楊梅單寧-酪蛋白復合膜的制備及性能評價

鄧霜琪，廖晶晶，吳海柱，楊若彤，鄭青狀，周曉劍

（西南林業大學，云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室，云南昆明 650224）

隨著“可食用包裝膜”概念的興起，蛋白質具有可食用性、良好成膜性和生物降解性，并且原料來源廣泛，是近年來食品包裝膜常用的天然高分子聚合物成膜材料[1-4]。酪蛋白（casein，CA）是牛奶中的主要成分，其結構中存在大量的脯氨酸肽，α-螺旋和β-折疊結構容易轉變成隨機卷曲結構[5]，不具有雙硫鍵，沒有明顯的二級結構和三級結構，因此，酪蛋白具有良好的水溶性、分散性和成膜性[6-7]。酪蛋白膜主要通過蛋白質分子鏈中不同氨基酸通過蛋白質分子鏈間形成氫鍵、離子鍵、疏水鍵等作用下，依靠的作用力構建膜的網狀結構，形成具有一定力學強度和阻隔性能的薄膜[8]。然而，由于親水基團的存在，純酪蛋白膜存在水蒸氣透過率高和力學性能不高等問題，極大限制了酪蛋白膜的應用[9-10]。交聯改性是提高蛋白膜綜合性能效果最為有效的方法之一，其中，醛類交聯劑（甲醛、乙二醛、戊二醛、雙醛淀粉等）使用最為廣泛[11]，但未反應的醛基具有很強的細胞毒性；天然產物中提取的京尼平和轉谷氨酰胺酶等交聯劑安全有效[12-13]，但其價格昂貴，難以推廣使用。

單寧是維管束植物進化過程中衍生出來的一種自身保護性的次生代謝物，是可以與生物堿、明膠和其它蛋白質發生沉淀的水溶性多酚化合物，分子量通常為500～3000 kDa[14-15]。其廣泛存在于植物的樹皮、根、葉、花和果等組織中，在樹皮中含量尤為豐富，許多針葉樹皮中單寧的含量高達20%～40%。單寧的存在可以幫助植物抵抗陽光引起的紫外線損傷和植物體內的氧化應激，防止有害自由基破壞細胞結構，保護植物免受細菌和真菌的感染[14,16]。由于單寧的酚羥基結構所帶來的諸如抗氧化性、抗菌性、屏蔽紫外光等生物活性，使其在食品包裝等領域備受關注[17-18]。

單寧與蛋白的相互作用機制是單寧的重要研究方向之一，早期的研究認為單寧與蛋白的結合為非共價鍵，單寧在疏水鍵的驅動作用下向蛋白質分子表面靠近，并在進入疏水袋后，與蛋白質的H-受體位點和多酚的羥基基團之間發生多點氫鍵結合，其他反應如離子鍵發生在蛋白質帶正電荷的基團（如賴氨酸的ε-氨基）和多酚帶負電荷的羥基之間。在改變溶液環境時，如在堿性條件下，單寧的苯環結構氧化，形成鄰苯醌或者半-鄰苯醌的結構，單寧與蛋白質分子鏈間以共價鍵形式結合，可以有效的增強蛋白質分子鏈間的作用力[19-20]。由此可見，在單寧-蛋白膜的成膜過程中，蛋白在pH 的作用下，三維空間結構展開，亞基解離，原來埋藏在分子內部的部分疏水基團、巰基和二硫鍵等暴露出來，在熱力學作用下，單寧通過與蛋白質分子鏈形成非共價鍵和共價鍵，強化了蛋白質分子鏈間的作用力，進而形成更致密均勻的網絡結構[19-20]。單寧近年來常作為蛋白膜的天然多功能交聯劑，用于提高蛋白膜的力學強度和水蒸氣阻隔作用[21-25]，如橡樹單寧改性明膠膜[10]、黑荊樹單寧改性的纖維素膜[26]和大豆蛋白膜[24]等研究表明，改性后的薄膜不僅力學性能得到改善，還具有較好的抗氧化性和紫外線阻隔能力，可以延長食品的保質期[6]。由此可見，木材單寧抽提物在食品包裝領域極具應用前景[27-28]，但其改性酪蛋白膜的研究還非常有限。

