超聲輔助雙水相提取刺梨黃酮的工藝優(yōu)化及其對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用

莊乾飛，劉丹丹，陳澤雨，尚祖飛，劉曉燕,2,3，馬立志,2,3,

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽 550005；3.貴州省果品加工、貯藏與安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州貴陽 550005）

刺梨（Rose roxburghiiTratt）是薔薇屬植物繅絲花的果實(shí)，主要分布在我國的貴州、四川和云南等地，其中以貴州的刺梨資源最為豐富[1]。刺梨黃酮類化合物中包括木犀草素、兒茶素、異槲皮素、槲皮素、楊梅素、蘆丁、山奈素等多種有效成分，具有抗氧化[2]、輻射防護(hù)[3]、防治糖尿病[4-5]、預(yù)防動脈粥樣硬化[6]、抗癌[7]與抗凋亡[8-10]等生物活性。近年來，以無機(jī)鹽和短鏈醇為基礎(chǔ)的新型雙水相體系（Aqueous two-phase system，ATPS）[11-14]具有成本低、界面張力低、分辨率好、產(chǎn)率高、放大簡單等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種很有前景的提取技術(shù)，它具有提取和部分純化目標(biāo)物的功能，還可以在獲得高得率的同時(shí)保持分子的生物活性。ATPS 應(yīng)用于生物活性成分的提取技術(shù)已十分成熟，如酶[15]、蛋白質(zhì)[16]、多糖[17-19]和黃酮等，但還未應(yīng)用于刺梨黃酮的提取。

黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）是一種由兩個(gè)完全對稱亞單位組成的蛋白酶，是調(diào)控尿酸生成的關(guān)鍵酶。血液中尿酸含量增加會導(dǎo)致高尿酸血癥（Hyperurcicemia，HUA）[20]。多項(xiàng)研究表明黃酮類化合物諸如山奈素、落新婦苷及其異構(gòu)體[21]、木犀草素、芹菜素、兒茶素等可以與黃嘌呤氧化酶的活性中心結(jié)合從而抑制其活性，這一發(fā)現(xiàn)提示黃酮類化合物或許可以作為HUA 的有效發(fā)生抑制劑。目前，HUA的治療主要集中在抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄上，代表藥物分別為別嘌醇和苯溴馬隆[22]。然而，這些藥物在臨床應(yīng)用中有著嚴(yán)重的副作用，如肝腎毒性和Stevens-Johnson 綜合征等[23]，因此尋找更加安全的植物提取物治療HUA 迫在眉睫。

當(dāng)前有關(guān)刺梨黃酮雙水相萃取的工藝優(yōu)化和其抑制XOD 活性方面的研究資料較少。植物提取物治療HUA 的研究主要集中在XOD 抑制劑的篩選[24-25]和影響尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)上[26-27]。因此，本試驗(yàn)以刺梨為原料，旨在構(gòu)建超聲波輔助乙醇（C2H5OH）-硫酸銨（（NH4）2SO4）雙水相萃取刺梨黃酮的技術(shù)體系以及確定最佳提取工藝，為深入開發(fā)植物資源和工業(yè)生產(chǎn)中高效提取刺梨黃酮提供科學(xué)依據(jù)，并通過對刺梨黃酮提取物抑制黃嘌呤氧化酶效果的研究，為發(fā)現(xiàn)一種天然黃嘌呤氧化酶抑制劑及刺梨功能活性的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨鮮果 購自貴州恒力源生物科技有限公司；XOD（50 U/mg）、黃嘌呤（98%）、蘆丁（95%）、別嘌醇（98%） BR，均購自上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、EDTA-2Na、硫酸銨、乙醇 均為分析純；水為純水。

SCIENTZ-18N 冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；CS-2000Y 超帥多功能粉碎機(jī) 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；FA2004N 電子天平 上海菁海儀器有限公司；KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；THERMO 酶標(biāo)儀 百樂科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將刺梨鮮果切片后冷凍干燥，粉碎過100 目篩后放入保鮮袋，于2 ℃冰箱中保存。

