蕨菜多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)表征與抗氧化活性研究

劉 恒，張秀玲，李 坤，薄艷秋，李佳旭

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

蕨菜（Pteridium aquilinumvar.latiusculum），又名拳頭菜、龍頭菜，目前主要產(chǎn)于長(zhǎng)江流域及以北地區(qū)[1]。蕨菜營養(yǎng)豐富、口感爽脆、藥食兩用，日常生活中經(jīng)常食用可以起到降血壓、緩解頭暈失眠等癥狀的作用，還可以增強(qiáng)免疫能力，預(yù)防流感[2]。

蕨菜多糖是蕨菜的主要組成成分之一，多糖具有免疫調(diào)節(jié)[3-4]、抗腫瘤[5]、抗病毒[6]、抗氧化[7]、降血糖[8]及降血脂[9]等藥理作用。近些年來對(duì)蕨菜中化學(xué)成分的研究主要集中在黃酮[10]、多酚[11]、甾醇[12]以及原蕨苷[13]等物質(zhì)。而對(duì)蕨菜多糖研究較少，且對(duì)其系統(tǒng)性的分離純化和結(jié)構(gòu)表征，尤其是對(duì)其空間結(jié)構(gòu)和糖苷鍵類型的研究較少。

近些年來，研究人員常用的多糖提取方法包括熱水浸提法、酸（堿）提取法、酶解提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等，也有將以上提到的兩種提取方法結(jié)合用于提取多糖[14]。超聲輔助提取法作為一種有效提取生物活性成分的方法，已經(jīng)得到了研究人員廣泛的研究。超聲輔助提取利用溶劑中聲空化的形成和不對(duì)稱微泡的塌陷所產(chǎn)生的空化效應(yīng)，釋放出大量的能量，增強(qiáng)滲透和毛細(xì)效應(yīng)，促進(jìn)多糖向溶劑中的擴(kuò)散，提高提取率[15]。比起傳統(tǒng)的熱水浸提法，超聲輔助提取可以在更短的時(shí)間和更溫和的條件下獲得相同甚至更高的提取率[16]。Devshri 等[17]對(duì)比了超聲輔助提取法與熱水浸提法提取的夏塊菌多糖，結(jié)果表明超聲輔助提取的多糖最大產(chǎn)量為68.91%±1.54%，而熱水浸提法的產(chǎn)量?jī)H為28.36%±1.58%，且超聲提取多糖表現(xiàn)出更顯著的體外抗血糖活性。郝經(jīng)文等[4]采取超聲輔助提取法提取蕨菜多糖，獲得了具有高抗癌活性的蕨菜多糖。因此，超聲提取法可以有效提取，保持其生物活性。

本試驗(yàn)采用超聲輔助提取的方法，對(duì)蕨菜多糖進(jìn)行提取，并用Sevage 法、大孔樹脂、透析法進(jìn)行純化，較為全面地測(cè)定了蕨菜多糖的理化性質(zhì)，采用高碘酸氧化、碘-碘化鉀試驗(yàn)、剛果紅試驗(yàn)等方法對(duì)蕨菜多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，測(cè)定了蕨菜多糖的體外抗氧化能力，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用蕨菜資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕨菜干 購自黑龍江省北安農(nóng)墾天運(yùn)山產(chǎn)品有限公司；透析袋（截留分子量2000 Da） 購自上海源葉生物科技有限公司；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖標(biāo)準(zhǔn)品 購自美國Sigma 公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；剛果紅染料 購自上海源葉生物科技有限公司；氯化亞鐵 購自天津市富宇精細(xì)化工研究所。