楊梅單寧（BT）是我國最主要的商業單寧類型之一，來源廣泛，價格低廉。課題組前期的研究表明，楊梅單寧交聯改性大豆分離蛋白膜后，其力學性能和水蒸氣阻隔能力有明顯提升[29]。由于單寧和蛋白結構性能上的多樣性，單寧與不同蛋白相互作用力不同，將直接影響最終蛋白膜的性能[10]。為探究楊梅單寧對酪蛋白膜交聯改性作用的影響，本研究使用不同比例的楊梅單寧作為交聯劑，采用延流成膜的方式制備復合膜，并對楊梅單寧改性酪蛋白膜（BT-CA）的水蒸氣透過率、拉伸、抗氧化等性能進行探討，以期獲得安全環保、功能多樣化的酪蛋白復合膜，同時為楊梅單寧在酪蛋白膜中的應用提供實踐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白（CA） 純度90%，國藥集團化學試劑有限公司；楊梅單寧 純度72%，工業級，武鳴栲膠廠；丙三醇 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；DPPH（2,2-聯苯基-1-苦基肼基） 純度96%，上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉 分析純，成都市科龍化工試劑廠；無水氯化鈣 分析純，廣東光華科技股份有限公司。

JJ200 電子天平 常州奧華儀器有限公司；101電熱鼓風干燥箱 北京市永光明醫療儀器有限公司；BC801 埃維特數顯厚度儀 河南省邦特工量具有限公司；SUST5569 萬能力學試驗機 珠海市三思泰捷電氣設備有限公司；WFZUV-4802S 紫外分光光度計珠海市三思泰捷電氣設備有限公司；UH5300 紫外分光光度計 日本三立有限公司；Zeiss Sigma 300掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；TG209F1 熱重分析儀 德國耐馳公司；FE28 pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TENSOR27 傅里葉紅外紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薄膜的制備 首先，配制濃度為6wt%的CA水溶液，用2 mol/L 的氫氧化鈉溶液調節其pH 為11，在室溫下進行磁力攪拌至完全溶解。其次，將一定量的楊梅單寧加入到2 mL 蒸餾水中，搖勻。將楊梅單寧水溶液加入到CA 水溶液中，再加入丙三醇，繼續攪拌10 min，使其充分混勻后置于80 ℃水浴中加熱攪拌20 min 后取出，冷卻消泡后的成膜液靜置待用。將45 mL 成膜液澆鑄到尺寸為16.6 cm×26.6 cm 的特氟龍涂層金屬模具中，保持水平放置，在室溫下干燥48 h。干燥好的薄膜揭膜后放置于干燥器中儲存，用于薄膜性能的測試。薄膜制備配方如表1 所示，成膜樣品依次標記為C1、C2、C3、C4、C5，代表單寧的添加量分別為酪蛋白質量的0%、5%、10%、15%、20%。

表1 楊梅單寧改性酪蛋白膜的制備配方Table 1 Formulation for the preparation of BT-CA films

1.2.2 測試與表征

1.2.2.1 化學結構分析 膜的化學結構及相互作用力通過傅里葉紅外光譜儀采用衰減全反射模式（ATR）進行表征，掃描范圍為4000～600 cm-1，掃描次數為32 次，分辨率為4 cm-1。

1.2.2.2 厚度測定 采用隨機取樣法在薄膜樣品上隨機選取10 個點，使用測厚儀進行薄膜的厚度測量，取其平均值。

1.2.2.3 水溶性測定 將2 cm×2 cm 的薄膜樣品放置于105 ℃烘箱中干燥至恒重，然后精確稱重，計為m1（g），將稱重后的樣品浸入盛有50 mL 蒸餾水的培養皿中靜置24 h，將蒸餾水溶液過濾后，取出不溶物，在105 ℃下再次干燥至恒重，計為m2（g）。根據溶解前后的質量變化來計算蛋白膜的水溶性（WS），每組樣品平行測試5 次，計算公式如下：

1.2.2.4 不透明度測定 薄膜的不透明度使用紫外分光光度計UH 5300 在600 nm 掃描吸光度進行表征。薄膜樣品規格為4 cm×1 cm，放進調試好的儀器里測量吸光度，測定時樣品緊貼比色皿一側的內表面，每一樣品平行測量3 次，取平均值。不透明度通過公式（2）計算：

式中：A 為薄膜在600 nm 的吸光度（Abs）；x 是薄膜的厚度（mm）；結果表示為Abs/mm。

1.2.2.5 微觀結構研究 樣品裁成1 cm×4 cm 的條狀，使用掃描電子顯微鏡（SEM），加速電壓20 kV，使用液氮脆斷薄膜，并在橫截面上噴金后通過SEM 掃描觀察橫截面形貌。

