基于逐步回歸分析法的玉竹多糖吸濕因素探索及其防潮中間體片劑的研制

鄧碧蓮，吳 璐，李 婷，柳 婷，歐陽征海，楊華生

（江西中醫藥大學藥學院，江西南昌 330004）

玉竹為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum（Mill.）Druce 的干燥根莖，是常見的藥食兩用中藥[1]，主要含有多糖、皂苷、黃酮等多種藥理活性成分[2-4]。其中多糖是玉竹研究聚焦的重要成分，也是評價玉竹質量的主要指標[5]。研究表明，玉竹多糖具有確切的降血糖等作用，常用于糖尿病的治療[6]。然而，玉竹多糖吸濕明顯，吸濕后的多糖黏性增強，容易出現結塊、團聚甚至液化等現象，不僅影響其穩定性，還能顯著影響其儲存及后續制劑的工藝操作。

多糖吸濕與很多因素有關，包括多糖的純度以及蛋白質、單糖等雜質的含量等，同時與多糖的粉體學性質有關，如粒徑、比表面積等[7]。針對不同的因素，可采用相應的方法降低多糖的吸濕性。如多糖吸濕與雜質有關，可去除其中含有的蛋白質、單糖等雜質，提高多糖純度，降低吸濕性；如多糖吸濕與粉體學性質有關，則可通過改性等方法增加粒徑、降低比表面積，進而降低其吸濕性。比表面積與粒徑成反比，比表面積越大，粒徑越小，吸濕越明顯。而增加粒徑、降低粉體比表面積的方法主要有兩種：一種是制粒，即將粉末制成顆粒。有研究發現，五味子多糖制備成顆粒后，粒徑增加，比表面積降低，吸濕性明顯減小[8]。另一種是制片，即將粉末壓制成片劑。與制粒比較，制片可使粉體的比表面積進一步縮小，吸濕性進一步降低，防潮效果更佳，且體積小，便于保存、運輸。同時，制備的片劑可再作為顆粒劑、膠囊、片劑等中藥制劑的原料。可以看出，為降低吸濕性而制備的多糖片劑，主要目的是防潮，且具有中藥中間體的性質，故也稱為防潮中間體片劑。

然而，目前有關玉竹多糖吸濕因素、防潮方法的研究很少；而逐步回歸分析是一種從眾多因素中找到顯著因素的分析方法，廣泛用于醫學、氣象學、經濟學等領域；其通過建立最優回歸方程，方程中只包含影響顯著的因子，而其余影響不顯著的因子均被剔除[9]。因此，本試驗以玉竹多糖為研究對象，先采用逐步回歸分析法，研究玉竹多糖含量，雜質蛋白質、果糖含量，以及中位徑D50、分布跨度Span、比表面積、休止角、松密度、振實密度對吸濕性的影響，探索導致玉竹多糖吸濕的主要因素；在此基礎上，將玉竹多糖制成防潮中間體片劑，降低玉竹多糖的比表面積；再運用單因素實驗和Box-Behnken 響應面法，優化玉竹多糖防潮中間體片劑的處方，并對其吸濕性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉竹飲片 安徽道源堂中藥飲片有限公司；D-果糖 上海源葉生物科技有限公司；無水葡萄糖西隴科學股份有限公司；牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍G250 北京索萊寶科技有限公司；磷酸 西隴化工股份有限公司；PH-102 微晶纖維素 湖州新望藥用輔料有限公司；無水乳糖鎮江市康富生物工程有限公司；硬脂酸鎂 廣州康本生物科技有限公司。

Agilent 1260 高效液相色譜儀 美國Agilent 公司；ELSD 6000 蒸發光散射檢測器 美國Alltech 公司；Mastersizer 2000 激光粒度測定儀 英國Malvern 公司；BT-1000 型粉末綜合特性測定儀 丹東百特儀器有限公司；752 紫外可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；DP30A 單沖壓片機 北京國藥龍立科技有限公司；YD-1A 片劑硬度測試儀 天津市光學儀器廠；CS-1 脆碎度測試儀 天津市國銘醫藥設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基于逐步回歸分析法探索玉竹多糖吸濕的主要因素

