基于響應面法和人工神經網絡優化復合乳酸菌發酵藍莓汁產胞外多糖工藝

龔敏慧，單成俊，李雙健，楊素群，王 英，劉小莉，周劍忠,

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013；2.江蘇省農業科學研究院農產品加工研究所，江蘇南京 210014）

乳酸菌是革蘭氏陽性菌，具有調節腸道菌群平衡、提高免疫功能、抗氧化等益生特性[1]。胞外多糖（exocytopolysaccharid，EPS）是乳酸菌發酵產生的一種高附加值產品，一般由L-巖藻糖、D-葡萄糖、D-氨基葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和L-鼠李糖通過糖苷鍵組成。研究表明，乳酸菌中的EPS 具有多種生物學功能，包括抗腫瘤、抗潰瘍活性、抗病毒和降低膽固醇等[2]，廣泛應用于制藥和食品工業[3]。

乳酸菌EPS 含量通常受發酵工藝的影響，例如初始pH、接種量、發酵溫度和發酵時間等[4]。目前，EPS 發酵工藝優化通常采用傳統的單因素法[5]、響應面法（RSM）[6]、正交試驗[4]等多種優化方法。傳統的單因素法既費力又耗時，而且往往忽略了影響因素之間相互作用的影響。RSM 在過程和產品改進中得到了廣泛而有效的應用，常被用于實驗設計、模型開發等操作變量的檢查和優化[7]。盡管RSM 等統計方法已被證明比單因素法更有效，但它們有一定的局限性，即參數和級別的數量是有限的。為了克服這些問題，基于人工智能的優化方法如人工神經網絡（ANN）和遺傳算法（GA）得到發展。ANN 是一種強大的建模技術，與傳統建模技術相比，它可以在不考慮現象學機制本質的前提下建模，理解問題背后的數學背景，并能夠直接從一組示例中學習變量之間的線性和非線性關系[8]。ANN 可以單獨使用，也可以與其他方法如RSM 或GA 相結合。Gadekar等[9]使用了RSM-ANN 聯合方法來增強染料去除效果，Gammoudi 等[10]利用RSM、ANN-GA 和Simulink 模型相結合來提高突尼斯辣椒中辣椒素的提取量。類似地，RSM-ANN 方法已被用于乳酸菌EPS 的提取及優化[11]，但是在優化發酵果蔬汁中EPS 含量的研究尚未報道。

藍莓汁富含多種營養成分，如多糖、氨基酸、維生素等，以藍莓汁為發酵基質可以很好地促進乳酸菌的生長，同時乳酸菌發酵可以提高藍莓汁的營養價值和風味[12]。目前，乳酸菌發酵藍莓汁常以活菌數為指標，鮮以EPS 含量為指標的研究。本研究以藍莓為原料，采用實驗室已篩選得到的三株高產胞外多糖乳酸菌進行發酵，以EPS 含量為指標，利用單因素法和Box-Behnken（BB）試驗篩選得到關鍵因素，采用ANN-GA 建立神經網絡模型，得到最佳發酵工藝條件，提高乳酸菌發酵藍莓汁中的EPS 含量，為開發新型藍莓汁飲料提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南高叢藍莓凍果 南京雙吉農業發展有限公司提供；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）9sh、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SR2-6、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）GM11 江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室篩選保藏；碳酸氫鈉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、大豆肽、玉米低聚肽、膠原蛋白肽、酪蛋白磷酸肽、乳清蛋白粉 浙江諾一有限公司提供；MRS 肉湯培養基 北京奧博星生物技術有限公司；濃硫酸 南京化學試劑股份有限公司；苯酚、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司。

3K15 離心機 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；酶標儀TG600 云鉑儀器成都有限公司；LRH-150 生化培養箱、 DHG-9023A 烘箱 上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-1C 型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；榨汁機 廣東德瑪仕智能廚房設備有限公司；HH-4 恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備 將植物乳桿菌9sh、發酵乳桿菌SR2-6 和檸檬明串珠菌GM11 于MRS 固體培養基上37 ℃活化48 h，挑取單菌落接種到MRS 液體培養基中，37 ℃培養24 h，在4000 r/min 條件下離心10 min 去上清液，用無菌水洗滌沉淀、離心，重復2～3 次，用無菌水重懸，使菌密度達到1.0×107CFU/mL。

