大果木姜子不同部位揮發油成分及其抗氧化活性分析

郭江濤，張永萍,2,3，劉 杰,2,3, ，徐 劍,2,3, ，程 純,2,3，劉 耀,2,3

（1.貴州中醫藥大學藥學院，貴州貴陽 550025；2.國家苗藥工程技術研究中心，貴州貴陽 550025；3.貴州中藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴州貴陽 550025）

大果木姜子（Cinnamomum migaoH.W.Li）為貴州省十大苗藥之一[1]，為米槁的成熟果實，民間直接將其腌制做泡菜食用，也可與綠茶、羅漢果等共同制備成植物飲料，還可作為腌制具有健脾消食功能鹽皮蛋的調料，并且大果木姜子油可以用于調味、去腥，起到健脾開胃的效果，可開發為具有健脾功效的功能性食品。目前大果木姜子的精油的研究多集中于GC-MS 分析熟果中揮發油組成成分，發現1,8-桉葉素、α-蒎烯、β-蒎烯、萜品油烯等[2-4]是其主要化學成分。現代藥理研究表明，大果木姜子精油具有保護心肌缺血[5]、治療冠心病[6]、房顫[7]等作用，筆者前期研究發現大果木姜子揮發油類成分具有極好的抗氧化作用，可作為潛在的天然抗氧化劑使用[8]。

大果木姜子野生資源較少，9～11 月為采摘期，9 月的果為成熟初期的青果，11 月為熟果。現代研究為大果木姜子熟果的揮發油成分及功效研究提供了充實的數據，但忽略了大果木姜子青果、果柄及葉中揮發油成分的研究，未全面分析大果木姜子不同部位揮發油成分組成及含量差異。通過研究除熟果之外的其它部位，如青果、葉及果柄等的化學成分及抗氧化性能，可尋找到更多具有較好抗氧化活性的部位。基于此，本實驗采用GC-MS 法對大果木姜子青果、熟果及其果柄、葉的化學成分進行分析，結合Nist 17 和Wiley 275 標準質譜圖進行檢索和匹配，并采用峰面積歸一化法測定其相對含量，同時進行對比分析，并對各部位的抗氧化能力進行考察，采用Origin 軟件進行相關性及聚類熱圖分析，以期找到更多具有抗氧化潛力的藥用部位，為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大果木姜子青果、熟果、果柄、葉 經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為樟科樟屬植物米槁Cinnamomum migaoH.W.Li 的果實、柄、葉，詳細信息見表1；維生素C（純度≥99.0%） 成都第一制藥有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，純度≥97.0%） 梯希布（上海）化成工業發展有限公司；2-聯氮-二-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）合肥博美生物科技有限責任公司；無水乙醇（乙醇質量分數≥99.7%） 天津市富宇精細化工有限公司；自制蒸餾水。

表1 大果木姜子青果、熟果、果柄、葉來源信息Table 1 Information on the source of immature fruit, mature fruit, stalk, leaf of C. migao

HP6890 型GC-MS 儀 美國Agilent 公司；98-1-B 電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；N-1001 旋轉蒸發儀 昆明信捷科技有限公司；HAD-1785 揮發油檢測器 安微美星實驗設備有限公司；TG18G 離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司；HH-4 恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 揮發油的制備 采用水蒸氣蒸餾法[2]提取揮發油，稱量粉碎至35 目的大果木姜子熟果、青果、葉各200 g，果柄200 g。以水為提取溶劑按料液比（g/mL）為1:3，靜態浸泡3 h 以增加有效成分的溶出，之后置于揮發油提取器中提取8 h，于揮發油測定器下端緩慢放掉水層，于水油交界處開始收集揮發油，收集上層揮發油后，高速離心（轉速為13000 r/min，時間為10 min，溫度為4 ℃），用移液槍吸取上層液體，即得大果木姜子熟果、青果、果柄、葉的揮發油。

1.2.2 GC-MS 分析 色譜條件：色譜柱為HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，初始溫度70 ℃，以3 ℃/min 升溫至190 ℃，再以10 ℃/min升溫至310 ℃，運行時間：57 min；汽化室溫度230 ℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；柱前壓18.49 psi，載氣流量1.0 mL/min，進樣1 μL（已高速離心除去水分），分流50:1，溶劑延遲時間：6 min。

