光度計測定WPEP、WPEP-Zn 和系列標準溶液的吸光度并計算鋅含量，測得標準曲線方程為Y=0.2611X-0.0148，R2=0.9956。

1.2.2.2 溶解性的測定 取50 mg WPEP 與WPEPZn 分別加入5 mL 蒸餾水，室溫下混合90 min 后在8000 r/min 下離心30 min。移去上清液，烘干后稱量剩余多糖質量。溶解性計算公式如下：

式中：W0表示溶解前多糖質量，mg；W1表示溶解后剩余多糖質量，mg。

1.2.2.3 總糖含量和糖醛酸含量的測定 采用苯酚硫酸法[27]和間羥基聯苯法[28]檢測WPEP 與WPEPZn 的總糖含量與糖醛酸含量，測得總糖含量標準曲線方程為Y=13.847X+0.0556，R2=0.9989，糖醛酸含量標準曲線方程為Y=11.128X+0.0274，R2=0.9905。

1.2.3 結構表征

1.2.3.1 剛果紅實驗 1 mL WPEP 和WPEP-Zn 溶液（1 mg/mL）與1 mL 剛果紅溶液（80 μmol/L）混合，加入NaOH（1 mol/L）溶液混合至NaOH 最終濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L，室溫靜置10 min，紫外分光光度計在400～600 nm 掃描檢測最大吸收波長[29]。

1.2.3.2 傅里葉變換紅外光譜檢測 稱取一定量的WPEP 和WPEP-Zn，分別加入100 mg 溴化鉀研磨壓片，在4000～500 cm-1波數范圍內進行紅外光譜掃描[30]。

1.2.3.3 X 射線衍射（XRD）檢測 采用X-射線衍射儀進行掃描測定，衍射條件為：Cu-Kα衍射，管壓40 kV，管流40 mA，角度5.00°～90.00°，角度梯度0.02°、掃描速度10°/min。

1.2.3.4 掃描電子顯微鏡（SEM）檢測 用導電膠將多糖粘在樣品臺上，在真空噴鍍儀內噴上金膜，掃描電子顯微鏡下觀察樣品表面形態。條件為電壓：5 kv，電流：9.9 A。

1.2.3.5 熱重檢測 分別稱取10 mg WPEP 和WPEPZn 于坩堝中，以空白陶瓷坩堝作空白參照，氮氣為保護氣，在熱重分析儀上進行熱分解，實驗條件設置溫度為10～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min[31]。

1.2.4 多糖的益生元作用

1.2.4.1 培養基的配制 MRS 基礎培養基：大豆蛋白胨10.0 g，牛肉浸粉10.0 g，酵母浸粉5.0 g，檸檬酸二胺2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.05 g，硫酸鎂0.30 g，吐溫-80 ℃ 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，溶至1000 mL 水中，pH6.5。液體培養基：在MRS 基礎培養基的基礎上加1%的葡萄糖所得。固體培養基：為在液體培養基的基礎上加1.5%的瓊脂所得。

1.2.4.2 菌種活化 液體培養：配置液體培養基，高壓滅菌，設置時間為20 min，溫度為121 ℃。滅菌結束后分別4 種益生菌接種到液體培養基中，37 ℃下培養48 h。固體培養：將液體培養基中培養的4 種益生菌分別接種至固體培養基中，在37 ℃下培養48 h，再將益生菌接種于液體培養基中培養12 h 進行二次活化，培養條件與液體培養條件相同。

1.2.4.3 不同濃度多糖對益生菌增殖的影響 在MRS 基礎培養基中加入質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0%（W/V）的FOS、WPEP 和WPEP-Zn，分別接入上述4 種二次活化后益生菌，在37 ℃環境下振蕩培養36 h，測定不同多糖濃度下培養液的OD570nm，確定促進益生菌增殖的最佳多糖濃度。

1.2.4.4 多糖對益生菌生長曲線的影響 根據張國柱[32]的方法做出部分修改，實驗以低聚果糖作陽性對照，以MRS 基礎培養基作空白組陰性對照。在200 μL 空白組和最佳質量多糖濃度下的FOS 組、WPEP 組和WPEP-Zn 組培養基中分別加入100 μL二次活化后的4 種益生菌，培養36 h，每間隔2 h 測定培養液的OD570nm。以培養時間為橫坐標，以OD570nm為縱坐標代表益生菌的生長狀況，繪制益生菌的生長曲線，探究WPEP 及WPEP-Zn 對4 種益生菌生長的影響。