LGJ-1A-50 真空冷凍干燥機(jī) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；Tu-1810 紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；IR-Tracer-100 島津傅里葉變換紅外光譜儀、LC-20AD 島津高效液相色譜儀、LC 20 AT 島津單泵高效液相色譜儀 日本島津公司；INFINITE M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀 帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；S450 小型粉碎機(jī) 購自浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司；GS-100A 多功能超聲波清洗儀 購自深圳歌能清洗設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蕨菜多糖的提取及純化 參考華智銳等[18]的方法以及前期試驗(yàn)工作。用粉碎機(jī)將干燥的蕨菜粉碎，過80 目篩，收集粉末，用石油醚浸泡24 h。將預(yù)處理好的蕨菜粉按料液比1:40 的比例加水混合，25 ℃，540 W 超聲提取45 min。超聲后離心收集上清液濃縮。加入3 倍體積的乙醇，在4 ℃下醇沉12 h。然后將沉淀復(fù)溶，加入Sevage 溶液（氯仿:正丁醇=4:1）除蛋白，重復(fù)至無沉淀，旋蒸去除殘留的有機(jī)溶劑。采用濕裝法將D-101 大孔樹脂進(jìn)行灌柱，用約5 倍體積的雙蒸餾水進(jìn)行滲透清洗。用0、20%、40%、60%、80%和100%體積的乙醇溶液、洗脫速率3 BV/h 分步洗脫大孔樹脂純化蕨菜多糖，并將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥。D-101 大孔樹脂過濾，去離子水透析24 h，-10～-50 ℃凍干。

1.2.2 化學(xué)成分測(cè)定 蕨菜多糖的總糖含量采用苯酚-硫酸法[9]，以不同濃度葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0053x+0.7443（R2=0.9974）。將1 mL 1.0 mg/mL 蕨菜多糖溶液與濃硫酸和苯酚溶液混合，在490 nm 處測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法[19]，配制不同濃度的牛血清血蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0132x+0.2784（R2=0.9997）。將1 mL 1.0 mg/mL蕨菜多糖溶液與5 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液混合，靜置5 min 后在595 nm 處測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

總酚含量采用福林-酚比色法[20]，配制不同濃度的沒食子酸溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=5.3929x+0.0486（R2=0.993）。加入0.5 mL Folin-酚試劑、1.5 mL 15%碳酸鈉溶液，75 ℃水浴15 min，測(cè)定760 nm 處吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

黃酮含量采用分光光度計(jì)法[21]，配制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.763x+0.03（R2=0.993）。加入1 mL 50 g/L NaNO2溶液，混勻后靜置6 min；再加入1 mL 10% Al（NO3）3溶液，同樣靜置6 min；最后加入10 mL 100 g/L NaOH 溶液，靜置15 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

硫酸根含量采用氯化鋇-明膠法[22]，加入0.2 mL 1.0 mg/mL 蕨菜多糖溶液，然后加三氯乙酸3.8 mL和氯化鋇溶液l mL 混勻，靜置25 min 后于360 nm測(cè)定吸光度。

糖醛酸含量采用間羥基聯(lián)苯比色法[23]，取樣品5 mg 置100 mL 容量瓶加水溶解定容至刻度。取溶液1.00 mL 于10 mL 試管，置冰水浴中，加入四硼酸鈉/硫酸溶液6 mL，待全部加完后，用旋渦混合器混勻，沸水浴中加熱5 min，在冰水浴中冷卻后用微量加樣槍加入1.5 mg/mL 間羥基聯(lián)苯溶液100 μL，混勻后振搖5 min，525 nm 處測(cè)定吸光度。

1.2.3 單糖組成測(cè)定 采用島津單泵高效液相色譜儀測(cè)定單糖組成。精密稱取甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖對(duì)照品適量，加水溶解稀釋至每1 mL 中各含50 μg 的混合對(duì)照溶液。精密稱取蕨菜多糖約3.0 mg 至10 mL 安培瓶中，加入3.0 mL 2 mol/L 三氟乙酸（TFA）于10 mL 安瓿瓶中，封管，120 ℃酸解4 h。取出后加入甲醇，氮吹至TFA 揮發(fā)完全，加3.0 mL 水復(fù)溶。精確吸取250 μL 樣品溶液到5 mL EP 管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH，500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）-甲醇，70 ℃反應(yīng)1 h。于冷水中冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl 中和，再加入1 mL 氯仿漩渦1 min，3000 r/min 離心10 min，取上清液，分液漏斗萃取3 次。取上清液用于HPLC。