1.2.1.1 玉竹多糖的制備 取玉竹，加水回流提取2 次，每次2 h，合并濾液，濃縮至生藥濃度為1 g/mL的玉竹濃縮液。將濃縮液分為五份，加入無水乙醇至含醇量分別為70%、75%、80%、85%、90%，放入4 ℃冰箱靜置過夜，過濾，取沉淀真空干燥，即得不同醇沉濃度的玉竹多糖。取70%醇沉濃度所得的玉竹多糖，分為四份，研缽中研磨，過篩，得到粒徑為50～65 目、65～80 目、80～100 目、100～120 目的樣品。同法制備75%、80%、85%、90%醇沉濃度得到的多糖不同粒徑的樣品，編號見表1[10]。

1.2.1.2 玉竹多糖的多糖、蛋白質、果糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，配制玉竹多糖及系列葡萄糖標準品溶液，加入苯酚、濃硫酸，反應后在490 nm 處測定其吸光度，依據葡萄糖標準曲線計算多糖含量[11]；

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，配制玉竹多糖及牛血清白蛋白標準品溶液，加入考馬斯亮藍G250 酸性染色液，立即混勻，在595 nm 的波長處測定吸光度，以牛血清白蛋白線性方程計算蛋白質濃度[12]。

制備玉竹多糖及系列果糖標準品溶液，采用HPLCELSD 法測定果糖含量，色譜柱為Kromasil 100-5-NH2（250×4.6mm，5 μm）柱，流動相為乙腈-水（75：25），流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，漂移管溫度為105 ℃，空氣體積流量為3.2 L/min。以進樣量的對數為橫坐標，以峰面積的對數為縱坐標，依據果糖標準曲線計算待測液中果糖濃度，計算果糖含量[13]。

1.2.1.3 玉竹多糖粉體學參數的測定 采用激光粒度儀測定粉體的中位徑D50、分布跨度Span、比表面積[14]；采用粉體綜合特性儀測定粉體的休止角[15]、松密度和振實密度[16]。

1.2.1.4 玉竹多糖吸濕率測定 取干燥具塞稱量瓶，于放有過飽和氯化銨溶液的干燥器中放置24 h，精密稱定質量m1。取玉竹多糖粉末適量，平鋪于稱量瓶中，厚度約為1 mm，精密稱定質量m2。將稱量瓶敞口，并與瓶蓋同置于干燥器中，25 ℃保存，120 h取出，精密稱定重量，記錄質量m3，每種樣品粉末平行測定3 次，吸濕率計算公式：吸濕率（%）=（m3-m2）/（m2-m1）×100[17]。

1.2.1.5 逐步回歸分析 逐步回歸是一種雙向篩選的方法，在每引入一個變量，都要對回歸方程中每一個自變量進行顯著性檢驗，當一個或幾個自變量的作用無顯著性意義時，則會剔除，盡可能將回歸效果顯著的自變量選入回歸方程[18]。以多糖含量（X1）、蛋白質含量（X2）、果糖含量（X3）、中位徑D50（X4）、分布跨度Span（X5）、比表面積（X6）、休止角（X7）、松密度（X8）、振實密度（X9）為自變量，玉竹多糖120 h吸濕率為因變量（Y），應用SPSS 21.0 軟件進行逐步回歸分析。