1.2.2 C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相相圖繪制 采用濁度滴定法[28]繪制C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相相圖中雙節(jié)線。向40% （NH4）2SO4溶液中滴加無水乙醇至溶液渾濁，記錄加入C2H5OH 溶液的質(zhì)量，后加入蒸餾水至溶液澄清，記錄加入蒸餾水的質(zhì)量。反復(fù)操作并記錄，操作完成之后計(jì)算出記錄的C2H5OH-（NH4）2SO4質(zhì)量濃度，繪制相圖。

1.2.3 刺梨黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用亞硝酸鈉（NaNO2）-硝酸鋁（Al（NO3）3）比色法[29]。配制1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)液，用70%乙醇定容至1 mL，取50 μL 至96 孔板后加入30 μL 5%NaNO2，靜置6 min，再加入30 μL 10%Al（NO3）3，靜置6 min，加入100 μL 4%NaOH，反應(yīng)30 min 后于510 nm 處測吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程A=1.3994x-0.0002，R2=0.9991。

1.2.4 構(gòu)建雙水相體系 固定體系質(zhì)量為50 g，根據(jù)乙醇-硫酸銨雙水相相圖，選取14%、16%、18%、20%、22%的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和28%、30%、32%、34%、36%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，考察硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響時(shí)，固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%；考察乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響時(shí)選取最佳硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對刺梨黃酮得率的影響。在100 mL 離心管中構(gòu)建49.00 g 雙水相體系（例：49.00 g 32%C2H5OH-20%（NH4）2SO4雙水相體系，稱取9.80 g 硫酸銨和15.68 g無水乙醇，剩余質(zhì)量由蒸餾水補(bǔ)充，混合均勻）后加入1.00 g 的刺梨粉末，將離心管置于超聲清洗器中超聲，固定功率400 W，溫度50 ℃，超聲30 min。用布氏漏斗抽濾，濾液置于分液漏斗中靜置20 min 使其分相完全，分離后分別測量上下相體積，計(jì)算相比（R）；取上下相溶液測定其黃酮得率（Y），計(jì)算刺梨黃酮的分配系數(shù)（K）和萃取率（X）[30]。

式中：Vt、Vb 為上、下相體積，mL；Ct、Cb 為上、下相溶液黃酮濃度，mg/mL；n 為稀釋倍數(shù)；m 為刺梨粉的質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）及料液比（D）對刺梨黃酮得率的影響。

1.2.5.1 超聲功率對刺梨黃酮得率的影響 固定體系質(zhì)量為50 g，考察不同的功率對黃酮得率的影響，在離心管中加入32% C2H5OH，加入20% （NH4）2SO4，加入1.00 g 刺梨粉，剩余質(zhì)量由蒸餾水補(bǔ)充，按照1.2.4 方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，超聲功率分別設(shè)置為240、280、320、360、400 W，其它條件不變。

1.2.5.2 超聲時(shí)間對刺梨黃酮得率的影響 考察不同的超聲時(shí)間對黃酮得率的影響，固定超聲功率為上述條件最優(yōu)值，對其進(jìn)行超聲處理，時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 min，其他條件不變。

1.2.5.3 超聲溫度對刺梨黃酮得率的影響 固定超聲功率和時(shí)間為上述實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)值，其他條件不變，溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70 ℃，考察不同的溫度對黃酮得率的影響。

1.2.5.4 料液比對刺梨黃酮得率的影響 考察不同的料液比對黃酮得率的影響，固定超聲功率、時(shí)間和溫度為上述實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)值，其它條件不變，料液比分別設(shè)置為1:29、1:39、1:49、1:59、1:69（g/g）。

1.2.5.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定4 個(gè)因素的較優(yōu)水平范圍，以黃酮得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1 所示。