色譜條件：儀器：島津LC-20AD。色譜柱：Xtimate C18（4.6×200 mm，5 μm）。柱溫：30 ℃。流速：1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。進(jìn)樣量：20 μL。流動(dòng)相：0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用氫氧化鈉溶液調(diào)pH 為6.70）:乙腈=83:17。

1.2.4 蕨菜多糖分子量分布測(cè)定 采用島津LC-20AD 高效液相色譜儀測(cè)定蕨菜多糖的分子量。使用5 種分子量的葡聚糖（Mw 分別為6300、22000、49400、334000、642000 Da）進(jìn)行液相色譜分析。以保留時(shí)間（TR）為橫坐標(biāo)，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量的對(duì)數(shù)（lg Mw）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-0.6092x+13.747（R2=0.9772）。將蕨菜多糖配制成2 mg/mL 的溶液，通過0.22 μm 微孔膜后以同樣的條件進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.2.5 傅里葉紅外光譜分析 準(zhǔn)確稱取多糖樣品1.0 mg，干燥的KBr 150.0 mg 研磨混合均勻，在壓片機(jī)上用5～10×104KPa 壓力壓成透明薄片，用KBr 片做空白。利用紅外光譜儀進(jìn)行掃描，測(cè)定多糖樣品的紅外透過率，掃描范圍：400～4000 cm-1，分辨率：4 cm-1。

1.2.6 紫外光譜分析 將1.0 mg/mL 蕨菜多糖溶液在200～400 nm 波段下進(jìn)行紫外光譜掃描，觀察光譜中260 nm 和280 nm 有無吸收峰，檢測(cè)蕨菜多糖有無雜質(zhì)。

1.2.7 高碘酸氧化試驗(yàn) 在多糖的不同糖苷鍵類型中，1 mol 的非還原端或（1→6）位糖苷鍵被2 mol 高碘酸氧化并生成1 mol 甲酸，1 mol 的（1→2）、（1→4）位糖苷鍵被高碘酸氧化時(shí)，只消耗1 mol 高碘酸，不會(huì)生成甲酸，（1→3）位糖苷鍵則不能被高碘酸氧化。因此，測(cè)定高碘酸氧化過程中消耗的高碘酸鈉含量和生成的甲酸含量，可以計(jì)算得出不同糖苷鍵類型占比。

參考趙楚華[24]的試驗(yàn)方法有適當(dāng)修改。稱取0.6419 g 高碘酸鈉，去離子水定容至100 mL 容量瓶，制得NaIO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取NaIO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mL 置于試管中，去離子水補(bǔ)足至4 mL，混勻。再分別吸取100 μL，去離子水定容至25 mL 容量瓶，混勻后室溫靜置5 min，測(cè)定223 nm 處的吸光度。以吸光度值為y 軸，NaIO4濃度為x 軸，繪制NaIO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，NaIO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.0196x+0.5934（R2=0.9975），表明高碘酸鈉濃度在0～4 mmol/L 之間有良好的線性關(guān)系。

稱取20 mg 蕨菜多糖樣品，置于25 mL 容量瓶中，加入15 mL NaIO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，去離子水定容，渦旋混勻，置于4 ℃冰箱中反應(yīng)。每隔一段時(shí)間后，吸取100 μL 反應(yīng)溶液，置于25 mL 棕色容量瓶中，定容。測(cè)定223 nm 處的吸光度值，直至吸光度值穩(wěn)定不變，再向其加入1.5 mL 的乙二醇，終止反應(yīng)。根據(jù)制作的NaIO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蕨菜多糖消耗的NaIO4摩爾量。吸光度不變后，取一定體積反應(yīng)液，采用堿滴定法定量出反應(yīng)生成的甲酸。

1.2.8 剛果紅試驗(yàn) 剛果紅可與三股螺旋構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物，而絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)同剛果紅相比會(huì)發(fā)生紅移。而在NaOH 的濃度超過閾值的情況下，絡(luò)合物結(jié)構(gòu)被破壞，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯下降。因此，根據(jù)最大吸收波長(zhǎng)的紅移和降低情況，可以判斷多糖中是否具有三螺旋結(jié)構(gòu)。