1.2.2.6 水蒸氣透過率測定 薄膜的水蒸氣透過率用透濕杯法，在23 ℃、相對濕度90%±2%條件下進行，每隔12 h 將測試杯取出，精確稱量測試杯質量的變化，通過公式（3）計算水蒸氣透過率（WVP）：

式中：W 為水增加量（g）；x 為膜厚（mm）；A 為膜面積（mm2）；Δp 為水蒸氣壓差（Pa）；t 為時間（s）；水蒸汽壓根據測試時的溫度取值。

1.2.2.7 拉伸力學性能測試 薄膜需裁成條狀試件規格為2 cm×16 cm，使用萬能力學試驗機根據國標《塑料 拉伸性能的測定 第三部分：薄膜和薄片的試驗條件》 GB/T 1040.3-2006 進行測試。調試測試距離為50 mm，拉伸速率為50 mm/min，測試的環境溫度為23 ℃，濕度45%～55%。每個樣品重復5 次。

1.2.2.8 熱穩定性 稱取5～10 mg 薄膜碎片于坩堝內，使用熱重分析儀進行測試，檢測時采用氮氣（N2）保護，測試溫度范圍30～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.2.2.9 抗氧化活性 薄膜的抗氧化活性通過DPPH自由基清除能力進行測定，將0.1 g 薄膜樣品置于10 mL 的蒸餾水中攪拌30 min，所得水溶液備用。取4 mL 0.15 μmol/L 的DPPH 乙醇溶液與1 mL 制備好的水溶液，避光靜置反應30 min。測量反應后的溶液在紫外分光光度計517 nm 處的吸光度值，重復三次試驗取平均值[30]。自由基清除率（RSA）通過以下公式（4）計算：

式中：A1為樣品水溶液在517 nm 處吸光度 （Abs）；A0為乙醇水溶液在517 nm 處吸光度（Abs）。

1.3 數據處理

每項測定至少重復3 次，數據用均值±標準差表示，差異的顯著性采用SPSS 26 檢驗，當P＜0.05 時，均值被認為具有統計學意義，數據繪制軟件采用Origin 2018。

2 結果與分析

2.1 楊梅單寧-酪蛋白復合膜可能存在的非共價鍵作用及紅外光譜分析

酪蛋白在單寧的交聯作用下如圖1，交聯的非共價鍵作用有氫鍵（主要）、疏水作用、離子鍵（次要），通常這三種作用是協同進行：單寧羥基與蛋白質中的羰基和肽鍵結合氫鍵；疏水鍵則是由單寧上的非極性芳香環與疏水性氨基酸蛋白質殘基作用形成；離子鍵則是帶正電荷的氨基基團與帶負電荷的羥基基團作用形成[31]。

圖1 楊梅單寧-酪蛋白復合膜可能存在的非共價鍵作用Fig.1 Cross-linked (non-covalent) interaction between Chinese bayberry tannin and casein

圖2 為楊梅單寧改性酪蛋白膜的紅外光譜圖。在純酪蛋白膜C1 的紅外光譜中，位于3227 cm-1的寬峰為N-H 和O-H 的伸縮振動特征峰。2987 cm-1和2885 cm-1為亞甲基-CH2的伸縮振動峰。典型的蛋白質特征吸收帶為：酰胺I 帶（C=O 的伸縮振動峰）位于1638 cm-1；酰胺II 帶（N-H 彎曲振動峰）位于1552～1558 cm-1；酰胺III 帶（C-N 的伸縮振動峰和N-H 的彎曲振動峰）位于1236～1238 cm-1。經楊梅單寧改性后，BT-CA 復合膜的酰胺I、酰胺II 和酰胺III 帶的峰谷位置都發生不同程度的偏移，這一現象與前人單寧改性酪蛋白膜、大豆分離蛋白膜是研究結果一致[9,32]，研究結果推測單寧可能通過氫鍵、疏水鍵、離子鍵等化學鍵與酪蛋白反應，增強了酪蛋白分子鏈間的作用力。

圖2 楊梅單寧改性酪蛋白膜的FT-IR 光譜圖Fig.2 The FT-IR spectroscopy of BT-CA films

2.2 BT-CA 復合膜的厚度、水溶性和不透明度

表2列出了不同比例楊梅單寧改性酪蛋白膜（BTCA 復合膜）的厚度和水溶性值。隨著單寧的加入，成膜液的濃度略有提高，因此，BT-CA 復合膜的厚度有不同程度增加。BT-CA 復合膜的水溶性隨著單寧含量的增加呈先減后增的趨勢。與其它單寧交聯改性蛋白膜的現象類似[9,21]：形成難溶于水的復合物，水溶性下降。然而隨著單寧含量的增加，與酪蛋白以弱鍵連接或游離的單寧析出，導致水溶性增加。