1.2.6 刺梨黃酮提取物抑制黃嘌呤氧化酶活性研究 將優(yōu)化工藝條件下的刺梨黃酮提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥，保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

在酶促反應(yīng)過程中，XOD 是通過調(diào)節(jié)兩個(gè)基本氧化反應(yīng)控制尿酸產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，包括催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸[31]。取刺梨黃酮提取物凍干粉末，用蒸餾水配制8、10、12、14、16、18、20 mg/mL 濃度的提取液，按照表2 中各物質(zhì)添加量進(jìn)行試驗(yàn)，向96 孔板依次加入磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.5、50 mmol/L、含200 μmol/L EDTA-2Na）、刺梨黃酮提取液、黃嘌呤氧化酶（0.1 U/mL）溶液，在37 ℃下孵育5 min 后，加入底物黃嘌呤溶液（0.15 mmol/L），在37 ℃下反應(yīng)20 min 后，于295 nm 處測定吸光值[32]。

表2 酶活測定體系的組成（μL）Table 2 Composition of the enzyme activity assay system (μL)

式中，AE=A對照組-A空白對照組；AI=A樣品組-A空白組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 25 進(jìn)行顯著性分析及Origin 2017軟件繪制趨勢曲線圖；響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 11 軟件進(jìn)行方差分析，半抑制濃度（IC50）通過SPSS 25 軟件計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖和雙水相體系確定

2.1.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖 由圖1 可知，C2H5OH-（NH4）2SO4在較大濃度范圍內(nèi)均具有良好的成相能力，與報(bào)道一致[33]；雙節(jié)線上的點(diǎn)為臨界點(diǎn)，雙節(jié)線以下的區(qū)域，兩種溶劑均溶于水而不分相，稱為均相區(qū)；而體系總組成配比取在雙節(jié)線上方的區(qū)域，體系就會分為兩相，稱為雙相區(qū)。其中上相為富乙醇相，下相為富鹽相，黃酮類物質(zhì)極性較小而富集于上相。因此，在實(shí)驗(yàn)時(shí)，乙醇和硫酸銨的配比應(yīng)取在雙節(jié)線上方，并取上相溶液作為待測液進(jìn)行研究。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of ethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system

2.1.2 雙水相體系確定

2.1.2.1 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對刺梨黃酮分相萃取的影響 圖2 表明，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20%時(shí)，黃酮得率、萃取率和分配系數(shù)均隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加（P＜0.05），當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，刺梨黃酮得率（116.57 mg/g）、萃取率（63.47%）及分配系數(shù)（1.57）均達(dá)到最高；當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過20%后，（NH4）2SO4在雙水相體系會在中析出，會造成硫酸銨和乙醇對水分子的競爭，極性增大[34]，使上相乙醇的體積減小，從而導(dǎo)致刺梨黃酮的溶出受到抑制，使萃取率和分配系數(shù)下降。因此C2H5OH-（NH4）2SO4ATPS 中（NH4）2SO4的最佳添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

2.1.2.2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對刺梨黃酮分相萃取的影響

如圖3 所示，隨著C2H5OH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，刺梨黃酮得率、萃取率和分配系數(shù)呈先增大后減小的趨勢（P＜0.05）。乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%時(shí)，3 個(gè)指標(biāo)均達(dá)到最大值，分別為122.79 mg/g、95.98%和11.141，而后隨著C2H5OH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，3 個(gè)指標(biāo)均出現(xiàn)下降。這可能是黃酮在乙醇中的溶解度更大，隨著C2H5OH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，ATPS 的分相能力增加[35]，而在C2H5OH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，會導(dǎo)致下相鹽的析出，同時(shí)其他物質(zhì)在上相中的溶出量也大大增加，這會導(dǎo)致黃酮的析出減少[36]。因此確定C2H5OH-（NH4）2SO4ATPS 最佳的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%。

圖3 C2H5OH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對黃酮得率、萃取率及分配系數(shù)的影響Fig.3 Effect of ethanol mass fraction on the yield of flavonoids, extraction rate and partition coefficient