1.3 數據處理

所有實驗重復3 次，實驗數據以平均值±標準誤差的形式表示，采用SPSS22.0 處理和分析數據，采用Origin pro 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 理化性質分析

理化性質分析結果如表1 所示。WPEP-Zn 的總糖和糖醛酸含量分別從配合前的28.52%和72.03%降至23.26%和50.46%，多糖與鋅配合后總糖含量與糖醛酸含量存在顯著性差異（P＜0.05）。溶解性從97.8%升至98.07%，無顯著性差異（P＞0.05）。WPEP未檢測到Zn，WPEP-Zn 的鋅含量為10.64±0.5 mg/g。鋅的配合改變了WPEP 的理化性質，配合后的多糖總糖含量和糖醛酸含量明顯降低，鋅含量增加。

表1 WPEP 與WPEP-Zn 的理化性質Table 1 Physicochemical properties of WPEP and WPEP-Zn

2.2 剛果紅測試分析

WPEP、WPEP-Zn 的剛果紅測試結果如圖1 所示。多糖的三螺旋結構使得其結構復雜多樣，能夠承載更多的生物信息，同時有利于多糖生物活性的提高[33]。剛果紅溶液是一種弱堿性的溶液，具有三螺旋結構的多糖與堿性的剛果紅溶液能夠形成復合物。WPEP 與WPEP-Zn 在NaOH 濃度為0.05～0.15 mg/mL的最大吸收波長與堿性剛果紅溶液相比發生了紅移，且在NaOH 濃度為0.1 mol/L 時波長最大，隨著堿濃度的升高，WPEP 與WPEP-Zn 中的三螺旋結構被破壞，兩種多糖的最大吸收波長逐漸降低，三股螺旋結構逐漸解旋，這與常相娜等[34]所做的香菇多糖的剛果紅實驗一致。結果說明WPEP-Zn 具有多糖的三螺旋結構。

圖1 剛果紅實驗波峰圖Fig.1 Peak diagram of Congo red test

2.3 傅里葉紅外光譜分析

由圖2 可知，配合前后的多糖紅外光譜在3440 cm-1左右均有強吸收峰，是多糖分子間或分子內的O-H的伸縮振動引起的；在2700～3000 cm-1之間出現了弱吸收峰，是糖類不對稱C-H 的伸縮振動引起的；1600 cm-1左右強吸收峰屬于C=O 的伸縮振動；在1362 cm-1左右的吸收峰為O-H 的彎曲振動吸收峰；1000～1200 cm-1范圍內的吸收峰屬于C-O-C 和CO-H 的伸縮振動；1015.13、1068.92、1148.15 cm-1左右的C-O 吸收峰表明存在吡喃環結構[35]。WPEP與鋅配合后，屬于O-H 的伸縮振動產生的特征吸收峰由3443.08 cm-1處移動到3443.98 cm-1，推測WPEP 與鋅結合是通過Zn-O 鍵進行連接[36]；在500～1000 cm-1范圍內，相比于WPEP，WPEP-Zn 在562.48 cm-1處未出現峰值，但在531.99 cm-1和920.48 cm-1處產生了新的特征峰。所有吸收峰的變化都與多糖和鋅的相互作用力變化有關，說明配合后多糖結構發生了變化[36]。

圖2 WPEP 與WPEP-Zn 的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of WPEP and WPEP-Zn

