超聲波-微波輔助提取杜仲葉多糖工藝優化及其體外抗凝血活性分析

陳艷萍，賀菊萍，劉 意，楊萬根,,

（1.吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南張家界 427000；2.徐州工程學院江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇徐州 221018；3.吉首大學食藥兩用資源研究與高值化利用湖南省重點實驗室，湖南吉首 416000）

杜仲樹是我國的特有樹種，其葉在2018 年被列為我國的新食品原料。目前，我國的杜仲樹栽植面積已達35 萬hm2，在國內27 個省（區、市）均有栽植，杜仲葉資源非常豐富[1]；但我國對杜仲葉開發研究的時間還不長，目前主要產品是杜仲葉茶、動物飼料添加劑等初級加工產品，亟需對其開展深入研究，開發高附加值產品。現代研究發現，植物多糖往往具有抗腫瘤[2-3]、抗氧化[4]、抗凝血[5]、調節腸道菌群[6]等生物活性，而多糖也是杜仲葉的主要成分之一，因此開發杜仲葉多糖的研究正變得日益廣泛。

杜仲葉多糖開發面對的問題之一是如何快速提取。常用的植物多糖提取技術有熱水提取、超聲波、微波、酶輔助提取等。熱水提取以水為提取溶劑，耗時長、效率低。超聲波輔助提取是利用頻率大于20 kHz 的超聲波產生強大壓力、剪切力破壞細胞結構，加速多糖向水中擴散，提高提取效果。微波輔助提取是高頻電磁波使植物細胞內外的溫度快速上升，植物細胞內壓力超過細胞壁承受能力，細胞壁遭到破壞，其內的有效成分流出[7]。超聲波提取有強烈的物理破碎和混合傳質作用，但為提取溶液體系快速加熱的能力弱，而微波提取則相反，因此超聲波、微波輔助提取之間的互補性很強。近年出現了將兩種技術結合的超聲波-微波輔助提取技術，該技術呈現出高效、綠色等諸多優勢，如HU 等[8]將此技術應用于提取虎果仁油，提取率達到85.23%，JIANG 等[9]采用該技術從玉米麩皮中提取阿拉伯木聚糖，提取率達27.7%。目前還沒有發現超聲波-微波輔助提取技術在杜仲葉多糖提取中的應用研究。

因此，本文以杜仲葉多糖為研究對象，開展超聲波-微波輔助提取杜仲葉多糖工藝條件優化研究，并對所得精制多糖的單糖組成、分子量、體外抗凝血活性進行分析，旨在為我國豐富的杜仲葉資源的高值化利用提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 采摘于吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室杜仲基地；血漿 由湘西州人民醫院提供；石油醚（沸程30～60 ℃）、苯酚、濃硫酸、醋酸鈉、三氟乙酸、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；溴化鉀 Sigma-Aldrich 公司；葡萄糖標準品、肝素鈉 北京索萊寶科技有限公司；APTT、PT、TT 試劑盒 武漢中太生物技術有限公司；葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、鹽酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-果糖、D-核糖、氨基半乳糖鹽酸鹽、L-古洛糖醛酸、D-甘露糖醛酸 博睿糖生物公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

XH-300PE 超聲波高壓微波協同組合工作站北京祥鵠科技發展有限公司；XN06-Ⅱ半自動凝血分析儀 武漢景川診斷技術股份有限公司；Evolution 201 紫外可見光光度計、ICS5000 離子色譜儀（IC）、D-37520 離心機 ThermoFisher 公司；UGC-24M 干式氮吹儀 力辰科技公司；LC-10A 高效液相色譜儀Shimadzu 公司；TENSOR 27 傅里葉紅外光譜儀Bruker 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲葉預處理 杜仲葉于60 ℃干燥至恒重，粉碎后，過60 目篩。用5 倍體積的石油醚于80 ℃水浴除去杜仲膠和脂類，再用5 倍體積的80%乙醇于80 ℃水浴除去單糖、雙糖、寡糖等物質[10]，過濾，濾渣晾干后裝入塑封袋，4 ℃下保存備用。

