快速濾過型凈化結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞蛋中38 種殺菌劑類農(nóng)藥殘留

萬 娜，潘永波，梁曉涵，王 丹，陳秋宇，鄒冬梅

（1.海南省食品檢驗檢測中心 國家市場監(jiān)管重點實驗室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），海南海口 570314；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海南海口 571101）

雞蛋的生產(chǎn)和消費體量在我國都比較大，是餐桌上的常見食物。近年來，為了防治蛋雞疾病，提高雞蛋產(chǎn)量，一些養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中使用藥物，使食用雞蛋存在安全隱患。2017 年8 月歐洲爆出雞蛋中氟蟲腈污染的食品安全事件[1]，引發(fā)大家開始關(guān)注雞蛋的藥物殘留問題，如抗生素[2]、抗病毒藥[3]、殺蟲劑[4]等。養(yǎng)殖者們會使用一些殺蟲劑、殺菌劑，對養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行消毒、殺蟲、防蠅，蛋雞通過食用受到農(nóng)藥污染的養(yǎng)殖水或飼料等，農(nóng)藥有可能在體內(nèi)富集，產(chǎn)出受到農(nóng)藥污染的畜禽產(chǎn)品或直接造成畜禽產(chǎn)品的農(nóng)藥污染[5-6]。長期食用農(nóng)藥殘留超標(biāo)的畜禽產(chǎn)品，可引起慢性中毒，甚至致畸、致癌和致突變[7-8]。目前《GB 2763-2021 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了雞蛋中殺菌劑類農(nóng)藥殘留限量有32 項[9]，而針對雞蛋中多殺菌劑類農(nóng)藥殘留的檢驗方法還沒有。因此，建立雞蛋中多農(nóng)藥殘留簡單、準(zhǔn)確、快速的檢測方法具有十分重要的意義。

目前，雞蛋中殘留污染物的測定方法主要有氣相色譜法[10]、液相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]等，而在這些方法中大多采用是常規(guī)QuEChERS 方法進(jìn)行凈化，但是，日常監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)使用常規(guī)QuEChERS 方法凈化高脂、高蛋白基質(zhì)會導(dǎo)致部分脂質(zhì)農(nóng)藥提取效率低、凈化過程損失較大，所以本研究考察選取一種快速濾過凈化柱（multi-plug filtration cleanup，m-PFC）進(jìn)行凈化。

快速濾過凈化柱（multi-plug filtration cleanup，m-PFC） 中用多壁碳納米管（ multiwall carbon nanotubes，MWCNTs）代替?zhèn)鹘y(tǒng)QuEChERs 方法中的石墨化碳黑（GCB），并與其他凈化填料一起填充制備成固相凈化小柱，無需淋洗、活化，直接按壓式過濾，節(jié)省了振蕩、離心等操作步驟，縮短了前處理時間，具有傳統(tǒng)QuEChERs 方法簡便的優(yōu)點，也增強(qiáng)了凈化能力，提高了靈敏度。目前已應(yīng)用于果蔬[15-19]、枸杞[20]、茶葉[21]、人參[22]等食用農(nóng)產(chǎn)品樣品中的農(nóng)藥殘留及魚肉[23]、血液[24]、干制水產(chǎn)品[25]等動物源性樣品中藥殘分析，但m-PFC 快速濾過凈化柱應(yīng)用于雞蛋基質(zhì)中農(nóng)藥殘留研究較少。

本研究選取國家食品監(jiān)督抽檢監(jiān)測中常見的38 種殺菌劑類藥物，以雞蛋為基質(zhì)，優(yōu)化提取和凈化方法、質(zhì)譜儀器參數(shù)和流動相體系，研究建立一種快速濾過型凈化結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞蛋中38 種殺菌劑類農(nóng)藥殘留的檢測方法，以期滿足日常監(jiān)測需要，適用于雞蛋中殺菌劑類農(nóng)藥殘留的定性定量分析，為雞蛋風(fēng)險監(jiān)測提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋本地超市和農(nóng)貿(mào)市場采購（每批采購數(shù)量：1 kg）；38 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95.0%） 購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈（色譜純） 德國MERCK 公司；甲酸、乙酸（LC-MS 級） 美國ACS恩科化學(xué)；乙酸銨（色譜純） Thermo Fisher 公司；氯化鈉（分析純） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；QuEChERS 鹽包1（含6 g MgSO4和1.5 g C2H9NaO5）

