超聲波輔助熬制三文魚骨湯的工藝優化及其滋味評價

劉華林，林登峰，趙洪雷，徐永霞, ，李學鵬，勵建榮，王明麗，季廣仁

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧錦州 121013；2.蓬萊京魯漁業有限公司，山東煙臺 265600；3.錦州筆架山食品有限公司，遼寧錦州 121007）

三文魚（Salmon salar）又稱大西洋鮭魚，屬于鮭亞科（Salmoninae）鮭屬（Salmon），是一種洄游性深海魚類，主要分布在大西洋、太平洋、北冰洋交接水域[1]。三文魚有很高的營養價值，被譽為“魚中至尊”，其肉質細嫩鮮美、口感爽滑，富含優質蛋白質、多不飽和脂肪酸、礦物質和維生素等營養物質，其中ω-3 高不飽和脂肪酸尤其是DHA 和EPA 對調節血脂、預防心腦血管疾病和保持腦組織健康有積極作用[2]。三文魚作為一種高經濟價值魚類，冰鮮和冷凍三文魚占據主要市場，食用方式以日式生魚片為主，但其加工過程中會產生大量的副產物，如魚皮、魚頭和魚骨等[3]，其中魚骨間仍保存部分魚肉。目前，這些加工副產物未得到充分利用，造成了很大的資源浪費，并帶來較大的環境負擔，因此，開展三文魚加工副產物的深加工和高值化利用已成為行業的迫切需求。

日本最早利用超微粉碎技術對魚骨進行加工，研制開發出骨松、骨味素、骨味汁等產品。近年來，有學者利用魚骨開發魚骨湯等海鮮調味基料，但研究還不夠系統和深入[4]。湯的傳統烹制方法主要是燉、煮、煨、煲等，其耗時長，且存在加熱不均勻等問題。為滿足消費者需求，超聲波和微波等新興技術逐漸被關注，其中超聲波作為一種新型綠色的非熱加工技術，具有穿透力強、能耗少、效率高、重復性好等特點[5]，其原理是利用超聲波與介質的機械作用，增加體系中的能量傳遞，造成空化效應、熱效應和機械效應[6-7]。近年來，超聲波輔助加熱技術在食品加工中的應用研究被廣泛關注。研究發現，超聲輔助加熱能夠提供良好的傳熱特性，縮短肉湯的燉煮時間，彌補傳統燉煮方式的不足[8]。此外，超聲輔助燉制會顯著影響雞湯的香味，且可以減緩脂質氧化[9]。SIEWE等[10]研究發現超聲輔助加熱可以顯著提升天然魚香調味料的魚香味和鮮味并能降低苦味。李璐等[11]研究表明超聲輔助加熱可以促進鯰魚魚頭湯中水溶性蛋白等營養物質的溶出。目前，超聲波在魚骨湯中的應用較少，關于超聲波輔助加熱對魚骨湯滋味特性及品質的影響研究鮮見報道。

本研究以三文魚骨為原料，采用超聲輔助加熱的方式熬制魚骨湯，以氨基酸態氮、可溶性蛋白質和感官評分為綜合評價指標，利用響應面法優化超聲輔助熬制工藝，并對不同熬制方式下魚骨湯的滋味輪廓、核苷酸和游離氨基酸的含量進行分析比較，研究旨在為超聲輔助熬制魚湯及利用水產加工副產物開發海鮮調味基料提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三文魚骨 錦州市林西街水產市場；食鹽 錦州市大潤發超市；甲醛 遼寧泉瑞試劑有限公司；酒石酸、磷酸二氫鉀 國藥集團化學試劑有限公司；高氯酸、氫氧化鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅等均為分析純，甲醇（色譜級）、IMP 標準品、AMP 標準品、GMP 標準品（純度均≥99%） 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