質譜條件：離子源為EI 源，離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1847 V；接口溫度240 ℃；質量范圍29～500 amu。

1.2.3 抗氧化能力測定

1.2.3.1 DPPH·清除能力的測定 參照參考文獻[9]，制備0.1 mmol/L 的DPPH 工作液。取用無水乙醇稀釋得到的不同濃度（0.5、1、2、4、6、8 mg/mL）大果木姜子不同部位揮發油樣品1 mL 于具塞試管中，加DPPH 溶液3 mL，搖勻置黑暗處反應30 min，在517 nm 處測定吸光度值為A1；空白組用無水乙醇代替樣品溶液為A0；樣品對照組用無水乙醇代替DPPH 溶液為A2，以VC作為陽性對照（質量濃度分別為2、4、6、8、10 μg·mL-1），以上實驗均重復3 次。公式如下：

1.2.3.2 ABTS+·清除能力的測定 參照參考文獻[9]，制備ABTS 工作液。取用無水乙醇稀釋得到的不同濃度（0.5、1、2、4、6、8 mg/mL）大果木姜子不同部位揮發油樣品0.5 mL 于具塞試管中，加ABTS+·工作液3.5 mL，振搖，避光6 min，于734 nm 波長處測定吸光度為A1；空白組用無水乙醇替換樣品溶液為A0；樣品對照組用無水乙醇替換ABTS+·工作液為A2，以VC作為陽性對照（質量濃度分別為2、4、6、8、10 μg·mL-1），以上實驗均重復3 次。公式如下：

1.2.3.3 總還原能力的測定 參照參考文獻[10]稍作改動，取用無水乙醇稀釋得到的不同濃度（0.5、1、2、4、6、8 mg/mL）大果木姜子不同部位揮發油樣品2 mL 于具塞試管中，加入0.2 mol/L pH 為6.6 磷酸鹽緩沖溶液、1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，50 ℃水浴20 min，冷卻，加10%三氯乙酸2.5 mL，離心（3000 r/min，10 min）后取上清液5 mL，加5 mL 蒸餾水和0.1%三氯化鐵1 mL，混勻，靜置10 min 于700 nm 處測吸光值A，以VC作為陽性對照（質量濃度分別為2、4、6、8、10 μg·mL-1），以上實驗均重復3 次。

1.3 數據處理

根據GC-MS 所獲得的質譜信息，在NIST 17和WILEY 275 數據庫進行查詢，然后與計算機數據系統進行綜合檢索和匹配，并采用峰面積歸一化法測定其相對百分含量。采用Prism 8.0 進行數據統計分析，Origin 21.0 進行相關性分析（Pearson 相關性分析），TBtools 進行聚類分析。P值取0.05，0.01 兩個不同水平，所有數據均表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 大果木姜子不同部位揮發油成分分析及比較

2.1.1 不同部位揮發油成分組成 經GC-MS 分析，大果木姜子熟果、青果、柄、葉揮發油的總離子流圖見圖1，成分及其相對含量詳見表2。從圖1 可看出不同部位揮發油成分具有顯著的差異。由表2 可知，從大果木姜子不同部位揮發油中共鑒定出119 種成分，包括酮類16 種、烴類50 種、醇類34 種、醛類8 種、酚類3 種、酸類3 種、其他5 種。大果木姜子青果、熟果、果柄、葉中分別鑒定出60、66、67 和50 種成分，相對含量分別占其總揮發油的86.2%、89.365%、55.047%、64.389%。

圖1 大果木姜子青果、熟果、果柄及葉揮發油的GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current of the volatile oil from immature fruit, mature fruit, stalk and leaf of C. migao

表2 大果木姜子青果、熟果及其果柄、葉揮發油化學成分及其相對含量Table 2 Chemical constituents and relative contents of the volatile oil of immature and mature fruit, stalk and leaf of C. migao