1.2.2 防潮中間體片劑的制備

1.2.2.1 制備工藝 采用粉末直接壓片法，將玉竹多糖、稀釋劑分別粉碎，過80 目篩，混合，再加入潤滑劑，混合均勻，置于壓片機中壓制成片劑[19]。

1.2.2.2 單因素實驗 取玉竹多糖粉末，固定稀釋劑微晶纖維素MCC 的用量（15%）及潤滑劑硬脂酸鎂的用量（0.6%），片劑的直徑設置為8、9、11、20 mm，考察直徑對吸濕率、硬度、脆碎度的影響。固定片劑其它因素，考察稀釋劑MCC、乳糖、預膠化淀粉、甘露醇、糊精等5 種常用的稀釋劑對粉體休止角及片劑吸濕率、硬度、脆碎度的影響[20]，稀釋劑用量均為玉竹多糖的15%；在此基礎上，分別考察乳糖、MCC 用量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）對休止角、吸濕率、硬度、脆碎度的影響；最后考察潤滑劑種類（PEG 4000、微粉硅膠、硬脂酸鎂）、用量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）對休止角、吸濕率、硬度、脆碎度的影響。

1.2.2.3 評價指標的測定 將玉竹多糖制成片劑，吸濕率是重點關注的指標，而為了使壓片過程順利進行，表征粉體的流動性的休止角也是需要考慮的；同時，為使玉竹多糖防潮中間體片劑能較長時間儲存，其硬度、脆碎度也是應該關注的。因此，選擇吸濕率、休止角、硬度、脆碎度為片劑評價指標。將玉竹多糖、稀釋劑、潤滑劑混合后，按1.2.1.3 項下方法測定混合粉末的休止角；取制備的片劑于稱量瓶，余同1.2.1.4項下方法測定片劑24 h 吸濕率；分別采用脆碎度測試儀、硬度測試儀測定片劑的脆碎度、硬度[21]。

1.2.2.4 響應面試驗 在單因素實驗結果的基礎上，以片劑吸濕率（Y1）、粉體休止角（Y2）、片劑硬度（Y3）、片劑脆碎度（Y4）為因變量，乳糖用量（A）、MCC 用量（B）、硬脂酸鎂用量（C）為自變量，利用Design Expert 8.0.6 優化玉竹多糖防潮中間體片劑處方。因素、水平安排見表2。

表2 Box-Behnken 設計的考察因素和水平Table 2 Investigation factors and levels of Box-Behnken design

1.2.3 防潮中間體片劑吸濕性對比分析 在優化了玉竹多糖防潮中間體片劑處方的基礎上，進一步對其吸濕性進行了對比分析。取玉竹多糖粉末，按上述最佳處方的輔料量混合，得防潮中間體粉末；將玉竹多糖粉末、防潮中間體粉末壓片，分別得多糖片劑、防潮中間體片劑。測定多糖粉末、防潮中間體粉末、多糖片劑、防潮中間體片劑2、4、8、12、24、48、72、96、120 h 的吸濕率。

再對防潮中間體片劑的臨界相對濕度進行對比分析。取多糖粉末、防潮中間體粉末、多糖片劑、防潮中間體片劑，精密稱定質量，置于干燥已精密稱定質量的稱量瓶中，置于放有變色硅膠的干燥器中12 h，平衡，備用。將上述平衡好的稱量瓶精密稱定，置于相對濕度分別為23%、43%、55%、69%、80%、84%、92%的干燥器中，于25 ℃下保存72 h，取出稱量瓶，精密稱定，計算吸濕率。以吸濕率為縱坐標，相對濕度為橫坐標作圖，對作圖中曲線兩端做切線，兩切線的交點對應的橫坐標即為臨界相對濕度[22]。

最后采用SPSS 21.0 軟件，以零級過程（Y=A+BX）、一級過程（Y=Y∞（1-e-kX）、一元二次曲線（ Y=A+BX+CX2） 、 雙指數模型（ Y=Y∞-Ae-k1X+Be-k2x）、Logarithmic 模型（Y=A+BlnX）、Higuchi 模型（Y=AX1/2）、Sweibull1 模型（Y=A-Ae-（BX（1-C））D）、Sweibull2（Y=A-（A-B）e-（CX）D）模型等八種模型對吸濕過程進行擬合（模型中Y 為吸濕率，X 為時間，Y∞為平衡吸濕常數，k1為吸濕速率常數，k2為擴散速率常數，其余為模型參數），通過決定系數（R2）、殘差平方和（RSS）和赤池信息準則（AIC）3 個統計參數來檢驗模型的擬合效果，R2的數值越接近1，表明曲線的擬合效果越好，RSS 和AIC 的數值越小，表明曲線的擬合效果越好[23]。