美國Agilent 公司；QuEChERS 鹽包2（含 4 g MgSO4和1 g NaCl） 美國Agilent 公司；m-FPC 凈化柱 北京科德諾思技術(shù)有限公司。

WATERS ACQUITY UPLC 液相色譜儀、 Xevo TQ-S 質(zhì)譜儀和MassLynx 工作軟件 沃特世科技（上海）有限公司；Acquity BEH C18色譜柱 美國Waters 公司；XS204 萬分之一天平 瑞士Mettler Toledo 公司；XW-80A 旋渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司；IKA?KS 4000 ic 恒溫?fù)u床 德國IKA 公司；Centrifuge 5804R 冷凍離心機(jī) 德國eppendorf公司；IKA?T25 組織勻漿機(jī) 德國IKA 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 取20 枚新鮮雞蛋（約1000 g），去殼，在組織勻漿機(jī)中充分?jǐn)囁榫鶆颍湃刖垡蚁┢恐校瑢⒃嚇影凑諟y試和備用分別存放，于-20～-16 ℃條件下保存。

1.2.2 樣品前處理 前處理方法參考GB 23200.115-2018[26]雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定和丁路陽等[27]所建立的雞蛋中多農(nóng)藥殘留檢測方法。稱取5.0 g（精確至0.01 g）均質(zhì)樣品于50 mL 離心管中，加入5 mL 水，渦旋混勻1 min，加入15 mL 1%乙酸-乙腈，渦旋混勻1 min，室溫振蕩提取20 min，0 ℃冷凍20 min，再加入鹽包2，渦旋1 min，以8000 r/min 離心5 min。在凈化柱前端裝上0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，吸取2 mL 上清液于m-FPC 凈化柱（油脂類）中，收集濾液，混勻，裝瓶，待測。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.1 mg）各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，選擇乙腈溶解并定容到10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20～-16 ℃ 條件下保存，備用。

分別吸取100 μL 各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋定容到100 mL 容量瓶中，配制成1.0 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20～-16 ℃ 條件下保存，備用。

分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10、25、50、100、500、1000、2500、5000 μL 于10 mL 容量瓶中，吸取兩組，一組用乙腈定容配制成不同質(zhì)量濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，一組用空白樣品提取液定容配制成不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 液相色譜條件 采用 Acquity BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）分離；流動相：0.1%甲酸水溶液（A），乙腈（B）；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，95% A；0.5～3.5 min，5.0% A；3.5～4.5 min，5.0% A；4.5～4.6 min，95% A；4.6～6.0 min，95% A。

1.2.5 質(zhì)譜條件 離子源類型：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；碰撞氣：氬氣（Ar）；毛細(xì)管電壓：1.00 kV；離子源溫度：120 ℃；錐孔氣流量：150 L/h；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h。其它質(zhì)譜條件詳見表1。

表1 38 種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 38 pesticides

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用沃特世 MassLynx 工作軟件建立方法、數(shù)據(jù)采集以及數(shù)據(jù)定量處理，導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)后采用WPS Office 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析和表格繪制，用Origin 軟件進(jìn)行柱狀圖繪制。前處理和分析條件優(yōu)化中的回收率的計算均采用3 個平行樣品取平均值計算，精密度選擇低、中、高3 個濃度，每個濃度梯度取連續(xù)采集6 次數(shù)據(jù)的峰面積進(jìn)行相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇 在一些文獻(xiàn)和常用的農(nóng)藥檢測國家標(biāo)準(zhǔn)方法中，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測分析時，電噴霧離子源正離子模式下在流動相中加入一定量的甲酸、乙酸銨等，可以增加目標(biāo)離子的離子化狀態(tài)，提高目標(biāo)物離子化效率，改善峰形，提高分離度[28-30]。本文在相同梯度洗脫條件下，考察了水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈、5 mmol/L乙酸銨-乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨-乙腈共4 種流動相體系對38 種農(nóng)藥的峰型、分離度和靈敏度影響。結(jié)果表明，甲酸的引入，待測組分的峰型更好，但加入乙酸銨后，福美雙電離受到抑制，響應(yīng)降低。所以最終選擇0.1%甲酸水-乙腈溶液作為流動相。