2.4 XRD 分析

WPEP、WPEP-Zn 的XRD 掃描結果如圖3 所示。WPEP 與WPEP-Zn 的衍射圖在2θ=21°處均有結晶度峰。在29.7°和30.6°時，WPEP 出現了兩個吸收波峰，且在角度為35°～42°時，WPEP 也有較小波峰出現，而WPEP-Zn 在此角度的波峰降低。在43°時，WPEP 與WPEP-Zn 均出現了一個小的特征峰，WPEP 峰值相對較高。結果表明，西番蓮果皮多糖經過與鋅的配合后，結晶區域和類型發生變化，相較WPEP，WPEPZn 的峰形變寬，峰形變圓鈍，配合后多糖的結晶度有所下降[37]。曾凡珂等[38]報道的荸薺皮多糖的XRD圖譜衍射峰主要集中在2θ為20°～30°范圍內，峰形與WPEP 和WPEP-Zn 接近，結晶程度低，溶解性和生物利用度較好。結晶度可能與溶解度呈負相關，溶解性越好，其相對結晶度越低[39]，相較WPEP，WPEPZn 結晶度有所下降，但由表1 可以看出WPEP 和WPEP-Zn 溶解性無顯著性差異，說明配合后的多糖仍主要以非定型的結晶態存在[37]。

圖3 WPEP 與WPEP-Zn 的XRD 衍射圖Fig.3 XRD patterns of WPEP and WPEP-Zn

2.5 SEM 分析

WPEP、WPEP-Zn 的SEM 掃描結果如圖4 所示。從圖4A、C 看出，WPEP 表面較為平整、光滑，結構緊密，表面積大，說明多糖的鏈聚集緊密。WPEP-Zn呈現蜂巢狀，表面有龜裂，粗糙不規整，說明多糖與鋅不僅存在配合，也有可能存在鋅的物理吸附[40]。從圖4B、D 可以看出WPEP 表面結構表現出不規則的片狀，WPEP-Zn 同樣為不規則的片狀結構但更均勻，可能是WPEP 與鋅離子配合后分子間作用力增加，結構分布發生改變，這與Zhou 等[31]的結果一致。表明鋅與WPEP 的配合不僅是在空間結構上改變了WPEP，還存在鋅的物理吸附現象，使得多糖表面結構發生明顯改變。

圖4 WPEP 與WPEP-Zn 的電鏡掃描Fig.4 Scanning electron microscope of WPEP and WPEP-Zn

2.6 熱重分析

WPEP，WPEP-Zn 的熱重實驗結果如圖5 所示。多糖結構和官能團差異會影響熱行為并影響溫度轉變。WPEP 在30～187 ℃時，失重率為19.08%，在此階段主要是失去多糖中的游離水；在187～250 ℃時，失重率為47.46%；在250～371 ℃時，失重率為12.73%；在371～389 ℃時，失重率為11.18%。WPEP-Zn 在30～222 ℃時，主要失去的是多糖的自由水，失重率為21.25%；在222～347 ℃時，失重率為50.49%，本階段多糖大量的受熱分解；在347～425 ℃時，多糖失重率為5.50%；在425～445 ℃時，失重率為8.33%，此后階段保持平穩。在熱重分析中可以看出，WPEP 比WPEP-Zn 先出現大幅度失重，WPEP 在187 ℃時開始大量分解，而WPEP-Zn 在222 ℃時開始大量分解，隨著溫度繼續升高，WPEP 與WPEP-Zn 再次出現較小幅度失重現象，最后，兩者分別在371 ℃和425 ℃時，徹底的被熱分解。說明了鋅的配合使得多糖熱穩定性有了顯著的提升，這與Bai 等[41]在大蒜多糖鋅的熱重分析中所得的結果一致。

圖5 WPEP 與WPEP-Zn 的熱重分析Fig.5 Thermogravimetric analysis of WPEP and WPEP-Zn

2.7 多糖的益生元作用分析

2.7.1 不同濃度的多糖對益生菌的增殖作用分析不同濃度多糖對4 種益生菌的益生元作用結果如圖6～圖9 所示。以OD570nm大小代表實驗菌體的生長狀況，在第36 h 比較不同質量濃度多糖對益生菌的促進增殖效果。如圖6～圖9 所示，可知WPEP和WPEP-Zn 對4 種益生菌促進增殖的最佳質量濃度分別為2%、2%、2%、3%和3%、2%、2%、2%。

圖6 不同濃度多糖對植物乳桿菌吸光度值的影響Fig.6 Effect of different concentrations of polysaccharides on OD value of Lactobacillus plantarum

圖7 不同濃度多糖對德式乳桿菌保加利亞亞種吸光度值的影響Fig.7 Effect of different concentrations of polysaccharide on OD value of Lactobacillus delbrueckii （subsp.） bulgaricus