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 超聲功率對黃酮得率的影響 如圖4 所示，刺梨黃酮的得率隨著超聲功率的增加而呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)超聲功率達(dá)到320 W 時(shí)，得率達(dá)到最大值125.48 mg/g，而當(dāng)超聲功率超過320 W 后，黃酮得率略有減小，無顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于超聲波加速了刺梨粉在提取液中運(yùn)動，從而增加黃酮的溶出，繼續(xù)增大超聲功率時(shí)，功率過大導(dǎo)致刺梨細(xì)胞過度破碎，刺梨黃酮類成分發(fā)生聚合或分解等反應(yīng)[37]，造成刺梨黃酮得率下降。因此，當(dāng)超聲功率為320 W 時(shí)，刺梨黃酮得率較好。

圖4 超聲功率對刺梨黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of Rose roxburghii Tratt flavonoids

2.2.2 超聲時(shí)間對黃酮得率的影響 由圖5 知，刺梨黃酮得率隨著時(shí)間的增加，出現(xiàn)先上升（P＜0.05）后下降的趨勢，當(dāng)超聲時(shí)間增加到30 min 時(shí)，黃酮得率達(dá)到峰值125.34 mg/g，隨后降低。隨著超聲時(shí)間延長，細(xì)胞裂解完全，黃酮得率增加；超過一定時(shí)間,可能會使刺梨中的皂苷類等物質(zhì)溶出，使黃酮類物質(zhì)在上相的溶出量減少[37]。因此，確定黃酮超聲提取的最適時(shí)間為30 min。

圖5 超聲時(shí)間對刺梨黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of Rose roxburghii Tratt flavonoids

2.2.3 超聲溫度對黃酮得率的影響 如圖6 所示，刺梨黃酮得率隨著溫度的增加，出現(xiàn)先上升后下降的趨勢（P＜0.05），當(dāng)超聲溫度達(dá)到50 ℃刺梨黃酮得率達(dá)到峰值，為125.29 mg/g，繼續(xù)增大超聲溫度，黃酮得率下降。可能是當(dāng)ATPS 溫度過高時(shí)，黃酮類成分發(fā)生結(jié)構(gòu)變化甚至氧化分解等反應(yīng)[38]。因此，當(dāng)超聲提取溫度為50 ℃時(shí)，黃酮得率較高。

圖6 超聲溫度對刺梨黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Rose roxburghii Tratt flavonoid

2.2.4 料液比對黃酮得率的影響 由圖7 顯示，隨著料液比的增大，刺梨黃酮得率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢（P＜0.05）。當(dāng)料液比為1:59（g/g）時(shí)，刺梨黃酮得率最大，達(dá)到137.19 mg/g，可能是溶劑增多導(dǎo)致提取液與刺梨粉末接觸面積增大，促進(jìn)黃酮類成分自刺梨粉中溶出。但當(dāng)液料比繼續(xù)增加到1:69（g/g）時(shí)，黃酮得率顯著下降（P＜0.05）。可能是由于上相體積增大導(dǎo)致黃酮濃度下降，同時(shí)還會造成其他物質(zhì)的溶出加劇，也會抑制黃酮的提取[36]。除此之外，料液比過大會造成C2H5OH 和（NH4）2SO4使用量增加，增加生產(chǎn)成本。綜上所述最適料液比為1:59（g/g）。

圖7 料液比對刺梨黃酮得率的影響Fig.7 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of Rose roxburghii Tratt flavonoid

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相萃取刺梨黃酮的結(jié)果如表3 所示。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及對應(yīng)的響應(yīng)值Table 3 Experimental design and corresponding response values