1.2.2 藍莓汁的制備 將冷凍藍莓在室溫解凍，打漿，在4500 r/min 條件下離心15 min，40 目濾布過濾得到藍莓汁，用0.1 mol/L 碳酸氫鈉調節pH 至4.5，加入6%（w/v）的蔗糖和0.6%（w/v）的大豆肽進行調配，攪拌均勻，85 ℃巴氏殺菌25 min，待其冷卻后接入6%（v/v）的種子液，菌種比例為1:1:1，37 ℃靜置培養48 h，于4 ℃放置2 h 以停止發酵。

1.2.3 發酵工藝優化單因素實驗 參考曹楨[13]的方法對發酵工藝進行單因素實驗。在1.2.2 的基礎上，以EPS 含量和活菌數為檢測指標，考察植物乳桿菌9sh、發酵乳桿菌SR2-6 和檸檬明串珠菌GM11 的菌種比例（1:0:0、0:1:0、0:0:1、1:1:0、1:0:1、0:1:1、 1:1:1、 2:1:1、 1:2:1、 1:1:2、 2:2:1、2:1:2、1:2:2），碳源種類（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖），碳源添加量（0%、2%、4%、6%、8%、10%），氮源種類（大豆肽、玉米低聚肽、膠原蛋白肽、酪蛋白磷酸肽、乳清蛋白粉），氮源添加量（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%），初始pH（原始 pH2.8、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0），接種量（2%、4%、6%、8%、10%），發酵溫度（28、30、32、34、36、38 ℃），發酵時間（12、24、36、48、60、72 h）對發酵藍莓汁的影響，確定最佳單因素水平。

1.2.4 發酵工藝優化響應面試驗 基于單因素實驗結果，利用BB 試驗設計，以EPS 含量為響應值，選擇影響最大的四個因素：初始pH（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）為自變量。響應面試驗因子水平編碼見表1。

1.2.5 人工神經網絡建模 在響應面試驗的基礎上，通過MATLAB 軟件建立BP 神經網絡模型，對EPS含量進行預測。該模型使用具有雙曲正切sigmoid傳遞函數和線性傳遞函數的前饋網絡，結合Levenberg-Marquartd 反向傳播算法進行測試。將樣本隨機分為訓練、驗證和測試，分別占數據的70%、15%和15%。輸入層有4 個神經元 [初始pH（A），接種量（B），發酵溫度（C），發酵時間（D）]，輸出層有一個神經元[EPS 含量（Y）]。初始層與網絡的輸入相連，輸入數據通過生成隨機權重映射到隱藏層。通過前向計算和權重矩陣生成，隱藏層將數據映射到輸出層，得到預測值。通過計算預測值與真實值的誤差，如果誤差沒有達到設定的神經網絡訓練誤差極限，則重復上述過程。經過反復訓練，當預測值與真實值的誤差達到誤差極限或達到設定的訓練次數時，神經網絡訓練將終止。訓練的最大epoch 數為1000，學習率為0.01，訓練目標的最小誤差為0.00001。隱藏神經元的數量通過反復實驗而變化，直到網絡在訓練后表現最佳，得到BP 神經網絡模型，最后利用GA 求解該模型的最優值。均方誤差（MSE）是輸出和目標之間的平均平方差，MSE 值越低越好?；貧wR值衡量了產出和目標之間的相關性，R值為1 表示密切關系，0 表示隨機關系。

1.2.6 指標測定方法

1.2.6.1 EPS 含量的測定 參考戴意強等[14]的方法測定EPS 含量。將發酵藍莓汁在4000 r/min 條件下離心10 min，取1.0 mL 上清液置于10 mL 離心管中，加入9.0 mL 無水乙醇，混合均勻后于4 ℃靜置過夜，4000 r/min 離心10 min，棄上清液，用80%乙醇洗滌、離心2～3 次，加入5.0 mL 去離子水溶解得到粗EPS 溶液。采用苯酚-硫酸法測定EPS 含量。

將葡萄糖于105 ℃干燥箱中烘干至恒重，稱取10 mg 置于100 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，配置成0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 于具塞試管中，用去離子水補齊至1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL 濃硫酸，混勻后于37 ℃下靜置20 min，并于490 nm 下測定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到葡萄糖標準曲線：y=0.0048x+0.0855（R2=0.9983）。根據葡萄糖標準曲線計算發酵藍莓汁中的EPS 含量。

1.2.6.2 活菌數的測定 根據GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》[15]中的方法檢測發酵藍莓汁中的活菌數。