1.2.2 杜仲葉多糖提取工藝 稱取3.0 g 處理后的杜仲葉粉，以一定的料液比加入蒸餾水，置于超聲波微波協同組合工作站中在常壓下以一定的超聲波功率、微波功率和提取溫度提取一定的時間。提取結束后，4000 r/min 離心10 min，上清液即為多糖提取液，重復提取三次，將提取液合并。多糖提取液于55 ℃減壓濃縮，在濃縮溶液中慢慢加入乙醇，4 ℃靜置12 h 后，4000 r/min 離心10 min，棄去上清液，沉淀用無水乙醇洗2 次，再將沉淀分散在少量蒸餾水中并凍干，得到杜仲葉粗多糖。

1.2.3 杜仲葉多糖含量測定及提取得率計算 采用苯酚-硫酸法[11]測多糖含量。以蒸餾水為空白對照，標準葡萄糖質量濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制標準曲線，得其回歸方程A=14.595C+0.00727，R2=0.999。將1.2.2 提取三次合并的多糖提取液定容于250 mL 容量瓶中，精密吸取1.0 mL，加蒸餾水補足至2 mL，測吸光度A，根據回歸方程計算多糖的質量濃度C。按下式計算杜仲葉多糖得率Y（%）。

式中：C：待測液中的多糖質量濃度，mg/mL；V：待測樣品液的體積，mL；n：樣品液的稀釋倍數；m：杜仲葉粉的質量，g。

1.2.4 單因素實驗 單因素實驗常規量設為：超聲波功率110 W，提取溫度50 ℃，微波功率250 W，料液比1:20（g:mL），提取時間20 min。依次考察超聲波功率（50、70、90、110、130、150 W）、提取溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）、微波功率（100、150、200、250、300、350 W）、料液比（1:10、1:15、1:20 、1:25、1:30、1:35（g:mL））、提取時間（15、20、25、30、35、40 min）對多糖得率的影響。

1.2.5 Plackett-Burman 試驗 在單因素實驗基礎上，利用Plackett-Burman 試驗篩選出關鍵因素，因素與水平設計見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗設計Table 1 Design of the Plackett-Burman experiment

1.2.6 響應面法優化提取工藝 根據Plackett-Burman 試驗，對篩選出的3 個關鍵因素采用Box-Behnken設計對工藝參數進行優化，因素與水平設計見表2。

表2 Box-Behnken 響應面試驗設計Table 2 Design of the Box-Behnken experiment

1.2.7 粗多糖的精制方法 Sevage 法[12]去蛋白：粗多糖溶液與Sevage 試劑（三氯甲烷:正丁醇=4:1，v/v）混合，去除游離蛋白，重復操作5 次，收集脫蛋白水相。

脫色：用1%活性炭進行脫色。60 ℃條件下于搖床上120 r/min 振蕩30 min，過濾。

透析：用截留分子量3500 Da 的透析袋蒸餾水透析72 h，中間換水多次。

醇沉：將透析后的多糖溶液用95%乙醇調節至80%，4 ℃條件下靜置12 h，4000 r/min 離心10 min，用無水乙醇洗滌沉淀2 遍，凍干。

離子層析：稱取約100 mg 透析后多糖溶解在少量蒸餾水中，4000 r/min 離心10 min，取上清液加入DEAE-52 纖維素離子交換色譜柱（2.6×40 cm）中，先后用蒸餾水、1 mol/L NaCl 溶液洗脫，洗脫液流速5 mL/min。收集NaCl 溶液的洗脫液，經截留分子量3500 Da 透析除去鹽離子，再60 ℃減壓濃縮至原體積1/10，凍干后得到杜仲葉精制多糖。

1.2.8 精制多糖的分子量分布分析 采用高效凝膠滲透色譜法[13]測定杜仲葉精制多糖分子量。色譜條件：色譜柱：BRT105-104-102 串聯凝膠柱（8×300 mm）；流動相：0.05 mol/L NaCl 溶液；流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；檢測器：RI-10A 示差檢測器。樣品配制成5 mg/mL 溶液，12000 r/min 離心10 min，上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉置于1.8 mL 進樣瓶中測樣。

1.2.9 精制多糖的單糖組成分析 精密稱量5.0 mg樣品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L 三氟乙酸2 mL，120 ℃水解3 h。準確吸取酸水解溶液轉移至玻璃管中用氮氣吹干，加入5 mL 去離子水渦旋混勻，吸取100 μL 加入900 μL 去離子水，12000 r/min 離心5 min。取上清進IC 分析。

色譜條件：色譜柱Dionex CarbopacTMPA20（3×150 mm） ；流動相：A：H2O；B：15 mmol/L NaOH；C：15 mmol/L NaOH & 100 mmol/L NaOAc；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：電化學檢測器[13]。