1.3 數據處理

數據采用SPSS 21.0 軟件進行逐步回歸分析和吸濕模型擬合，采用Design-Expert8.0.6中Box-Behnken 進行模型建立和方差分析，采用Origin 2019b 進行結果的繪圖制作，所有試驗均做三次平行，試驗結果以（平均值±標準差）表示。

2 結果與分析

2.1 玉竹多糖的多糖、蛋白質、果糖含量及粉體學參數

玉竹多糖、蛋白質、果糖含量及粉體學參數測定結果見表3，隨著醇沉濃度的升高，玉竹多糖粉末中的多糖、蛋白質、果糖的含量也升高，當醇沉濃度達到90%時，含量達到最高。多糖、蛋白質、果糖均為水溶性物質，醇的濃度越高，多糖的溶解度越低，因此可采用高濃度醇來提高多糖的得率[24]，然而這也提高了蛋白質、果糖等水溶性雜質的含量。因此，采用水提醇沉法制備多糖，常采用Sevage試劑去除蛋白質，采用半透膜去除小分子糖，以制備純化多糖[25-26]；同時，從表3 還可以看出，粒徑與D50、松密度、振實密度、比表面積、休止角增大也存在密切聯系，玉竹多糖粉體粒徑減小，D50、松密度和振實密度也減小，而比表面積、休止角增大，這與文獻報道的一致[27-28]。

表3 多糖含量、蛋白質含量、果糖含量、粉體學性質和吸濕率測定結果（ xˉ±s，n=3）Table 3 Determination results of polysaccharide content, protein content, fructose content, powder properties and moisture absorption rate ( xˉ±s, n=3)

2.2 玉竹多糖吸濕率

不同純度、不同粒徑的玉竹多糖樣品的吸濕率結果見表3，比表面積越大，吸濕率越大，松密度越大，吸濕率越小。比表面積是表征粉體粒子大小的一種量度，也是表示粉體吸附能力的重要指標。多糖分子中含有大量的羥基等極性基團[29]，易吸附水分子；玉竹多糖比表面積增大，故其與水分子的接觸面積也增大，吸濕增加，這與文獻報道的一致[30]。松密度是粉體質量除以該粉體所占的體積而計算的密度。一般地，松密度越小，比表面積越大，比表面積與吸濕密切相關，因此松密度與吸濕也存在一定關聯。

2.3 逐步回歸分析

以120 h 吸濕率為因變量（Y），以多糖含量等9 個指標為自變量，逐步回歸分析得到的方程為：Y=16.342+0.355X2+0.337X3+0.379X6-0.156X8

（R2=0.976），式中正、負號表示因變量隨自變量的變化方向，系數的絕對值表示影響的大小。由回歸方程可知，導致玉竹多糖粉體吸濕的主要因素有比表面積、蛋白質含量、果糖含量、松密度（P＜0.05），而D50、Span、振實密度、休止角對玉竹多糖吸濕率無顯著影響（P＞0.05）。從因子的系數可以看出，比表面積對玉竹多糖吸濕率影響最大，這結果也與2.2 項下的直觀分析一致。同時，玉竹多糖中含有的蛋白質、果糖等雜質，也是導致玉竹多糖吸濕的次要因素。一方面，蛋白質、果糖含有大量的羥基、氨基等極性基團，易與水分子結合，從而導致多糖的吸濕性增強；另一方面，多糖、蛋白質、果糖均為水溶性物質，基于Elder 假說，水溶性藥物的混合物比單一水溶性藥物更加容易吸濕[31]。