2.1.2 不同部位揮發油成分類別 各類成分所占百分比及數量詳見表3。可見除未知成分外，熟果、青果、果柄、葉揮發油中所含的主要化合物有烴類（29.431%、70.75%、13.694%、15.303%）和醇類（10.066%、14.683%、27.791%、9.57%），熟果和青果揮發油中烴類成分以1,8-桉葉素為主，而果柄和葉中則以δ-杜松萜烯為主。其中，果柄中醇類成分含量最高，青果揮發油中烴類成分含量最高，熟果中酸類成分含量最高（41.842%），而青果中未鑒定出酸類成分，可能是在逐漸成熟的過程中青果中的某些烴類成分逐漸轉化為酸類。不同部位大果木姜子揮發油所含烴類、醇類、酮類及醛類的總體數目差異不大，但各成分類別和含量占比差異較大。

表3 大果木姜子熟果、青果、果柄、葉揮發油成分占比及數量Table 3 Volatile oil components and quantities of mature fruit, immature fruit, stalk, leaf of C. migao

2.1.3 不同部位揮發油共有成分 共有成分及其相對含量詳見圖2。大果木姜子熟果、青果、果柄、葉揮發油共有17 個共有成分，但相對含量占比相差較大。1,8-桉葉素在熟果揮發油（13.461%）中的含量要高于青果（11.845%）和果柄（1.27%）、葉（0.231%），而青果揮發油中α-松油醇（5.178%）的含量明顯高于熟果和果柄、葉，可能是由于在逐漸成熟的過程青果中的α-松油醇異構化為1,8-桉葉素，研究表明1,8-桉葉素[11]具有抑菌、抗炎抗氧化[12]、驅蚊[13]等作用，同時還可以抑制血小板聚集，防止血栓形成[14]，抑制A549 細胞的增殖[15]；欖香醇具有很好的抑菌作用[16]，其含量青果（4.967%）＞果柄（1.754%）＞葉（1.362%）＞熟果（0.608%）；愈創醇在葉、果柄中的含量均大于1%，高于青果和熟果，可以抑制M2 巨噬細胞而達到抗肺癌的作用[17]；欖香醇與愈創醇為同分異構成分，各來源揮發油中還含有多種二者的同分異構成分，隨著環境溫度的改變，各成分之間可能會出現相互轉化，這可能是其含量存在差異的主要原因。對傘花烴在熟果中的含量最高為2.874%，在青果及果柄、葉中均低于1%，它具有抑菌[18]、抗糖尿病[19]、舒張主動脈[20]、通過調節氧化應激反應緩解動脈粥樣硬化[21]等作用；4-萜品醇在青果、熟果、果柄、葉中的含量均小于1%，但其具有很好的抑菌[22]、抗炎作用[23]；α-葎草烯具有止癢活性，并能夠改善精神分裂癥[24-25]。莰烯可用作為有機合成原料，在合成香料、農業及藥物等領域應用廣泛。綜上，大多數共有成分具有一定的藥理活性，但又不盡相同。

圖2 不同部位揮發油共有成分堆積圖Fig.2 Stacked plot of common chemical constituents of the volatile oil from different parts

青果和熟果揮發油成分共有成分為44 個，其中對傘花烴、（-）匙葉桉油烯醇、正癸酸、月桂酸的百分含量隨著果實的發育呈現上升趨勢；α-蒎烯、香檜烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、α-松油醇、β-水芹烯呈現下降趨勢。由此可發現：隨著果實的發育，烯烴類成分的百分含量逐漸降低，酸類化學成分的百分含量逐漸升高，表明酸類化合物的種類和含量隨著果實的成熟而發生明顯變化。果柄與熟果揮發油共有29 個共有成分，其中僅α-松油醇的含量均高于1%。在葉揮發油中，與熟果揮發油共有26 個共有成分，其中葉揮發油中正癸酸含量為6.7%，匙葉桉油烯醇含量為1.47%，熟果揮發油中正癸酸含量為28.563%，匙葉桉油烯醇含量為0.122%，只有熟果和葉揮發油中均含有以上兩種化學成分。有文獻報道正癸酸和匙葉桉油烯醇可能是大果木姜子抗房顫的潛在活性成分[26]，因此，后續可繼續對葉中化學成分及相關抗氧化活性進行進一步的研究，以期可以擴大大果木姜子抗氧化部位。