1.2.10 精制多糖的光譜分析 取適量杜仲葉精制多糖溶液于石英比色皿中，用紫外分光光度計進行掃描，掃描波長200～400 nm，掃描頻率為2 nm/s。

稱量1.0 mg 杜仲葉精制多糖樣品和100.0 mg溴化鉀于瑪瑙研缽中，研磨混勻成細粉后，壓制成透明薄片，用傅里葉紅外光譜儀掃描，掃描范圍4000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1，累積掃描64 次。

1.2.11 精制多糖的體外抗凝血活性測定 參照文獻[14]測定。將杜仲葉精制多糖溶于生理鹽水，分別配成2、4、8 mg/mL，再將待測多糖與血漿以1:4 體積比混合均勻。分別以生理鹽水、肝素鈉溶液（2 μg/mL）做陰性和陽性對照，然后測定活化部分凝血酶原時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）三個指標評價其抗凝血活性。

a. APTT 的測定：取100 μL 預熱的37 ℃待測混合血漿，加入100 μL 的APTT，預熱 3 min，再加100 μL 預熱的氯化鈣溶液（0.025 mol/L）并混合均勻，儀器計時。

b. PT 的測定：取100 μL 預熱的37 ℃待測混合血漿，加入200 μL 預熱的PT，混合均勻，儀器計時。

c. TT 的測定：取100 μL 預熱的37 ℃待測混合血漿，加入100 μL 預熱的TT，混合均勾，儀器計時。

1.3 數據處理

所有試驗重復三次操作，結果用平均值±標準偏差表示。Design-Expert 8.0.6 軟件分析響應面試驗結果，SPSS Statistics 22.0 軟件進行ANOVA 分析，Origin 2019b 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲波功率對杜仲葉多糖得率的影響 圖1顯示，隨著超聲波功率由50 W 增大到70 W，杜仲葉多糖得率呈增長趨勢，這是因為超聲波空化效應產生的微射流和沖擊波有利于植物材料中多糖的溶解和擴散[15]；但繼續增大超聲波功率，多糖降解，多糖得率比之前降低；但是超聲波功率繼續增大到130 W 時，由于超聲波的空化作用更大，植物材料結構受到更大的影響，多糖更易從植物組織里溶出，這時多糖得率達到最大值3.45%±0.12%。然而，繼續增大超聲波功率，多糖得率下降，這是因為過高的超聲波功率會產生大量的微小氣泡，使空化效應下降[16]。超聲波功率130 與110、150 W 之間的多糖得率差異顯著（P＜0.05），因此后續試驗中超聲波功率取值范圍為110～150 W。

圖1 超聲波功率對杜仲葉多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.1.2 提取溫度對杜仲葉多糖得率的影響 圖2 顯示，當提取溫度從40 ℃升高到50 ℃時，杜仲葉多糖得率逐漸增大，在50 ℃時達到最大值3.54%±0.05%，但進一步升高溫度至55 ℃，杜仲葉多糖得率反而下降。這可能是由于溫度在一定范圍內的升高有利于多糖從細胞中溶出，但隨著系統溫度的升高，超聲空化氣泡的溫度和壓力也會降低，過高的系統溫度會降低空化效應，從而導致多糖得率下降[17]。而溫度升至60 ℃時，使空化氣泡壓力有所上升，多糖得率呈小幅增大，繼續升至65 ℃后，空化氣泡變得細密，空化效應下降，多糖得率下降。提取溫度50 ℃與45、55 ℃之間的多糖得率差異顯著（P＜0.05），因此后續試驗中提取溫度取值范圍為45～55 ℃。

圖2 提取溫度對杜仲葉多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.1.3 微波功率對杜仲葉多糖得率的影響 圖3 顯示，微波功率由100 W 增大至150 W 時，多糖得率有小幅下降，但微波功率升至200 W 時，多糖得率大幅上升，達到最大值3.76%±0.04%。多糖得率的增加是由于微波使植物細胞內受熱膨脹并導致細胞壁破裂，多糖溶出增加，但是微波功率過高，多糖被降解，導致多糖得率下降[18]。在微波功率200 W 與150、250 W 之間，多糖得率差異顯著（P＜0.05），因此后續試驗中微波功率取值范圍為150～250 W。