2.4 防潮中間體的制備

2.4.1 單因素實驗 片劑直徑對吸濕率、硬度和脆碎度的影響，結果見圖1A1～圖1A2。圖1A1 顯示，片劑直徑增加，吸濕率顯著下降（P＜0.05），而直徑對片劑的硬度、脆碎度無顯著影響（P＞0.05）（圖1A2），故確定玉竹多糖防潮中間體片劑的直徑為20 mm。稀釋劑種類對休止角、吸濕率、硬度、脆碎度的影響，結果見圖1B1～圖1B2。結果顯示，與MCC 相比，甘露醇與多糖混合后粉體的吸濕率顯著減小（P＜0.05），但流動性差，而乳糖、MCC 分別與多糖混合后，流動性好，且吸濕率也較小。因此，玉竹多糖防潮中間體片劑選擇乳糖、MCC 為稀釋劑。進一步考察乳糖的用量對休止角、吸濕率、硬度、脆碎度的影響，結果見圖1C1～圖1C2。結果顯示，乳糖用量越大，吸濕率、休止角、脆碎度越小，硬度越大。當用量達到20%時，繼續增加用量，吸濕率、休止角、脆碎度變化較小，因此選擇5%～20%進行后續試驗。MCC 用量對休止角、吸濕率、硬度、脆碎度的影響，結果見圖1D1～圖1D2。結果顯示，MCC 用量越大，其吸濕率、休止角、脆碎越小，硬度則越大。當用量達到20%時，繼續增加用量，吸濕率、休止角、脆碎度變化不明顯，因此選擇MCC 用量為5%～20%進行后續實驗。潤滑劑種類對休止角、吸濕率、硬度、脆碎度的影響，結果見圖1E1～圖1E2。結果顯示，硬脂酸鎂與多糖混合后粉體的休止角最小，而三種潤滑劑對吸濕率、硬度和脆碎度無明顯差異，因此，選擇硬脂酸鎂為潤滑劑。硬脂酸鎂用量對休止角、吸濕率、硬度、脆碎度的影響，結果見圖1F1～圖1F2。結果顯示，休止角隨硬脂酸鎂用量的增加而逐漸減小。當用量達到1%時，繼續增加用量，休止角變化不顯著（P＞0.05）。因此選擇用量為0.2%～1.0%進行后續試驗。

圖1 片劑直徑、稀釋劑、潤滑劑對休止角、吸濕率、硬度、脆碎度的影響Fig.1 Effect of tablet diameter, diluent and lubricant on angle of repose, moisture absorption rate, hardness and friability

2.4.2 響應面試驗 在單因素實驗結果基礎上，選取擇乳糖用量（A）、微晶纖維素用量（B）、硬脂酸鎂用量（C）為考察因素，即自變量，以吸濕率（Y1）、休止角（Y2）、硬度（Y3）、脆碎度（Y4）為評價指標，即因變量，采用Box-Behnken 設計-響應面法進行處方優化，結果見表4；再采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行二次多項式擬合，以相關系數R、P為判定標準，所得回歸方程如下：

表4 Box-Behnken 設計的試驗安排及結果Table 4 Test arrangements and results of Box-Behnken design

方差分析結果表明，模型擬合的效果均顯著（P＜0.05），失擬項則均不顯著。吸濕率（Y1）方差分析見表5，因素A、B，二次項A2、B2、C2均極顯著（P＜0.01），交互項AB 為顯著（P＜0.05）；休止角（Y2）方差分析見表4，因素C 為極顯著（P＜0.01），二次項A2、C2均影響顯著（P＜0.05）；硬度（Y3）方差分析見表6，因素A、B，二次項A2均顯著（P＜0.05）；脆碎度（Y4）方差分析見表5，因素A、B 均極顯著（P＜0.01），其他單因素、交互項和二次項則均不顯著（P＞0.05）。根據回歸模型的數學分析，得片劑的最優處方為：乳糖用量17.30%、微晶纖維素用量16.74%、硬脂酸鎂用量0.80%。

表5 吸濕率（Y1）和休止角（Y2）回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model for moisture absorption rate (Y1) and angle of repose (Y2)