2.1.2 提取劑的選擇 雞蛋樣品中富含蛋白質(zhì)和脂肪。乙腈通用性強(qiáng)，對絕大多數(shù)農(nóng)藥溶解度較高，具有沉淀蛋白的作用，能減少蛋白質(zhì)和脂肪對凈化過程造成的影響[31]，是理想的食品中農(nóng)藥多殘留提取溶劑。但有的農(nóng)藥受提取劑pH 影響較大，因此本研究以空白雞蛋為研究對象，添加水平為15 μg/kg，考察了乙腈、1%乙酸-乙腈、1%甲酸-乙腈3 種提取溶劑對38 種農(nóng)藥的提取影響。由圖1 可知，當(dāng)乙腈提取時，發(fā)現(xiàn)分層差，提取液渾濁，油脂析出明顯，嘧霉胺、噻菌靈和烯酰嗎啉的回收率低于70.0%，可能部分脂溶性較強(qiáng)的農(nóng)藥未被有效提取；當(dāng)在乙腈中加入1%的酸時，提取液顏色較淺，但選擇1%甲酸-乙腈提取時，霜霉威回收低于60.0%，而1%乙酸-乙腈提取時，所有物質(zhì)回收率在73.1%～103.2%之間，滿足農(nóng)藥殘留檢測實驗要求，因此選擇1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

圖1 3 種提取劑對回收率的影響Fig.1 Influence of 3 extractants on recovery

2.1.3 提取溶劑體積的確定 以空白雞蛋為研究對象，添加水平為15 μg/kg 時，分別考察了提取劑體積為10、15 和20 mL 時對農(nóng)藥殘留的提取效果。結(jié)果表明，提取劑為10 mL 時，多菌靈、嘧霉胺和噻菌靈回收率為80.0%左右；而提取劑為20 mL 時，嘧霉胺和噻菌靈的回收率下降至50.0%；采用15 mL 提取劑時各物質(zhì)回收率均在70.0%～120%之間，能達(dá)到充分提取目標(biāo)分析物的目的，所以最終采用15 mL提取劑。

由于蛋液黏性較大，僅使用1%乙酸-乙腈提取存在分散不完全的現(xiàn)象，向其中加入少量水，可提高對樣品的滲透性，使基質(zhì)分散的更均勻，既可提高對目標(biāo)物的提取效率，又可減少蛋液中脂質(zhì)物質(zhì)的溶入量，更有利于后續(xù)凈化[32]，所以本研究考察了1%乙酸-乙腈、1%乙酸-乙腈+5 mL 水、1%乙酸-乙腈+10 mL 水，在添加水平為15 μg/kg 時，三種條件下的回收率見圖2，由圖2 可見加5 mL 水時各物質(zhì)回收率更好，所以最終采用加5 mL 水。

2.1.4 除水材料的選擇 為了使有機(jī)相與水相更好的分層，凈化時更好的吸取有機(jī)相，通常會在樣液中加入無機(jī)鹽，本研究考察了NaCl、QuEChERS 鹽包1、QuEChERS 鹽包2 這三種除水材料。以空白雞蛋為研究對象，添加水平為15 μg/kg，由圖3 可知，單獨加入NaCl，氟啶胺和噻呋酰胺回收率低于60.0%，而且實驗過程中發(fā)現(xiàn)蛋液粘稠度增大，出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，水相與有機(jī)相界限模糊。另外兩種QuEChERS提取鹽包的除水效果均較佳，由于QuEChERS 鹽包1 中帶有緩沖鹽體系，對于弱酸性農(nóng)藥，如吡唑醚菌酯等不利于提取，加入QuEChERS 鹽包1 時吡唑醚菌酯回收率低于70.0%，加入QuEChERS 鹽包2 時各物質(zhì)響應(yīng)更好，回收率均在70.4%～118.0%，所以最終采用QuEChERS 鹽包2。

圖3 3 種除水劑對回收率的影響Fig.3 Influence of 3 water removing agents on recovery

2.1.5 凈化方法的選擇 提取液中含有少量蛋白質(zhì)、脂肪和卵磷脂，它們會對儀器性能和分析結(jié)果造成不利影響,因此選擇合適的凈化方法去除[27]。以空白雞蛋為研究對象，向空白雞蛋液中添加15 μg/kg的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)液，比較QuEChERS 方法和m-PFC柱對樣品凈化的效果。圖4 結(jié)果表明，QuEChERS方法凈化時樣品澄清，但是霜霉威、多菌靈、嘧霉胺、噻菌靈、吡唑醚菌酯的回收率低于70.0%；m-PFC 柱凈化后樣品澄清，對雜質(zhì)的去除率較好，38 種農(nóng)藥回收率均在85.3%～106.3%之間，而且m-PFC柱省去了QuEChERS 方法凈化時渦旋混勻、離心等步驟，縮短了前處理時間。因此，本研究中采用 m-PFC 柱進(jìn)行除雜凈化。