圖3 微波功率對杜仲葉多糖得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.1.4 料液比對杜仲葉多糖得率的影響 圖4 顯示，在料液比為1:10、1:15（g:mL）時，多糖得率較低；但當料液比增大到達到1:20（g:mL）時，多糖得率有大幅增加，在料液比1:30（g:mL）時有最大值3.94%±0.02%。這是因為溶劑比例較低時，雜質的析出量增多，抑制了杜仲葉多糖的析出；繼續增大溶劑比例，雜質基本溶出，此時多糖溶出不受抑制，得率增大[19]。因此后續試驗中料液比取值范圍為1:25～1:35（g:mL）。

圖4 料液比對杜仲葉多糖得率的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.1.5 提取時間對杜仲葉多糖得率的影響 圖5 顯示，提取時間從15 min 增加至20 min 時，杜仲葉多糖的得率上升并達到最大值3.94%±0.1%，之后繼續增加提取時間，杜仲葉多糖得率下降。這是由于多糖的溶出需要一定時間，但提取時間過長，超聲會破壞多糖的分子結構引起多糖降解，導致多糖得率下降[20]。在提取時間20 min 與15、30 min 之間，多糖得率差異顯著（P＜0.05），在20 與25 min 之間，多糖得率差異不顯著（P＞0.05），考慮后續試驗中提取時間取值范圍為15～25 min。

圖5 提取時間對杜仲葉多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.2 Plackett-Burman 試驗結果

Plackett-Burman 試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗設計及結果Table 3 The design and results of the Plackett-Burman experiment

表4 Plackett-Burman 試驗各因素效應評價Table 4 Effect evaluation of the factors of Plackett-Burman experiment

由表4 可知，提取時間、提取溫度和料液比對杜仲葉多糖得率的影響均達到顯著水平（P＜0.05），其中料液比為達到極顯著水平（P＜0.01）。超聲波功率和微波功率為非顯著影響因素，故選擇提取時間、提取溫度和料液比進行響應面優化試驗，而超聲波功率、微波功率則分別固定為130 和200 W。

2.3 Box-Behnken 響應面試驗結果

Box-Behnken 響應面試驗結果見表5。

表5 Box-Behnken 響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of the Box-Behnken experiment

對實驗結果進行回歸擬合，得到顯著影響杜仲葉多糖得率（Y）因素的多元二次回歸方程：Y=4.02+0.11A+3.750×10-3B-0.36C-0.282AB+0.045A C+0.82BC-0.90A2-0.74B2-0.82C2。表6 為回歸模型的方差分析結果。結果顯示，在該模型中一次項A 具有顯著影響（P＜0.05），一次項C 和二次項A2、B2、C2以及交互項AB、BC 具有極顯著影響（P＜0.01）。此外，該回歸模型P＜0.01，說明該模型可靠。R2=0.9944，說明模型擬合程度良好，模型的校正相關系數（R2Adj=0.9871）說明自變量之間的相關性良好。

表6 回歸模型方差分析結果Table 6 Results of variance analysis of response surface quadratic model

由模型分析得出，杜仲葉多糖的超聲波-微波輔助提取最優工藝條件為提取溫度49.06 ℃、料液比1:28.44（g:mL）、提取時間20.41 min。此條件下預測的杜仲葉多糖得率為4.08%。為了在實際中具有可操作性，將最優工藝參數確定為提取溫度49 ℃、料液比1:30（g:mL）、提取時間20 min。為了驗證模型的可靠性，在此最佳條件下進行了驗證實驗，測出多糖得率為4.02%±0.03%，該值與預測值十分接近。表明響應面優化試驗可以合理優化杜仲葉多糖的超聲波-微波輔助提取工藝條件。

宮本紅[21]采用熱水提取杜仲葉多糖，最優提取工藝條件為：料液比1:20，提取溫度100 ℃，浸提時間120 min，在此條件下粗多糖的提取率有3.7%。劉曉河等[22]研究了酶對杜仲多糖提取率的影響，發現酶的添加對多糖的提取有顯著作用，其中果膠酶效果最為顯著。陳雪花[10]采用的超聲波協同酶法提取杜仲葉多糖，最佳提取工藝條件為復合酶添加量3.7%、pH4.0、超聲波功率100 W、提取溫度45 ℃、料液比1:20（g:mL）和提取時間15 min，多糖得率達4.79%±0.02%。雖然本研究的多糖得率與超聲波協同酶法的得率相比較低，但本文所采用的超聲波-微波輔助提取方法因減少了用酶成本和滅酶的能耗成本，經濟上更具優勢。