參考楊艷敏等[25]的試驗(yàn)方法適當(dāng)修改。配置1 mg/mL 的蕨菜多糖溶液，將1 mL 多糖溶液與2.5 mL 的800 μmol/L 剛果紅溶液（0.02787 g 溶于50 mL）以及0.5 mL 蒸餾水渦旋混勻，然后加入4 mL不同濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L）的NaOH 溶液，得到最終濃度為0～0.35 mol/L。然后在200～800 nm 波長(zhǎng)下觀察最大吸收波長(zhǎng)的變化。

1.2.9 碘-碘化鉀反應(yīng) 取2 mL 多糖樣品溶液與1.5 mL 碘試劑（含0.02% I2的0.2% KI）混勻，用紫外可見光光度計(jì)在300～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行波譜掃描[26]，確定蕨菜多糖的支鏈化程度。

1.2.10 抗氧化能力分析

1.2.10.1 DPPH 自由基清除能力 配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的蕨菜多糖溶液，分別吸取1 mL 蕨菜多糖溶液加入到1 mL 濃度為200 μmol/L 的DPPH-乙醇溶液中。混合均勻后在25 ℃下反應(yīng)25 min。吸取200 μL 至96 孔板中，在517 nm 處測(cè)定吸光度。記錄加入蕨菜多糖的吸光度為A1，以無水乙醇代替DPPH 的吸光度為A2，以蒸餾水代替蕨菜多糖溶液的吸光度為A0。按式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除率[27]。

1.2.10.2 ABTS+自由基清除能力 將7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液等體積混合，制成ABTS 母液。室溫避光貯藏12～16 h 后，加入無水乙醇稀釋，調(diào)整到734 nm 處的吸光值為0.7 左右，待用。配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的蕨菜多糖溶液，吸取100 μL 蕨菜多糖溶液至96 孔板，再加入100 μL 稀釋之后的ABTS工作液混合，37 ℃避光條件震蕩反應(yīng)6 min，測(cè)定其于734 nm 處吸光值。記錄加入蕨菜多糖的吸光度為A1，以無水乙醇代替ABTS 的吸光度為A2，以蒸餾水代替蕨菜多糖溶液的吸光度為A0。按式（2）計(jì)算ABTS 自由基清除率[28]。

1.2.10.3 FRAP 還原能力 將乙酸鹽緩沖液（0.3 mol/L，pH3.6），TPTZ-鹽酸溶液（10 mmol/L）和三氯化鐵溶液（20 mmol/L）按10:1:1 均勻混合，制成FRAP 工作溶液，避光貯藏，使用前于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱。配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的蕨菜多糖溶液，吸取100 μL 蕨菜多糖溶液，加入1.2 mL FRAP 工作液，混合均勻于37 ℃下避光孵育4 min。反應(yīng)結(jié)束后，于593 nm 處測(cè)定其吸光值。以甲醇為空白對(duì)照，Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3.5455x+0.087，R2=0.9967[29]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2013 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；通過IBM SPSS Statistics 22.0 進(jìn)行單因素分析（ANOVA）；采用Origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕨菜多糖成分分析

表1是蕨菜多糖的成分組成。由表可知，蕨菜粗多糖的提取率為8.91%，純化后的總糖含量約為76.95%，未檢測(cè)到蛋白質(zhì)成分，少量的總酚（1.03%）和黃酮（1.90%）物質(zhì)。此外，蕨菜多糖還含有29.26%的糖醛酸成分。