1.3 數據處理

所有實驗重復3 次，結果用平均值±標準差表示。采用Excel 和Origin 2021 對單因素實驗結果進行分析并作圖；采用Design Expert 8.0.6 進行響應面試驗設計及數據分析；采用SPSS 26.0 進行差異顯著性分析；采用MATLAB 軟件建立人工神經網絡模型。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝優化單因素實驗結果

2.1.1 菌種比例對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響 菌種比例對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響如圖1 所示。植物乳桿菌9sh、發酵乳桿菌SR2-6、檸檬明串珠菌GM11 在藍莓汁中混合發酵所產生的EPS 含量和活菌數高于單獨發酵產生的EPS 含量和活菌數，表明三種乳酸菌可以進行混合發酵?；旌习l酵時，發酵乳桿菌SR2-6 比例過高（1:2:1、2:2:1、1:2:2）或檸檬明串珠菌GM11 比例過高（1:1:2、2:1:2、1:2:2）時，均會出現發酵不足、糖代謝不充分的問題，原因是SR2-6 和GM11 為異型發酵乳酸菌，延滯期短，能迅速繁殖產生乳酸等物質，降低環境的pH；9sh 為同型發酵菌種，發酵后期乳酸濃度繼續增高，大部分乳酸菌的活動逐漸受到抑制，而耐酸性較強的9sh 成為優勢菌，繼續發酵[16]。當植物乳桿菌9sh、發酵乳桿菌SR2-6、檸檬明串珠菌GM11 的比例為2:1:1 時，菌種生長旺盛，達到1.75×109CFU/mL，高于其他實驗組，此時藍莓汁中的EPS 含量最高，為1.736 g/L，原因可能是植物乳桿菌9sh 所占比例最高，而植物乳桿菌是從植物中分離純化得到的，更能適應藍莓汁的生長環境[17]，充分利用碳氮源產生EPS。

圖1 菌種比例對發酵藍莓汁中EPS 和活菌數的影響Fig.1 Effects of strain ratio on EPS and number of viable count in fermented blueberry juice

2.1.2 碳源種類和添加量對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響 碳源是乳酸菌生長繁殖過程中必不可少的營養物質，其種類和含量影響EPS 的合成[18]。碳源種類和添加量對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響見圖2。

圖2 碳源種類（a）和添加量（b）對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響Fig.2 Effects of carbon source types (a) and additive amount(b) on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

由圖2a 可知，與空白對照組相比，四個實驗組發酵后產生的EPS 含量均升高，但葡萄糖作為碳源時，其EPS 含量僅略高于空白對照組，這是因為乳酸菌利用葡萄糖的過程中會產生大量的有機酸，使得pH 迅速下降，而pH 發生變化不利于EPS 的積累[19]；此外，五個實驗組的活菌數均在1.0×109CFU/mL以上，其中蔗糖、葡萄糖、麥芽糖的活菌數低于對照組，可能是因為補充蔗糖、葡萄糖、麥芽糖對這三株乳酸菌的生長沒有促進作用。當乳糖為補充碳源時EPS 含量最高，為2.385 g/L，其次是蔗糖、麥芽糖和葡萄糖，可能是因為三種乳酸菌利用乳糖的效果較好，故選擇乳糖作為藍莓果汁的補充碳源。

由圖2b 可知，隨著乳糖添加量的增加，EPS 含量和活菌數均呈現先升后降的趨勢，且在6%時達到峰值，EPS 含量為2.392 g/L。當乳糖添加量增加到10%時，EPS 含量不存在顯著性差異（P＞0.05），這是由于較低添加量的乳糖可以促進乳酸菌的生長代謝，較高添加量的乳糖會改變乳酸菌的細胞滲透壓，從而抑制EPS 的合成[20]，因此選擇乳糖添加量為6%。

2.1.3 氮源種類和添加量對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響 氮源是乳酸菌所需的六大營養素之一，由于乳酸菌自身不能合成蛋白質，只能利用環境中的蛋白質以滿足生長的需要，因此在藍莓果汁中補充氮源是必要的[17]。氮源種類和添加量對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響見圖3。

圖3 氮源種類（a）和添加量（b）對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響Fig.3 Effects of nitrogen source types (a) and additive amount(b) on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