圖6為兩因素間交互作用響應面圖。可以直觀地觀察到杜仲葉多糖得率較高分布區域范圍以及兩者之間的交互作用。交互作用對杜仲葉多糖得率的影響大小順序為：BC＞AB＞AC。

圖6 兩因素間交互作用響應面圖Fig.6 Response surface plots of interaction between two factors

2.4 杜仲葉多糖的DEAE-52 纖維素離子交換層析柱純化

以管號為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制杜仲葉多糖經離子交換層析純化的洗脫曲線，如圖7 所示。收集5 號管至11 號管的洗脫液，透析凍干后多糖得率為26.16%，精制多糖的糖含量為50%（以葡萄糖計）。不同單糖標準品在相同濃度下的吸收值相差較大，而葡萄糖是單糖中顯色較強的一種[23]。杜仲葉多糖為雜多糖，此研究中用葡萄糖制作標準曲線，因杜仲葉多糖中的其他單糖顯色不如葡萄糖而使多糖的糖含量測定結果偏低。

圖7 杜仲葉多糖的的DEAE-52 洗脫曲線Fig.7 DEAE-52 elution curve of Polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.5 分子量測定結果

圖8顯示，杜仲葉精制多糖的主要洗脫峰單一且較對稱，說明多糖純度較高，其重均分子質量Mw為1653 kDa，數均分子質量Mn為1431 kDa，峰值分子質量Mp為1647 kDa，分子量分布系數Mw/Mn為1.16。FENG 等[24]從杜仲莖皮部提取的杜仲多糖平均分子量為1146 kDa，ZHU 等[25]從杜仲莖皮部提取的杜仲多糖平均分子量為1000～2000 kDa。結果說明杜仲葉與皮中多糖的分子量相近。陳雪花[10]采用超聲波輔助酶法提取的杜仲葉多糖時，其分子量僅為180 kDa，其值偏小，是與該提取方法中使用纖維素酶有關。

圖8 杜仲葉精制多糖的分子質量色譜圖Fig.8 Chromatogram of molecular weight of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.6 單糖組成測定結果

圖9顯示，杜仲葉精制多糖中含有果糖、葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等5 種單糖。各單糖摩爾百分含量為：果糖37.3%、葡萄糖35%、N-乙酰-D 氨基葡萄糖14.6%、半乳糖8.6%、阿拉伯糖4.4%，表明果糖與葡萄糖是杜仲葉多糖的主要成分。陳雪花[10]采用超聲波-酶法得到的杜仲葉多糖主要成分是甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，與本研究結果產生差異，是因為提取工藝不同以及本研究所測定多糖是精制多糖而致。

圖9 杜仲葉精制多糖的單糖組成色譜圖Fig.9 Chromatogram of monosaccharide composition of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.7 光譜分析結果

圖10為杜仲葉精制多糖溶液在200～400 nm 紫外波長范圍的吸收曲線。可以看出，在280 nm 和260 nm 處未有明顯的蛋白和核酸吸收峰，說明為較純的多糖。圖11 為杜仲葉精制多糖的紅外光譜圖，具有多糖的特征吸收峰，在3419 cm-1為O-H 伸縮振動，2925 cm-1處為CH3、CH2、CH 等的C-H 伸縮振動、1126 cm-1處為C-N 伸縮振動[26]，1603 cm-1處為糖醛酸COO-伸縮振動，1389 cm-1處為甲基的變形吸收峰[27]，1261 cm-1處為C-O 伸縮振動，證明了乙酰基的存在[28]。1075 cm-1處為吡喃糖的糖環伸縮振動[29]。此外，在760 cm-1處的吸收峰顯示糖單元的β構型[28]，而815 cm-1處的吸收峰表示端基碳為β型[10]。綜上表明，本研究得到的杜仲葉多糖為β型酸性多糖。

圖10 杜仲葉精制多糖紫外光譜圖Fig.10 UV spectrum of refined polysaccharides fromEucommia ulmoides leaves

圖11 杜仲葉精制多糖紅外光譜圖Fig.11 IR spectra of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.8 體外抗凝血活性結果