表1 蕨菜多糖成分分析Table 1 Analysis of polysaccharide composition of bracken

2.2 單糖組成

對(duì)單糖標(biāo)準(zhǔn)品和蕨菜多糖分別進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1、2 所示。圖1 顯示在此條件下單糖標(biāo)準(zhǔn)品分離完全，色譜圖結(jié)果可信。蕨菜多糖的高效液相色譜如圖2 所示。對(duì)比圖1 可得，蕨菜多糖主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖10 種單糖組成，其摩爾百分比如表2 所示，為9.92:5.34:1.98:11.22:9.66:5.33:19.90:11.43:4.88:20.29。可以看到蕨菜多糖樣品中含量最多的單糖為巖藻糖和半乳糖，分別為20.29 mol%和19.90 mol%，其次則是木糖和葡萄糖醛酸，鼠李糖含量最少，為1.98 mol%。在甘露糖和核糖中間出現(xiàn)了一個(gè)峰，但未找到與之對(duì)應(yīng)的單糖對(duì)照，推測(cè)可能為與單糖分子量相近的代謝產(chǎn)物。在居先艷[30]的研究中，發(fā)現(xiàn)蕨菜多糖由7 種單糖組成。而在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蕨菜多糖由10 種單糖組成，最主要的差別在于本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蕨菜多糖的單糖組成中含有葡萄糖醛酸與半乳糖醛酸，這可能是蕨菜原料的產(chǎn)地和提取方式不同所導(dǎo)致的[31]。

表2 蕨菜多糖的單糖摩爾比Table 2 Monosaccharide molar ratio of bracken polysaccharide

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC 圖Fig.1 HPLC profile of the mixed standard solution

圖2 蕨菜多糖溶液的HPLC 圖Fig.2 HPLC chart of bracken polysaccharide solution

2.3 多糖分子量分布

對(duì)蕨菜多糖樣品進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，結(jié)果如圖3 所示，由結(jié)果可得蕨菜多糖只有一個(gè)最大吸收峰，保留時(shí)間為15.556 min。代入回歸方程，可知蕨菜多糖的Mw 約為1.86×104Da。

圖3 蕨菜多糖溶液的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of bracken polysaccharide solution

2.4 紅外光譜

圖4為蕨菜多糖的傅里葉紅外光譜圖。由圖分析可知，3396.64 cm-1處有一吸收峰，為O-H 的伸縮振動(dòng)；2922.16 cm-1處的吸收峰為飽和的C-H 伸縮振動(dòng)；在1643.35、1442.75 和1404.18 cm-1處的幾個(gè)吸收峰是羰基C=O（-COOH）的伸縮振動(dòng)，這表明蕨菜多糖中含有糖醛酸，為酸性多糖[32]，與化學(xué)成分測(cè)定的結(jié)果相符。在1000～1200 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰則顯示了C-O-C 和C-O-H 鍵的存在，這是吡喃糖的特征峰[33]。另外，在806.25 cm-1處的吸收峰是α-吡喃糖的標(biāo)志，以及619.15 cm-1附近有吸收峰說明含有一定量的β-吡喃糖[34]。由紅外光譜可得，蕨菜多糖含有多糖典型的吸收峰，并含有較高的糖醛酸。

圖4 蕨菜多糖的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of bracken polysaccharide

2.5 紫外光譜

由圖5 可以看出，蕨菜多糖在波長(zhǎng)260 和280 nm處均無特征峰，表明蕨菜多糖不含核酸和氨基酸成分。

圖5 蕨菜多糖的紫外吸收光譜Fig.5 UV absorption spectrum of bracken polysaccharide

2.6 高碘酸氧化

在約72 h 開始，223 nm 下的吸光度開始平穩(wěn)，說明蕨菜多糖中的糖苷鍵與高碘酸已經(jīng)反應(yīng)完全。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線與酸堿滴定的結(jié)果，如表3 所示，1 mol 己糖當(dāng)量的蕨菜多糖消耗了1.34 mol 的NaIO4并產(chǎn)生了0.4806 mol 甲酸。計(jì)算可得蕨菜多糖中含有37.88%的非還原端或（1→6）位糖苷鍵，含48.06%的（1→2）、（1→4）位糖苷鍵，以及14.06%（1→3）位糖苷鍵。

表3 高碘酸氧化結(jié)果Table 3 The results of periodic acid oxidation

2.7 剛果紅試驗(yàn)