表2 楊梅單寧改性酪蛋白膜的厚度和水溶性Table 2 Thickness and water solubility of BT-CA films

如圖3 所示，楊梅單寧改性酪蛋白膜不透明度的變化受到單寧添加量的影響。隨著單寧量的增加，BT-CA 復合膜的不透明度顯著升高。和純蛋白膜C1 相比，BT-CA 復合膜會表現出更暗淡的顏色，薄膜顏色逐漸加深，這是因為：一方面，添加的酚類氧化成醌類物質，使薄膜顏色變暗、透明度下降；另一方面，添加酚類物質后，光會被交聯結構散射或折射產生較暗沉的視覺感受，這與前人的研究結果相吻合[9]。不透明度的升高導致光線透過率降低，在具有避光性功能需求的包裝薄膜領域有較好的應用前景。

圖3 楊梅單寧改性酪蛋白膜的不透明度和宏觀圖片Fig.3 The opacity and optical image of BT-CA films

2.3 拉伸性能

圖4為楊梅單寧改性酪蛋白膜的拉伸強度及斷裂伸長率。純酪蛋白膜（C1）的拉伸強度為3.88 MPa，斷裂伸長率為164.1%，圖4 中可觀察到BT-CA 復合膜（C2、C3、C4）的拉伸強度隨單寧添加量增加而提高，其中C4 拉伸強度最佳為6.63 MPa，斷裂伸長率稍微下降為140.4%，綜合性能較好。這一現象產生的原因可能是單寧通過氫鍵、疏水鍵及可能存在的共價鍵，提高了酪蛋白膜分子鏈間的相互作用力，并且酪蛋白特有的開放結構有利于肽鏈上的羰基和多酚羥基間形成氫鍵，酪蛋白中的脯氨酸含量高，這種環狀的亞氨基酸可以與單寧芳環間形成更多的疏水鍵，進而薄膜形成更為穩固的三維網狀結構，因此薄膜強度得到提升、力學性能得到可觀的改善[10]。與單寧酸改性酪蛋白的研究結果不同[9]，在單寧添加量達20%時，拉伸強度下降，這可能由于縮合單寧過量，導致未與酪蛋白形成復合物的單寧填充在薄膜的內部結構中，影響酪蛋白成膜時的內聚力[33]。此外，楊梅單寧分子量較大、聚合度高，羥基間的氫鍵作用、芳環的π-π 堆積作用，使得過量的單寧更容易在酪蛋白基材中聚集，導致薄膜存在不連續結構，影響拉伸強度[30,34]，這在后面的褶皺脆斷面形貌特征中可以得到驗證。單寧加入后，隨著酪蛋白分子鏈間交聯程度的提高，BT-CA 復合膜的斷裂伸長率下降，而C5 斷裂伸長率略有提高，可能是由于薄膜內部結構中存在過量的單寧類似于增強體，使得復合膜的斷裂伸長率有所提高[35]。

圖4 楊梅單寧改性酪蛋白膜的拉伸強度及斷裂伸長率Fig.4 Tensile strength and elongation at break of BT-CA films

2.4 微觀形貌

圖5為楊梅單寧改性酪蛋白膜在1000×（左圖）和2000×（右圖）放大倍數下的脆斷橫截面掃描電鏡圖。由圖5 可見，楊梅單寧加入后，BT-CA 復合膜的脆斷橫截面保留了酪蛋白膜致密的內部結構，未出現分層現象。說明在成膜過程中，單寧與酪蛋白通過氫鍵、疏水鍵、共價鍵等化學鍵的交聯作用與酪蛋白形成復合物，并在成膜過程中，依靠分子間作用力形成致密的微觀結構，兩者具有良好的相容性[36]。除C5外，BT-CA 復合膜的斷面較為光滑，特別是C3 和C4的脆斷橫截面致密，說明10%～15%的楊梅單寧與酪蛋白間的交聯作用及BT-CA 復合物間的分子間作用力最強，這與C3 和C4良好的拉伸性能相互印證。而C5 脆斷截面呈褶皺狀，這是由于單寧過量聚集在復合膜內部結構中，導致復合膜存在不連續的弱界面結構造成的[37]。

圖5 楊梅單寧改性酪蛋白膜的脆斷截面掃描電鏡圖Fig.5 SEM micrographs of fractured cross-sections for BT-CA films