THC-1000SF 超聲波煎煮鍋 濟寧天華超聲電子儀器有限公司；UV-2550 紫外光譜儀 日本島津公司；Insent SA402B 電子舌 日本Insent 公司；Agilent 1260Infinity 高效液相色譜儀 美國Agilent 公司；FiveEasy Plus FE28 pH 計 上海梅特勒-托利多儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三文魚骨湯的制備 將三文魚骨清洗干凈后切成段，長度為5～6 cm，取大小均勻的魚骨200±15 g，裝入1 L 的蒸煮袋中，再加入適量的食鹽和水，密封后置于95 ℃超聲波煎煮鍋中熬煮一定時間，冷卻后過濾得到三文魚骨湯。以未經超聲處理熬煮的魚骨湯作為傳統加熱組。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 料水比對三文魚骨湯品質的影響 確定鹽添加量0.25%，超聲時間90 min，超聲功率600 W，考察不同料水比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 g/mL）對三文魚骨湯感官評分、可溶性蛋白質和氨基酸態氮含量的影響。

1.2.2.2 鹽添加量對三文魚骨湯品質的影響 確定料水比1:2 g/mL，超聲時間90 min，超聲功率600 W，考察不同鹽添加量（0、0.25%、0.5%、0.75%、1%）對三文魚骨湯感官評分、可溶性蛋白質和氨基酸態氮含量的影響。

1.2.2.3 超聲時間對三文魚骨湯品質的影響 確定料水比1:2 g/mL，鹽添加量為0.5%，超聲功率600 W，考察不同超聲時間（30、60、90、120、150 min）對三文魚骨湯感官評分、可溶性蛋白質和氨基酸態氮含量的影響。

1.2.2.4 超聲功率對三文魚骨湯品質的影響 確定料水比1:2 g/mL，鹽添加量為0.5%，超聲時間90 min，考察不同超聲功率（0、400、600、800、1000 W）對三文魚骨湯感官評分、可溶性蛋白質和氨基酸態氮含量的影響。

1.2.3 響應面優化試驗設計 根據單因素試驗結果，固定食鹽添加量0.5%，選擇料水比、超聲時間和超聲功率三個因素，利用Box-Behnken 設計原理，以可溶性蛋白質含量為響應值進行優化試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Box-Behnken test factors and levels

1.2.4 感官評定 參照王媛媛等[12]的方法并作適當修改，選擇8 名食品專業的研究生，經過感官培訓后對魚骨湯樣品進行感官評價，結果取平均值。具體感官評價標準如表2 所示。

表2 三文魚骨湯感官評分標準Table 2 Sensory evaluation criteria of salmon bone soup

1.2.5 氨基酸態氮和可溶性蛋白質含量的測定 魚骨湯中氨基酸態氮的含量參照GB 5009.235-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》采用甲醛滴定法進行測定。

參照張維等[13]的方法采用雙縮脲法測定魚骨湯中可溶性蛋白質含量，魚骨湯經200 目紗布過濾，在540 nm 波長下測定吸光度，結果取3 次測量的平均值。

1.2.6 電子舌測定 魚湯樣品于在7200 r/min（4 ℃）下離心15 min，取上清液稀釋10 倍后過0.22 μm 濾膜，然后取適量樣品于測試杯中，使用活化24 h 的電子舌傳感器進行測定。每次檢測120s，1 次/s，每個樣品循環測定4 次，取后3 次數據進行分析。

1.2.7 呈味核苷酸的測定 參考He 等[14]的方法并稍作修改。取5 mL 樣品加入15 mL 5%高氯酸，均質后離心（8000 r/min，10 min，4 ℃），取上清液備用，沉淀重復上述操作，合并兩次上清液，并用5 mol/L KOH 調整pH 至6.75，用0.22 μm 濾膜過濾，濾液用高效液相色譜進行定量分析。

色譜條件：C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫28℃；流動相：由（A）pH4.5，0.05 mol/L KH2PO4和（B）甲醇組成，流速0.8 mL/min。

1.2.8 游離氨基酸的測定 魚骨湯中游離氨基酸的含量參考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》進行測定。

1.3 數據處理

每組實驗3 次平行，利用Design-Expert 13 軟件對實驗結果進行響應面分析，采用Origin 9.0 軟件繪圖，利用SPSS 19.0 軟件進行數據處理和方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 料水比對魚骨湯可溶性蛋白質、氨基酸態氮和感官評分的影響 水的用量對魚骨湯的品質和出品率具有重要影響。料水比主要通過改變濃度差和滲透壓來影響原料中營養成分和呈味物質的溶出，合適的料水比有利于魚骨中的固形物向湯中遷移，從而達到豐富營養、提升湯的品質的目的[15]。如圖1 所示，隨著料水比的增加，氨基酸態氮的含量逐漸下降，說明增加水的含量會產生一定程度的稀釋作用。感官評分和可溶性蛋白質的含量隨料水比的增加呈先上升后下降的趨勢，其中可溶性蛋白含量的變化具有顯著性差異（P＜0.05），而感官評分的變化不顯著（P＞0.05），當料水比為1:2 時分別達到最大值，湯汁乳白清澈，滋味協調，無酸澀味。加水過少不利于營養成分和呈味物質的浸出，而加水過量則會降低溶出物的濃度，從而影響魚骨湯的風味。綜合考慮，選擇最佳料水比為1:2 g/mL。