蕨菜多糖與剛果紅在氫氧化鈉溶液中最大波長(zhǎng)吸收的變化如圖6 所示。在0～0.35 mol/L 的NaOH濃度范圍內(nèi)，加入剛果紅染料后的蕨菜多糖溶液最大吸收波長(zhǎng)隨著NaOH 濃度增加并未發(fā)生明顯紅移，表明蕨菜多糖不存在三股螺旋構(gòu)象。有研究表明，只有多糖的分子量大于9×104Da，才能形成三螺旋結(jié)構(gòu)[35]。而試驗(yàn)得出，蕨菜多糖的分子量約為1.86×104Da，并且沒有三螺旋結(jié)構(gòu)，為上述研究提供了部分佐證。

圖6 蕨菜多糖與剛果紅在不同NaOH 濃度下的最大吸收波長(zhǎng)Fig.6 The maximum absorption wavelength of bracken polysaccharide and Congo red at different NaOH concentrations

2.8 碘-碘化鉀反應(yīng)

蕨菜多糖溶液與碘-碘化鉀試劑混勻后進(jìn)行紫外可見光譜掃描，如圖7 所示，由圖可見，蕨菜多糖與碘-碘化鉀試劑的反應(yīng)物最大吸收峰在349 nm 處，而在565 nm 處無最大吸收峰，說明蕨菜多糖具有復(fù)雜的鏈狀結(jié)構(gòu)，其側(cè)鏈較長(zhǎng)、支鏈較多[36]。

圖7 蕨菜多糖的碘-碘化鉀反應(yīng)Fig.7 Iodine-potassium iodide reaction of bracken polysaccharide

2.9 體外抗氧化能力

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定對(duì)DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和FRAP 能力測(cè)定了蕨菜多糖的體外抗氧化能力，以Trolox 為陽性對(duì)照，結(jié)果如圖8、圖9、圖10 所示，蕨菜多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化能力。在0.5～2.5 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，ABTS+自由基清除能力從28.46%增加到92.61%，在濃度達(dá)到1.5 mg/mL 時(shí)，ABTS+自由基清除能力接近Trolox 陽性對(duì)照，而DPPH 自由基清除能力從54.39%增加到70.72%，始終弱于陽性對(duì)照。蕨菜多糖的FRAP 能力以Trolox 當(dāng)量表示，為40.15±1.40 mg/g。

圖8 蕨菜多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.8 The scavenging rate of bracken polysaccharide on DPPH free radicals

圖9 蕨菜多糖對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.9 The scavenging ability of bracken polysaccharide on ABTS+ free radicals

圖10 蕨菜多糖的鐵離子還原能力Fig.10 FRAP of bracken polysaccharide

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)蕨菜多糖進(jìn)行了分離純化，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征和體外抗氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，蕨菜多糖提取率為8.91%±0.26%，純化率為76.95%±0.69%，含有少量黃酮（1.03%±0.09%）、多酚（1.90%±0.12%），含有糖醛酸（29.26%±2.64%）；蕨菜多糖的Mw 約為1.86×104Da，主要由10 種單糖組成，分別是甘露糖（9.92 mol%）、核糖（5.34 mol%）、鼠李糖（1.98 mol%）、葡萄糖醛酸（11.22 mol%）、半乳糖醛酸（9.66 mol%）、葡萄糖（5.33 mol%）、半乳糖（19.90 mol%）、木糖（11.43 mol%）、阿拉伯糖（4.88 mol%）、巖藻糖（20.29 mol%）；含有37.88%的非還原端或（1→6）位糖苷鍵以及48.06%的（1→2）、（1→2,6）、（1→4）或（1→4,6）位糖苷鍵；無三股螺旋構(gòu)象；側(cè)鏈較長(zhǎng)、支鏈較多，鏈狀結(jié)構(gòu)復(fù)雜；蕨菜多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化能力，當(dāng)濃度為2.5 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除能力最強(qiáng)，清除率可達(dá)到92.61%，同時(shí)對(duì)DPPH 自由基的清除率為70.72%。本文研究結(jié)果對(duì)蕨菜資源的進(jìn)一步在醫(yī)藥和功能食品方向上的應(yīng)用提供依據(jù)，也對(duì)蕨菜多糖的藥理藥性研究提供了理論基礎(chǔ)。