如圖3a 所示，不同氮源種類對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數有顯著影響（P＜0.05），且兩者變化趨勢一致，表明EPS 的合成與發酵菌株的生長情況有一定的關系，其中玉米低聚肽與對照組差異不明顯，可能是因為玉米低聚肽在藍莓汁中的溶解性差，乳酸菌可利用的營養成分較其他組少，故影響EPS 的合成[21]；乳清蛋白粉的活菌數與對照組接近，原因是乳清蛋白粉對乳酸菌的生長沒有作用，但可以促進EPS 的合成。添加大豆肽和膠原蛋白肽的發酵藍莓汁中分別產生2.448 g/L 和2.313 g/L 的EPS 含量，顯著高于其它氮源（P＜0.05），可能原因是這三種乳酸菌可以較好地分解利用大豆肽和膠原蛋白肽以合成更多的EPS，且與膠原蛋白肽相比，大豆肽含有大量易于被人體吸收的小分子量的低聚肽，使其具有更好的低變應原[22]，因此選擇大豆肽作為補充氮源。

如圖3b 所示，隨著大豆肽添加量的增加，發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數均呈現先升后降的趨勢，當大豆肽添加量過低時，細胞合成乳酸菌生長繁殖時所需的蛋白質、核酸等受到影響，進而影響產糖量[23]；當大豆肽添加量過高時，發酵液粘稠，溶氧量減小，導致菌株產糖的分泌與合成受到影響[24]。當大豆肽添加量為0.6%時EPS 含量最高，為2.394 g/L，因此選擇大豆肽添加量為0.6%。

2.1.4 初始pH 對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響 初始pH 對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響見圖4。由圖4 可知，隨著初始pH 的增加，發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數均呈現先升后降的趨勢，這一結果與李春雨等[25]的研究一致，原因是pH 過高會使乳酸菌在生長過程中產生大量的乳酸和酶類，使藍莓汁的pH 迅速下降，不利于乳酸菌的生長，且分泌的酶類對EPS 有降解作用[26]；pH 過低會使脂中間體異戊二烯脂的運載活性受阻，從而抑制EPS 的合成[27]。當初始pH 為4.5 時EPS 含量達到最大，為2.513 g/L，因此選擇初始pH 為4.5。

圖4 初始pH 對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響Fig.4 Effect of initial pH values on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

2.1.5 復合發酵菌種接種量對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響 復合發酵菌種接種量對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響見圖5。由圖5 可知，接種量對EPS 含量和活菌數有顯著影響（P＜0.05），EPS 含量隨著接種量的增加呈現先升后降的趨勢，主要由于接種量較低時乳酸菌生長比較活躍，當接種量超過8%時活菌數趨于平穩，藍莓汁生長環境中的營養物質減少，EPS 的積累受到限制[28]。當接種量為8%時EPS 含量達到最大，為2.557 g/L，因此選擇接種量為8%。

圖5 復合發酵菌種接種量對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響Fig.5 Effects of inoculation amount of compound fermentation cultures on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

2.1.6 發酵溫度對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響 發酵溫度是影響乳酸菌生長繁殖的一個重要因素，發酵溫度對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響見圖6。由圖6 所示，當發酵溫度小于30 ℃時，EPS 含量隨發酵溫度的升高而增大，原因是發酵溫度過低時乳酸菌生長緩慢，不利于其生長代謝[25]；當發酵溫度在30～34 ℃之間時，EPS 含量差異不顯著；當發酵溫度大于34 ℃時，EPS 含量降低，因為提高發酵溫度會使乳酸菌體內的酶失活，減少EPS 含量的合成[29]。因此從考慮成本的角度出發，選擇發酵溫度為30 ℃，此結果與邢瀚文[30]報道一致。

圖6 發酵溫度對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

2.1.7 發酵時間對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響 發酵時間對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響見圖7。由圖7 所示，六個實驗組的活菌數均在1.0×109CFU/mL 以上，EPS 含量隨發酵時間的延長而增大，原因是乳酸菌處于生長旺盛期，EPS 含量逐漸積累；當乳酸菌發酵到60 h 時EPS 含量達到最大，為2.736 g/L，此時乳酸菌進入穩定期，活菌數保持動態平衡；發酵后期，乳酸菌進入衰亡期，此時藍莓果汁中pH 降低，藍莓果汁中的碳氮源大量減少，代謝廢物增加，同時乳酸菌代謝過程中產生的糖基水解酶會降解EPS，使EPS 含量降低[31]。綜上所述，選擇發酵時間為60 h。

圖7 發酵時間對發酵藍莓汁中EPS 含量和活菌數的影響Fig.7 Effect of fermentation time on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

2.2 響應面試驗優化結果

響應面試驗設計及結果如表2 所示。對表2 試驗結果進行回歸分析，建立EPS 含量（Y）對初始pH（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）的回歸模型，得到二次多項回歸方程為：