圖1 料水比對魚骨湯氨基酸態氮、可溶性蛋白質和感官評分的影響Fig.1 Effects of material-water ratio on amino nitrogen, soluble protein and sensory score of fish bone soup

2.1.2 鹽添加量對魚骨湯可溶性蛋白質、氨基酸態氮和感官評分的影響 鹽被稱為百味之王，它在湯品加工中具有重要作用，加入適量的鹽不僅能提升湯的味道，還能促進原料中營養物質的溶出，提升湯的營養品質[16]。如圖2 所示，隨著鹽添加量的增加，感官評分先上升后下降（P＞0.05），當鹽添加量為0.5%時，魚骨湯的咸味和鮮味協調，感官評分最高；當鹽的添加量小于或大于0.5%時，魚骨湯的整體風味過淡或者過咸，口感單一，回甘不足。隨著鹽添加量的增加，魚骨湯中氨基酸態氮和可溶性蛋白質的含量呈逐漸上升的趨勢，說明鹽的添加能夠促進魚骨中蛋白質的溶出和降解，產生更多的游離氨基酸，賦予魚骨湯良好的營養和風味品質[17]。綜合考慮，選擇最佳鹽添加量為0.5%。

圖2 鹽添加量對魚骨湯氨基酸態氮、可溶性蛋白質和感官評分的影響Fig.2 Effects of salt content on amino nitrogen, soluble protein and sensory score of fish bone soup

2.1.3 超聲時間對魚骨湯可溶性蛋白質、氨基酸態氮和感官評分的影響 如圖3 所示，隨著超聲時間的延長，魚骨湯中氨基酸態氮、可溶性蛋白含量和感官評分先上升（P＜0.05），當超聲時間為90 min 時達到最大值；之后隨時間延長又逐漸下降。超聲波處理可以促進肌原纖維蛋白結構的斷裂，其具有的空化作用還會增加水的穿透力，從而加速魚骨中蛋白質、脂肪等物質的溶出速率，增加魚骨湯中可溶性蛋白質的含量，提升魚骨湯的整體風味和感官品質[18]。此外，超聲波處理會使水分子解離形成具有強氧化性的羥基自由基，促進蛋白質的降解，從而提高魚骨湯中游離氨基酸的含量。當超聲時間大于90 min 時，隨著時間的繼續延長，容易導致蛋白質降解或聚集[19]，從而使可溶性蛋白含量有所下降；此外，長時間的熬煮會使魚湯中的游離氨基酸和還原糖發生美拉德反應[20]，導致氨基酸態氮含量下降，同時魚骨湯的酸味和澀味也逐漸顯現。綜合考慮，選擇最優超聲時間為90 min。

圖3 超聲時間對魚骨湯氨基酸態氮、可溶性蛋白質和感官評分的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on amino nitrogen, soluble protein and sensory score of fish bone soup

2.1.4 超聲功率對魚骨湯可溶性蛋白質、氨基酸態氮和感官評分的影響 如圖4 所示，隨著超聲功率的增加，魚骨湯中氨基酸態氮含量逐漸上升；可溶性蛋白質含量和感官評分先上升（P＜0.05），在超聲功率為800 W 時分別達到最大值，之后隨功率增大又出現下降趨勢。這是因為超聲波的空化效應和細胞破碎作用隨超聲強度的增大而增強，使魚骨中蛋白質的溶出效率增強，從而提高魚骨湯中可溶性蛋白的含量[11]。此外，高功率的超聲處理對蛋白質結構的影響也會增大，促進更多的親水性氨基酸基團暴露在表面，從而增加魚骨湯中氨基酸態氮的含量[21]。感官評定結果表明，當超聲功率為800 W 時三文魚骨湯的感官品質最好。綜合考慮，選擇最佳超聲功率為800 W。