采用Design-Expert11 對刺梨黃酮得率結(jié)果進(jìn)行擬合，得到回歸方程如下：

方差分析結(jié)果如表4 所示，回歸模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），實(shí)測值與預(yù)測值相近，試驗(yàn)決定系數(shù)R2=0.9801、校正決定系數(shù)R2adj=0.9601 和變異系數(shù)C.V.%=2.13%，表明模型擬合程度較好；超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度及料液比之間相互作用的響應(yīng)面曲線圖如圖8 所示。通過響應(yīng)面圖可直觀地看出各因素之間相互影響的顯著性，模型中的AD、BD 對刺梨黃酮得率的影響差異極顯著（P＜0.01），AB、AC、BC、CD 對刺梨黃酮得率的影響差異不顯著（P＞0.05），此模型可以對雙水相提取刺梨黃酮的結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。4 個(gè)因素對刺梨黃酮得率的影響次序?yàn)锽＞D＞A＞C，即超聲時(shí)間＞料液比＞超聲功率＞超聲溫度。

圖8 各因素對響應(yīng)值影響的曲面圖Fig.8 Surface plot of the influence of various factors on the response value

表4 二次模型方差統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Anaiysis of the variance (ANOVA) for the second-order polynomial model

2.3.2 最佳工藝條件的預(yù)測及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面模型，以最大得率為指標(biāo)，預(yù)測的雙水相提取刺梨黃酮的最佳工藝條件為：超聲功率322.78 W，時(shí)間為30.35 min，溫度49.39 ℃，料液比1:58.66 g/g，理論黃酮得率為141.69 mg/g，為了驗(yàn)證預(yù)測值的準(zhǔn)確性，兼顧實(shí)際應(yīng)用，將最佳工藝條件調(diào)整為：超聲功率320 W，時(shí)間為30 min，溫度50 ℃，料液比1:59 g/g，在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證，平行試驗(yàn)3 次，測得刺梨黃酮平均得率為（140.57±1.78） mg/g，與預(yù)測值較近，表明該模型適用于刺梨黃酮的提取，所得刺梨黃酮純度可達(dá)18.72%。

2.4 刺梨黃酮提取物對XOD 的抑制效果分析

研究發(fā)現(xiàn)，活性物如：木犀草素、芹菜素[39]、表沒食子兒茶素[40]、槲皮素[41]等黃酮類物質(zhì)可以通過與XOD 活性中心結(jié)合從而抑制黃嘌呤氧化酶的活性，減少尿酸生成。如圖9 所示，刺梨黃酮提取物對XOD 表現(xiàn)出較好的抑制作用，且隨著刺梨黃酮提取物濃度的增加，抑制率也逐漸升高，表現(xiàn)出較好劑量-效應(yīng)關(guān)系；通過SPSS 分析計(jì)算，得到刺梨黃酮提取物對XOD 的IC50為12.72 mg/mL，與0.24 mmol/L（0.0324 mg/mL）別嘌醇抑制率相當(dāng)，與葛根水提物（11.24 mg/mL）和老鸛草水提物（11.61 mg/mL）[42]、辣木葉的醇提物（10.55 mg/mL）[43]、銀杏葉醇提物（13.67 mg/mL）[44]抑制活性接近。證明刺梨黃酮提取物對于XOD 有較好的抑制效果，可以做為一種天然的XOD 活性抑制劑。

圖9 不同濃度的刺梨黃酮提取物和別嘌醇對黃嘌呤氧化酶活力的影響Fig.9 Effects of different concentrations of Rose roxburghii Tratt extract and allopurinol on the activity of xanthine oxidase

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助雙水相技術(shù)提取刺梨黃酮，確定最佳提取工藝為：32% C2H5OH～20%(NH4)2SO4ATPS，超聲功率320 W，時(shí)間30 min，溫度50 ℃，料液比1:59 （g/g）。此工藝下刺梨黃酮的得率為140.57 mg/g，其對XOD 的抑制IC50值為12.72 mg/mL。本試驗(yàn)表明刺梨黃酮提取物能夠較好的抑制黃嘌呤氧化酶的活性，可以作為一種較好的天然XOD 抑制劑開發(fā)利用。