2.8.1 杜仲葉精制多糖對APTT 的影響 肝素是一種硫酸化多糖，在臨床上常被用作抗凝劑和抗血栓劑，但有嚴重的出血和血小板減少等副作用，且肝素來源于動物腸組織，存在機體感染病毒的風險[14]。因此，從天然產物中提取抗凝劑具有重要意義。目前已經發現多種植物多糖具有抗凝血活性，如黑木耳多糖[30]，香椿子多糖[14]，紅棗多糖[31]等。雖然杜仲葉多糖已經被證實具有抗氧化[32]、降血糖[33]、抗結腸癌[10]等活性，但其抗凝血活性還未見研究報道。

表7顯示，與陰性對照相比，在杜仲葉多糖濃度2 mg/mL 時，APTT 即增大，說明有抗凝效果；且隨多糖濃度增大，APTT 延長（P＜0.01）；當多糖濃度達到8 mg/mL 時，APTT 超過120 s（P＜0.01）。聞志瑩[14]研究香椿子多糖抗凝血活性時發現，當多糖濃度為4 mg/mL 時，對APTT 的延長到36.6 s，而本研究杜仲葉精制多糖濃度為4 mg/mL 時，APTT 的延長時間為73.05 s，表明杜仲葉精制多糖對APTT 有顯著影響，實驗結果表明杜仲葉多糖是通過參與內源性凝血途徑來起到抗凝血作用。

表7 杜仲葉精制多糖對APTT 的影響Table 7 Effect of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves on APTT

2.8.2 杜仲葉精制多糖對PT 的影響 表8 顯示，與陰性對照相比，當多糖濃度在2～8 mg/mL 范圍內，杜仲葉多糖對PT 有一定的延長作用，表明杜仲葉多糖也可以通過參與外源性凝血途徑起到抗凝血作用。當杜仲葉多糖濃度為8 mg/mL 時，對PT 的影響達到極顯著水平（P＜0.01），延長到42.30 s。

表8 杜仲葉精制多糖對PT 的影響Table 8 Effect of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves on PT

2.8.3 杜仲葉精制多糖對TT 的影響 表9 顯示，與陰性對照相比，當杜仲葉多糖為2 mg/mL 時，延長時間為14.4 s，當杜仲葉多糖濃度為8 mg/mL 時，延長時間超過了120 s，且影響達到極顯著水平（P＜0.01），說明杜仲葉多糖對TT 有顯著影響作用，進而說明杜仲葉多糖也可以通過參與共同途徑來影響凝血過程。聞志瑩[14]研究的香椿子多糖濃度為2 mg/mL時，延長時間僅為12.63 s，說明杜仲葉多糖對TT 作用的影響比香椿子多糖大。本文發現杜仲葉多糖的單糖組成主要是果糖、葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。宋苗苗[34]報道，抗凝血榴蓮皮多糖組成有大量的鼠李糖、半乳糖酸存在，而Martinichen-Herrero 等[35]報道，具有半乳糖-甘露聚糖結構的地衣多糖有抗凝血和抗血栓活性。因此初步推測杜仲葉多糖的抗凝血活性可能與半乳糖糖基的存在有關。

表9 杜仲葉精制多糖對TT 的影響Table 9 Effect of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves on TT

3 結論

本研究采用超聲波-微波輔助法提取杜仲葉多糖，經單因素實驗和BBD 試驗，得到最優提取工藝條件為：超聲波功率130 W、微波功率200 W、提取溫度49.06 ℃、料液比1:28.44（g:mL）、提取時間20.41 min，得率4.08%。在此條件下實際多糖得率為4.02%±0.03%。經DEAE-52 離子層析純化后，精制多糖的重均分子質量（Mw）為1653 kDa，單糖組成及摩爾比為：果糖37.3%、葡萄糖35%、N-乙酰-D 氨基葡萄糖14.6%、半乳糖8.6%、阿拉伯糖4.4%，并確定其為β型酸性多糖。與陰性對照相比，杜仲葉多糖能極顯著延長APTT（P＜0.01），對PT、TT 有一定的延長作用，且當多糖濃度為8 mg/mL 時，對PT、TT 有極顯著影響（P＜0.01），說明其可以通過內源性、外源性、共同途徑來影響凝血過程，其中是以內源性途徑為主。本研究結果表明，與傳統水浸提法和單一的超聲波、微波法相比，超聲波-微波輔助提取法能高效提取杜仲葉多糖，與酶法相比，超聲波-微波輔助提取法有利于降低生產成本，并且發現杜仲葉多糖具有較強的體外抗凝血活性。本研究對我國豐富的杜仲葉資源開發具有一定的理論和技術參考價值。