圖4 超聲功率對魚骨湯氨基酸態氮、可溶性蛋白質和感官評分的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on amino nitrogen, soluble protein and sensory score of fish bone soup

2.2 響應面優化實驗結果與分析

2.2.1 響應面優化試驗設計結果 通過單因素試驗，確定了各因素的水平范圍，并以料水比（A）、超聲時間（B）和超聲功率（C）為自變量，以可溶性蛋白質含量為因變量 ，采用Box-Behnken 設計進行響應面優化，試驗設計及結果如表3 所示。

表3 Box-Behnken 試驗設計結果Table 3 Box-Behnken test design and results

2.2.2 回歸方程顯著性檢驗 對響應面試驗結果進行擬合分析，得到可溶性蛋白質與各因素的二次回歸模型方程為：

對二次回歸方程進行顯著性檢驗，結果如表4所示，所得回歸方程的顯著性極高（P＜0.0001），回歸系數R2=0.9916，失擬項P=0.0515＞0.05，表明該模型擬合度較好，可信度高。由F值大小可知，各因素對魚骨湯中可溶性蛋白質含量的影響程度依次為超聲時間（B）＞超聲功率（C）＞料水比（A），同時表中AC 和BC 的P＜0.01，說明超聲功率與超聲時間、超聲功率與料水比有較強的相互作用，對魚骨湯中可溶性蛋白質含量的影響更加顯著。

表4 可溶性蛋白質回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression mode of soluble protein

2.2.3 響應曲面分析 響應面圖可以直觀的反映因素間的交互作用，等高線形狀接近于圓形，曲面坡度平緩，表明二者的交互作用弱；反之，等高線形狀接近于橢圓形，曲面坡度陡峭，表明兩者間的交互作用強[13]。由圖5 可以看出，超聲時間與超聲功率的相互作用最強，料水比一定時，可溶性蛋白質含量隨超聲時間和超聲功率的增加呈先上升后下降的趨勢，且曲面陡峭，等高線趨于橢圓形，表明超聲時間和超聲功率之間交互作用顯著；當超聲時間一定時，隨著料水比與超聲功率的增加，可溶性蛋白質含量先增加后降低，曲面坡度陡峭，其等高線形狀呈橢圓形，說明料水比與超聲功率之間的相互作用顯著。

圖5 因素交互作用對魚骨湯可溶性蛋白質含量的影響Fig.5 Effects of factors interaction on soluble protein content of fish bone soup

2.2.4 響應面試驗最佳工藝和驗證實驗 通過響應面分析得到超聲輔助加熱熬制三文魚骨湯的最優工藝參數為：料水比1:1.85 g/mL，超聲時間96.78 min，超聲功率825.57 W。結合實際可操作性，將最優工藝參數調整為：料水比1:2 g/mL，超聲時間96 min，超聲功率800 W，在此條件下進行3 次驗證實驗，得到魚骨湯的可溶性蛋白含量為192.30 mg/mL，感官評分為8.43，氨基酸態氮含量為0.036 g/100 mL。最佳工藝下的測定結果與模型預測值的相對誤差均＜5%，表明該模型優化得到的工藝條件具有可行性。

2.3 電子舌分析

電子舌是通過味覺傳感器對樣品的感官屬性進行分析，通過提取各傳感器的響應值建立了傳統加熱和超聲輔助加熱制備三文魚骨湯的滋味雷達圖，結果如圖6 所示。由圖6 可知，魚骨湯中酸味、咸味、澀味及其回味響應值均在無味點以下，說明其是無效的味覺評價指標[22]。鮮味、豐富度和苦味的響應值較高，是影響三文魚骨湯滋味的主要味覺指標，其中傳統加熱組魚骨湯的鮮味值、豐富度和苦味值分別為4.89、1.0 和4.58，超聲輔助加熱組的鮮味值和豐富度分別增加至5.8 和3.44，而苦味值下降至4.29。兩種方式下熬制的魚骨湯中苦味和澀味及其回味的差異不明顯。豐富度代表了樣品滋味的豐富程度和持久性，與鮮味物質的含量和種類密切相關，可見超聲輔助加熱促進了魚骨湯中呈鮮物質的溶出。咸味主要是由一些中性鹽離子產生的滋味，可在一定程度上增強其它味覺的感知，比如鮮味[23]。這可能是因為超聲輔助加熱促進了魚骨湯熬制過程中蛋白質的降解以及小肽、游離氨基酸和核苷酸等呈味物質的溶出，從而提升魚骨湯的風味品質[24]。