2.1.4 不同部位揮發油特有成分 從不同部位揮發油成分的組成差異分析，熟果中含有13 個特有成分，占其揮發油成分總量的18.525%，包括酮類5 種（2.772%），烴類2 種（0.088%），醛類2 種（1.356%），醇類（0.199%）及酸類（13.279%）各1 種，其他2 種（0.831%），主要特有成分為2-壬酮（1.813%）和月桂酸（13.279%）。青果中含有10 個特有成分，占其揮發油成分總量的15.989%，包括烴類7 種（14.711%）和醇類3 種（1.278%），主要特有成分為β-水芹烯（10.831%）和雙環大牻牛兒烯（1.48%）。果柄中含有16 個特有成分，占其揮發油成分總量的20.716%，包括烴類5 種（1.735%），醇類9 種（17.08%）和醛類2 種（1.901%），主要特有成分為β-桉葉醇（13.683%）、羅西葉醇（1.481%）、沉香螺醇（1.269%）、依蘭醛（1.792%）及α-二去氫蓽澄茄烯（1.177%）。葉中含有5 個特有成分，僅占其揮發油成分總量的0.675%，且含量均小于1%。

2.2 抗氧化能力測定結果

2.2.1 DPPH·清除能力的測定結果 由圖3 可見：在揮發油的質量濃度為0.5～8.0 mg/mL 的范圍內，隨著質量濃度的升高，清除率也在升高，呈現出一定的量-效關系。其中，在質量濃度為8.0 mg/mL 時，熟果揮發油對DPPH.的清除率最高，為90.05%，與6 μg/mL維生素C 的清除率（92.81%）相接近；青果次之，為79.79%；果柄和葉的清除率分別為75.02%和72.73%，IC50值依次為2.391、1.727、3.182、3.092 mg/mL。熟果、青果、果柄、葉揮發油對DPPH·均有較好的清除作用，可能是因為四個部位的揮發油中均含有大量的醛、酮等還原性物質，且DPPH·是脂溶性的，恰好適用于揮發性成分抗氧化能力的測定。有文獻報道1,8-桉葉素具有抗炎抗氧化的作用，且中鏈脂肪酸正癸酸能夠降低氧化應激水平[27]，熟果揮發油中酸類成分含量高達41.842%，這也可能是其抗氧化能力較高的原因之一。質量濃度分別為2、4、6、8、10 μg·mL-1的VC對DPPH.的清除率依次為32.63%、60.18%、92.81%、94.91%、98.72%。

圖3 不同濃度揮發油對DPPH·的清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH· of volatile oils at different concentrations

2.2.2 ABTS+·清除能力的測定結果 如圖4 所示，不同濃度揮發油對ABTS+·的清除率隨著質量濃度的上升而增強，在質量濃度為8.0 mg/mL 時，熟果揮發油對ABTS+·清除率最高，為84.46%，果柄揮發油的清除率最差，為56.34%；結果表明熟果、青果、果柄、葉揮發油對ABTS+·均有一定的清除作用，IC50值依次為0.9423、2.616、5.344、3.651 mg/mL。由清除率可發現不同部位的揮發油對ABTS+·的清除率明顯低于DPPH·。質量濃度分別為2、4、6、8、10 μg·mL-1的VC對ABTS+·的清除率依次為68.35%、84.44%、87.83%、95.44%、98.54%。

圖4 不同濃度揮發油對ABTS+·的清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS+· of volatile oils at different concentrations

2.2.3 總還原能力測定結果 一般來說物質的還原能力與抗氧化能力呈正相關，即還原力越強，抗氧化活性越高。因此可通過測定吸光度值來評價不同部位揮發油的總還原能力，詳見圖5。不同濃度揮發油的總還原能力隨著質量濃度的上升而增強，在質量濃度為8.0 mg/mL 時，熟果揮發油的總還原能力最強，為1.385，果柄揮發油最差；結果表明熟果、青果、果柄、葉揮發油均具有一定的還原力，但明顯小于VC對照組。質量濃度分別為2、4、6、8、10 μg·mL-1的VC的總還原能力依次為0.93、1.4、1.52、1.75、1.97。