圖8 不同濃度多糖對短乳桿菌吸光度值的影響Fig.8 Effect of different concentrations of polysaccharide on OD value of Lactobacillus brevis

圖9 不同濃度多糖對嗜熱鏈球菌吸光度值的影響Fig.9 Effect of different concentrations of polysaccharides on OD value of Streptococcus thermophilus

2.7.2 最佳質量濃度下的多糖對益生菌生長曲線的作用分析 分別以促進益生菌增殖的最佳質量濃度下的WPEP、WPEP-Zn 和FOS 作為碳源，以空白組為對照，繪制4 種益生菌的生長曲線，并在生長結束時間點進行顯著差異性分析，結果如圖10～圖13 所示。圖10 中可以看出，在植物乳桿菌生長穩定后，WPEP-Zn 組的OD570nm明顯高于空白組但低于WPEP組和FOS 組，四組間存在顯著差異（P＜0.05）。由圖11和圖12 可知，在德氏乳桿菌保加利亞亞種和短乳桿菌生長穩定后，WPEP-Zn 組的OD570nm稍高于空白組但兩組之間不存在顯著差異（P＞0.05），而WPEPZn 組的OD570nm均低于WPEP組和FOS 組且三組間相互存在顯著差異（P＜0.05）。從圖13 中可以看出，在嗜熱鏈球菌生長穩定后，WPEP-Zn 組的OD570nm明顯高于WPEP 組和空白組且存在顯著差異（P＜0.05），低于FOS 組且存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖10 最佳濃度多糖對植物乳桿菌生長曲線的影響Fig.10 Effect of optimum concentration of polysaccharide on growth curve of Lactobacillus plantarum

圖11 最佳濃度多糖對德氏乳桿菌保加利亞亞種生長曲線的影響Fig.11 Effect of optimum concentration of polysaccharide on growth curve of Lactobacillus delbrueckii （subsp.） bulgaricus

圖12 最佳濃度多糖對短乳桿菌生長曲線的影響Fig.12 Effect of optimum concentration of polysaccharide on growth curve of Lactobacillus brevis

圖13 最佳濃度多糖對嗜熱鏈球菌生長曲線的影響Fig.13 Effect of optimum concentration of polysaccharide on growth curve of Streptococcus thermophilus

在植物乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和短乳桿菌的生長曲線中可以看出，WPEP 組OD570nm明顯高于空白組與WPEP-Zn 組，證明WPEP 組對這3 種益生菌具有明顯的促進增殖作用；WPEP-Zn組僅在植物乳桿菌的生長曲線中OD570nm明顯高于對照組，表現出明顯的促進增殖作用，對另外2 種益生菌無明顯促進增殖作用，這可能與鋅在細胞外的濃度過高有關，使細胞的膜運輸降低[42]。在嗜熱鏈球菌的生長曲線中可以看出，WPEP 組OD570nm稍高于對照組但無顯著性差異，未表現出明顯的促進增殖作用；WPEP-Zn 組OD570nm明顯高于WPEP 組和空白組，說明WPEP 經過與鋅配合后，多糖結構的改變或鋅含量的增加對嗜熱鏈球菌的增殖具有更好的促進作用，具體作用機理有待進一步研究。

3 結論

本研究使用WPEP 與七水硫酸鋅配合得到WPEP-Zn，對其進行結構表征并探究其益生元作用。WPEP-Zn 相較配合前的總糖含量和糖醛酸含量分別從28.52%和72.03%降至23.26%和50.46%。配合后多糖仍具有三螺旋結構，結晶區域與類型以及表面特征發生了明顯的變化，熱穩定性明顯增加。WPEP 與鋅配合后結構的變化以及鋅含量的提升對植物乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和短乳桿菌的益生元作用下降，但對嗜熱鏈球菌的益生元作用有所提高，說明配合后多糖具備一定的益生元作用，對后續多糖補鋅劑的研究具有一定的推動作用。本研究證明了多糖與金屬鋅的配合具有可觀的發展潛力，為西番蓮資源利用提供了新的方向以及為新型多糖補鋅劑的發展提供了一定的理論依據。