圖6 不同熬煮方式魚骨湯的滋味雷達圖Fig.6 Taste radar chart of fish bone soup by different cooking methods

2.4 呈味核苷酸分析

核苷酸及其關聯化合物是形成魚鮮味的重要組成成分，核苷酸和呈味氨基酸之間具有協同作用，兩者共存時能夠產生更強烈的鮮味[25]。由表5 可知，在三文魚骨湯中檢測出5'-GMP、5'-IMP 和5'-AMP 3 種呈味核苷酸，其中傳統加熱組中呈味核苷酸的總量為41.95 mg/100 mL，經超聲輔助加熱后呈味核苷酸總量增加至47.35 mg/100 mL，這幾種核苷酸含量的增加對于提升魚湯的鮮味有重要作用。由表可知，超聲波輔助熬制的魚湯中AMP 和GMP 的含量顯著高于傳統加熱組（P＜0.05），而IMP 的含量有所下降（P＞0.05）。研究表明，AMP 和IMP 主要是由三磷酸腺苷（ATP）的降解產生，AMP 能夠促進甜味的感知，IMP 是一種理想的風味增強劑，與魚骨湯中的游離氨基酸谷氨酸共存時具有增強鮮味的效果[26]。GMP 是IMP 轉化的產物，也具有較強的風味增強活性，且GMP 在增強產品風味方面的能力約是IMP 的2.3 倍[27]。超聲波輔助加熱能有效促進魚骨中三磷酸腺苷的降解[28]，從而使AMP 的含量升高；此外，超聲處理可能會促進IMP 的轉化，從而使其含量有所降低。

表5 不同熬煮方式對魚骨湯中呈味核苷酸的影響Table 5 Effects of different cooking methods on 5'-nucleotides of fish bone soup

2.5 游離氨基酸分析

游離氨基酸豐富的呈味特性與湯類滋味的形成密切相關[29]。圖7 為傳統加熱和超聲輔助加熱熬制的魚骨湯中游離氨基酸含量的聚類分析熱圖，可用來區分兩種不同加工方式下魚骨湯的游離氨基酸組成差異。由圖可見，三文魚骨湯中共檢測出11 種游離氨基酸，傳統加熱組中以具有苦味的Val、Ile 和賦予魚湯甜味的Gly、Ala、Ser 和Thr 為主，超聲輔助加熱組中鮮味氨基酸Asp、Glu 和苦味氨基酸His、Lys和Leu 的含量增加，可能是由于超聲的熱效應和空化作用加速了蛋白質的水解以及游離氨基酸向湯中的遷移。Glu、Gly、Ala 和Asp 是重要的風味氨基酸，特別是作為鮮味氨基酸的Glu 和Asp，對魚骨湯鮮美滋味的形成具有重要作用[14]。雖然超聲組魚湯中苦味氨基酸含量升高，但苦味氨基酸不具有味覺活性，且易被鮮味和甜味物質掩蓋，可能對魚骨湯的整體滋味影響較小[30]。

圖7 不同熬煮方式對魚骨湯中游離氨基酸的影響Fig.7 Effect of different cooking methods on free amino acids of fish bone soup

3 結論

本研究通過單因素和響應面試驗對超聲波輔助熱處理熬制三文魚骨湯的工藝進行優化，得到較佳的工藝參數為料水比1:2 g/mL、超聲時間96 min、超聲功率800 W，經重復性實驗驗證，得到此條件下三文魚骨湯的可溶性蛋白質含量為192.30 mg/mL，氨基酸態氮含量為0.036 g/100 mL，感官評分為8.43，與模型預測值之間的相對誤差為小于5%，說明此模型可靠性較高，有較強的實用性。電子舌和核苷酸分析結果顯示，與傳統加熱相比，超聲波輔助加熱能夠增強魚骨湯的鮮味強度、豐富度和咸味強度，降低酸味強度，增加魚骨湯中呈味核苷酸以及鮮味氨基酸的含量，提高三文魚骨湯的風味品質。