圖5 不同濃度揮發油的總還原能力Fig.5 Total reducing capacity of volatile oils at different concentrations

2.3 相關性及聚類分析結果

為了直觀地展示不同部位揮發油對3 個抗氧化體系的清除效果差異，將測得清除率和還原力結果經歸一化后為評價指標，利用Origin 21.0 統計分析軟件進行相關性分析。圖6 為相關性分析結果，圖中顏色由淺灰到深灰，表明不同部位揮發油中各類成分與DPPH·、ABTS+·及總還原能力抗氧化體系的相關性越大。對比各類成分與抗氧化能力的相關性：可得烴類及酸類成分與清除DPPH·、ABTS+·能力及總還原能力呈正相關，其中酸類成分的相關性最高，分別為0.90、0.88，且具有顯著性（P≤0.05）。正相關表明這兩類成分在抗氧化作用中可能起到重要作用，后續實驗考慮對這兩類成分進行單獨的抗氧化能力研究。對比各類成分之間的相關性：可以發現醛類與酚類（P≤0.05）、酮類與醛類（P≤0.01）、其它成分與醛類及酮類（P≤0.01）呈正相關并具有顯著性，結合表3中各類成分含量，發現其可能存在相互促進作用。

圖6 相關性分析結果Fig.6 Result of correlation analysis

圖7為聚類熱圖分析圖，同組樣本相關性較高，不同組樣本相關性較小，聚類圖可以更加直觀地分析各樣本間的相關性。對全部成分及不同部位揮發油進行聚類，不同部位聚類結果顯示：熟果、青果、果柄、葉四個部位揮發油可聚為兩類，其中青果和熟果揮發油為第Ⅰ類，這一類中1,8-桉葉素、α-蒎烯、β-蒎烯、β-羅勒烯的含量明顯較高；果柄和葉可以聚為第Ⅱ類，這一類中1-（（1R,2R,3R）-2-（3-Isopropylfuran-2-yl）-3-methylcyclopentyl）ethanone、α-松油醇、4-異丙基-6-甲基-1-四酮、石榴酚、α-白菖考烯、δ-杜松萜烯、卡達烯的含量明顯較高。青果和熟果中含量明顯較高的成分均為烴類，結合相關性分析中烴類成分與抗氧化能力呈現正相關的結果，說明這是青果和熟果抗氧化能力較強的原因之一。聚類結果表明青果在成分上與熟果差距不大，因此青果在一定程度上可以直接使用，而果柄和葉中揮發油的化學成分則與熟果和青果相差較大。

圖7 聚類分析結果Fig.7 Result of clustering analysis

3 結論

揮發油類成分是大果木姜子的主要活性成分，本研究通過研究大果木姜子熟果、青果、果柄、葉揮發油的組成和相對含量，對比分析表明不同部位揮發油的成分組成及含量存在一定的差異。可能是由于在曬干過程中一些揮發性和易氧化或易分解的成分有損失，也可能是不同部位中成分種類及組成本身就存在差異，從而導致其抗氧化的藥效物質基礎發生改變。從不同部位揮發油中共檢測出119 種化學成分，共有成分17 種。熟果揮發油含有66 種成分，以酸類成分為主；青果揮發油含有60 種成分，以烴類成分為主；果柄揮發油含有67 種成分，以醇類成分為主；葉揮發油含有50 種成分，以烴類成分為主，可見不同部位揮發油主要組成成分差別較大。抗氧化結果表明不同部位揮發油對DPPH·及ABTS+·均具有較好的清除作用，通過對各類成分進行抗氧化相關性分析發現共有酸類及烴類成分與抗氧化能力呈現正性相關，但相關性分析只能作為預測，因此后續實驗將繼續對它們的抗氧化能力進行考察，有望發現潛在的抗氧化化合物。聚類分析將青果、熟果、果柄、葉分為兩類，青果和熟果為第Ⅰ類，因此青果在一定程度上也可以使用，避免了大果木姜子藥材資源的浪費。果柄和葉可以聚為第Ⅱ類，其中也含有大量的揮發性成分，但與果實類相差較大，不過二者都具有較好的抗氧化活性，可以進一步的探討其抗氧化性能，為獲得天然綠色的抗氧化產品提供依據。