表6 硬度（Y3）和脆碎度（Y4）回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model for hardness (Y3) and fragility (Y4)

2.4.3 處方工藝驗證 基于實際情況，將最優處方微調整為：乳糖用量17.00%、微晶纖維素用量17.00%、硬脂酸鎂用量0.80%；按此處方制備3 批玉竹多糖防潮中間體片劑，測定吸濕率（Y1）、休止角（Y2）、硬度（Y3）、脆碎度（Y4），并與預測值比較，結果見表7。結果表明，實測值與預測值基本吻合。

表7 最優處方驗證Table 7 Validation of optimal formulation

2.5 防潮中間體片劑吸濕性對比分析

多糖粉末、防潮中間體粉末、多糖片劑、防潮中間體片劑見圖2。可以看出，多糖粉末（圖2A）有吸濕團聚現象，將其壓制成片劑（圖2B）后，吸濕有所下降，但壓制時粉體的流動性差；而將多糖粉末加入輔料制成防潮中間體粉末（圖2C），吸濕團聚現象改善，流動性增加，進一步將防潮中間體粉末制成防潮中間體片劑（圖2D），吸濕性明顯降低，且壓片時不易黏沖，片劑表面光潔。測定多糖粉末、防潮中間體粉末、多糖片劑、防潮中間體片劑吸濕率，結果見圖2E。結果顯示，平衡吸濕率從大到小為多糖粉末＞防潮中間體粉末＞多糖片劑＞防潮中間體片劑，分別為22.25%、16.60%、14.03%、11.03%。結果表明，輔料有一定的防潮作用，而壓成片劑后，吸濕率進一步顯著降低。

圖2 防潮中間體片劑的平衡吸濕率及臨界相對濕度Fig.2 Equilibrium moisture absorption rate and critical relative humidity of moisture-resistant intermediate tablet

多糖粉末、防潮中間體粉末、多糖片劑、防潮中間體片劑的臨界相對濕度分別為48.40%、59.58%、66.40%、75.00%，結果見圖2F。結果表明，多糖粉末制成防潮中間體片劑后，其臨界相對濕度顯著增加。同時也提示，玉竹防潮中間體片劑的儲存環境，其相對濕度應控制在75%以下。將多糖粉末、防潮中間體粉末、多糖片劑、防潮中間體片劑吸濕過程進行模型擬合，結果見表8。結果表明，在8 種吸濕模型中，多糖粉末、防潮中間體粉末、多糖片劑、防潮中間體片劑以雙指數模型的擬合效果最好；雙指數模型擬合結果見表9。

表8 吸濕模型擬合結果Table 8 Fitting results of hygroscopic model

表9 多糖粉末、多糖片劑、防潮中間體粉末、防潮中間體片劑的雙指數模型Table 9 Double exponential model of polysaccharide powder,polysaccharide tablet, moisture-resistant intermediate powder and moisture- resistant intermediate tablet

3 結論

本研究以玉竹多糖為研究對象，通過逐步回歸分析法找到導致玉竹多糖吸濕的主要因素——比表面積，故采用制片的方法降低比表面積。在此基礎上，采用單因素實驗、Box-Behnken 設計-響應面法優化處方，得到玉竹多糖防潮中間體片劑的最優處方為乳糖用量17.00%、MCC 用量17.00%、硬脂酸鎂用量0.80%。在此條件下制備玉竹防潮中間體片劑，與玉竹多糖粉末比較，平衡吸濕率由22.25%降低至11.03%，臨界相對濕度由48.40%提高到75.00%。本研究結果不僅為玉竹多糖吸濕、儲存提供了新視角，同時也為中藥多糖、中藥提取物的吸濕及儲存提供新方法。需要指出的是，比表面積是導致玉竹多糖吸濕的主要因素，但對于其他中藥多糖，比表面積對其吸濕性的影響需進一步研究。因此，接下來可以多種中藥多糖為研究對象，探索比表面積對其吸濕的影響，闡明中藥多糖吸濕的規律。