圖4 2 種凈化方法對回收率的影響Fig.4 Influence of 2 purification methods on recovery

2.2 方法評價

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量限 以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以農(nóng)藥定量用離子的質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，由表2 可知，38 種農(nóng)藥在0.001～0.50 μg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，決定系數(shù)均大于0.9912。使用空白基質(zhì)對基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行不斷逐級稀釋，以信噪比（S/N=3）作為方法的檢出限，信噪比（S/N=10）作為定量限，計算得到38 種農(nóng)藥的方法檢出限為0.01～0.2 μg/kg，定量限為0.02～0.7 μg/kg（見表2）。結(jié)果表明，該方法的各化合物的定量限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 2763-2021 中雞蛋的定量限10 μg/kg[9]，能滿足日常檢測的定性、定量要求。

表2 38 種農(nóng)藥線性關(guān)系、檢出限、定量限Table 2 Linear relationships, detection limits and quantitation limits of 38 pesticides

2.2.2 準(zhǔn)確度與精密度 以空白雞蛋為研究對象，向空白雞蛋樣品中添加10、50、200 μg/kg 三種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按1.2.2 節(jié)前處理后上機(jī)檢測，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度分析。由表3 可知，3 個不同濃度水平測得的加標(biāo)回收率在72.7%～113.5%，RSD在0.40%～10%，表明本方法符合農(nóng)藥殘留檢測方法要求，可以滿足禽蛋中農(nóng)藥檢測。

表3 38 種農(nóng)藥精密度及添加回收率（n=6）Table 3 Precision and additive recovery of 38 pesticides (n=6)

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng) 雞蛋中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)效應(yīng)往往會對分析準(zhǔn)確性產(chǎn)生重要影響，因此有必要對此研究過程中雞蛋樣品的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行分析[33]。分別配制質(zhì)量濃度為0.001～0.50 μg/mL 的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制了溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計算基質(zhì)效應(yīng)。計算公式如下：

根據(jù)以上基質(zhì)效應(yīng)的計算公式，|ME|在不大于20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，|ME|在20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，|ME|超過50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[34]。各組分農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果如圖5 所示，可以直觀地看到采用UPLC-MS/MS 法對雞蛋中38 種農(nóng)藥進(jìn)行檢測時，大部分農(nóng)藥都有不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，其中26 種農(nóng)藥為弱基質(zhì)效應(yīng)，9 種農(nóng)藥為中等基質(zhì)效應(yīng)，3 種農(nóng)藥為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，因此在結(jié)果分析中有必要通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。

圖5 38 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig.5 Matrix effects for 38 pesticides

2.2.4 實際樣品測定 為了對本方法進(jìn)行驗證，從海口市各農(nóng)貿(mào)市場和超市隨機(jī)購買了20 份雞蛋樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明均未檢出相關(guān)殺菌劑，說明本地區(qū)市售雞蛋殺菌劑類農(nóng)藥目前處于比較安全狀態(tài)，但仍需加強(qiáng)日常監(jiān)測。

3 結(jié)論

依據(jù)《GB 2763-2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對鮮蛋中殺菌劑農(nóng)藥殘留限量的規(guī)定，其中噻菌靈、苯醚甲環(huán)唑等農(nóng)藥在動物源性食品的殘留物不相同于植物性食品，目前限于其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以獲得，本文只研究建立了農(nóng)藥母體的檢測方法。

本實驗將QuEChERS 前處理技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，建立了雞蛋中38 種殺菌劑類農(nóng)藥的檢測方法，相較于常規(guī)的QuEChERS 方法凈化，該方法減少了凈化管凈化的渦旋混勻、離心等操作步驟，縮短了前處理時間，操作簡單快捷，大大提高了檢測工作效率。在低、中、高三水平添加回收下，回收率在72.7%～113.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.40%～10%之間，表明該方法在不同濃度水平具有較高的精密度與準(zhǔn)確度。將該方法應(yīng)用于實際雞蛋樣品的檢測，達(dá)到了良好的檢測結(jié)果，可滿足雞蛋中多種農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測。