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

由表3 可知，回歸模型的F值=45.16，P值＜0.0001，說明該模型極其顯著（P＜0.01），具有統計學意義；失擬項的P值=0.8423＞0.05，且決定系數R2=0.9242，調整決定系數R2Adj=0.8485，說明失擬項檢驗不顯著。調整決定系數R2Adj與決定系數R2值稍遠，這表明在設計或結果中存在噪聲[32]。從回歸模型中各項P值可知，B、BC、A2、B2、C2、D2對EPS含量的影響極顯著（P＜0.01），A、C、AC 對EPS 含量的影響顯著（P＜0.05），D、AB、AD、BD、CD 對EPS含量的影響不顯著，且各因素對EPS 含量的影響順序為：接種量＞發酵溫度＞初始pH＞發酵時間。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

各因素交互作用對EPS 含量影響的響應面圖見圖8，通過響應面圖可以反應各因素對EPS 含量的影響[33]。如果響應面的曲線越陡峭，則表示該因素對EPS 含量的影響越大，反之則表示影響越小[34]。由圖8 可知，接種量對EPS 含量的影響最大，與表3方差分析結果一致。文獻[35]報道表明，ANN 在數據建模方面優于RSM，故進一步用ANN-GA 對獲得的數據進行建模。

2.3 人工神經網絡優化結果

通過使用ANN-GA 進一步優化RSM 中獲得的數據，以獲得更高的EPS 含量。采用具有誤差反向傳播的前饋神經網絡對數據進行建模，并使用遺傳算法獲得所選參數的最佳條件。選定的四個變量被選為輸入層的輸入神經元，EPS 含量被選為輸出層的輸出神經元。圖9 顯示了構建的神經網絡的拓撲結構。

圖9 EPS 含量構建網絡的拓撲結構Fig.9 Topology of a constructed network for EPS content

利用BP 神經網絡對BB 試驗結果進行分析，得到人工神經網絡模型均方誤差圖和模擬仿真效果圖，見圖10、圖11。

圖10 人工神經網絡模型均方誤差效果圖Fig.10 Mean square error of artificial neural network model

圖11 人工神經網絡模擬仿真效果圖Fig.11 Simulation effect of artificial neural network

如圖10、圖11 所示，當迭代次數為10 時，BP 神經網絡訓練結束，此時訓練集均方誤差為0.025043，訓練、驗證和測試數據的R值分別為0.96991、0.97647 和0.97452，總體R值為0.9343，表明擬合良好。通過遺傳算法求解該模型的最優值，得到最佳發酵工藝條件為初始pH4.53，接種量7.89%，發酵溫度30.08 ℃，發酵時間60.11 h，此時EPS 含量達到3.565 g/L?？紤]到實驗的實際操作性，將最佳發酵工藝條件調整為初始pH4.5，接種量8.0%，發酵溫度30 ℃，發酵時間60 h。在此條件下進行3 次驗證實驗，得到EPS 含量實際值為3.537 g/L，與預測值相比基本一致，可見BP 神經網絡的模型合理、準確性高[35]。因此采用RSM-ANN 優化發酵藍莓汁提高EPS 含量的工藝條件準確可靠，可用于以后的乳酸菌發酵藍莓汁提高EPS 含量的研究中。

3 結論

本研究采用單因素法對菌種比例、碳氮源種類及添加量、初始pH、接種量、發酵溫度和發酵時間進行優化，選擇四個主要因素：初始pH、接種量、發酵溫度和發酵時間，利用RSM 建立響應面模型。從回歸模型可知，接種量對EPS 含量的影響極顯著（P＜0.01），初始pH、發酵溫度影響顯著（P＜0.05），發酵時間影響不顯著，且各因素的影響順序為：接種量＞發酵溫度＞初始pH＞發酵時間。在此基礎上，用ANN 對獲得的數據進行建模，通過GA 求解該模型的最優值，得到最優發酵工藝條件為植物乳桿菌9sh、發酵乳桿菌SR2-6、檸檬明串珠菌GM11 的菌種比例2：1：1，乳糖6%，大豆肽0.6%，初始pH4.5，接種量8%，發酵溫度30 ℃，發酵時間60 h。通過驗證實驗獲得最大EPS 含量為3.537 g/L，與神經網絡模型得到的預測值基本一致。綜上所述，RSMANN 可用于藍莓汁產EPS 工藝的建模優化，為開發功能性乳酸菌發酵果蔬汁產品奠定了理論基礎。