2.5 水蒸氣透過率

水蒸氣透過率（WVP）指水蒸氣可以通過薄膜擴散的能力，圖6 中隨著單寧添加量的增加，BT-CA 復合膜的水蒸氣透過率下降。由圖6 可見，僅5%的楊梅單寧即可減少酪蛋白膜的水蒸氣透過率50%，說明單寧的交聯作用可以顯著提高酪蛋白膜的水蒸汽阻隔性能，這與許多單寧改性蛋白膜的研究結果類似[10,34]。從復合膜的掃描電鏡圖看，楊梅單寧與酪蛋白形成致密的微觀結構可以抑制水蒸氣透過薄膜，尤其是C4、C5 的表現更為優異，添加單寧量達15%以上時，過剩的單寧填充在酪蛋白膜的孔隙中，使得水分子透過薄膜的通道更為曲折，因此水分子透過薄膜的難度增加，進一步降低水蒸氣透過率[34,38]。

圖6 楊梅單寧改性酪蛋白膜的水蒸汽透過率Fig.6 The water vapor permeability of BT-CA films

2.6 熱穩定性

圖7為楊梅單寧改性酪蛋白膜的熱失重曲線圖。由TG 曲線圖可見，薄膜的熱失重曲線可以分為三個階段：30～100 ℃范圍內的失重主要源于薄膜中吸附的游離水揮發；150～250 ℃范圍內的失重主要為增塑劑丙三醇化合物與結合水的受熱揮發；300～400 ℃范圍內的失重是由于酪蛋白分子鏈斷裂，薄膜穩定結構逐漸分解[9]。BT-CA 復合膜在第一階段的失重率比純酪蛋白膜低，說明單寧通過與酪蛋白分子鏈的交聯作用降低了酪蛋白的親水基團含量，并且交聯結構提高了薄膜分子鏈間的作用力，降低了復合膜對環境中水分的吸附。從DTG 圖可知，酪蛋白膜經過楊梅單寧改性后，復合膜第三階段的最大失重速率溫度后移，失重速率減緩，說明單寧的交聯改性可以顯著減緩酪蛋白分子鏈斷裂，提高酪蛋白膜的熱穩定性。

圖7 楊梅單寧改性酪蛋白膜的TG 曲線（a）和DTG 曲線（b）Fig.7 TG curve (a) and DTG curve (b) of BT-CA films

2.7 抗氧化性能分析

圖8為單寧改性酪蛋白膜的DPPH 自由基清除率，自由基清除率可以間接反應薄膜的抗氧化性能。由圖8 可知，純酪蛋白膜具有一定自由基清除能力，這是由于酪蛋白的肽鏈中含有一些可以與自由基反應的氨基酸[39]。C2 的自由基清除率比純酪蛋白膜低，可能是堿性條件下，單寧的酚羥基氧化成醌，與酪蛋白肽鏈上的氨基反應，兩者形成穩固的復合物[19]，導致缺少捕捉自由基的氫供體，自由基清除率下降。隨著楊梅單寧含量的提高（＞5%），以弱連接鍵酪蛋白的單寧含量增加，單寧容易從薄膜中釋放，因此，BTCA 復合膜的自由基清除能力增強。特別是C4 和C5，填充在復合膜中的過剩單寧遇水迅速溶解，從薄膜中釋放，與自由基反應。

圖8 楊梅單寧改性酪蛋白膜的DPPH 自由基清除率Fig.8 DPPH radical scavenging performance of BT-CA films

3 結論

將楊梅單寧作為交聯劑，采用溶液流延法，制備了單寧改性酪蛋白復合膜。通過紅外光譜分析發現單寧通過氫鍵、疏水鍵、離子鍵等化學鍵與酪蛋白反應，增強了酪蛋白分子鏈間的作用力。在拉伸力學測試中，當楊梅單寧的添加量為15%，復合膜拉伸強度達到最大值6.63 MPa，明顯高于純酪蛋白薄膜。熱重分析、水蒸氣透過率、不透明度和抗氧化性測試表明，單寧與酪蛋白的交聯可以明顯的提升酪蛋白復合膜的熱穩定性和水蒸氣阻隔能力、降低膜的透明度。根據觀察SEM 電鏡圖，單寧交聯改性后的復合膜具有致密的微觀結構。綜上所述，適量楊梅單寧的加入能改性酪蛋白膜且添加量在15%時復合膜的性能效果較佳，賦予膜材料一定的功能特性，因此在包裝薄膜領域具有一定的應用潛力。