固相支撐液液萃取結合LC-MS/MS 快速測定生乳中32 種農藥殘留

鄧 龍，周 思 ，黃佳佳，曾上敏，張靜文

（1.廣東食品藥品職業學院，廣東廣州 510520；2.廣州市疾病預防控制中心，廣東廣州 510440）

乳及乳制品營養豐富，是人們生活中的重要食品之一。生乳作為配方乳粉、液體乳及其他乳制品的主要原料，其質量安全問題向來是消費者和行業關注的焦點。研究表明，包括生乳在內的動物源性食品不僅受到獸藥殘留、金屬元素等危害因素的影響，還面臨著農藥殘留的污染等問題[1]。我國作為農業大國，農藥用量大、利用率低等問題普遍。環境中的農藥殘留通過食物、飲水、殺蟲、環境接觸等途徑進入動物體內，易在脂肪含量較高的乳類等產品中蓄積，通過食物鏈持續影響人類健康[2-3]。對此，食品法典委員會、歐盟等制定了嚴格的限量標準以降低其對健康造成的風險[4-5]。我國GB 2763-2021 規定了生乳中125 種農藥殘留的最大限量，涉及檢驗方法25 項[6]。存在操作復雜、項目不全、檢出限高于限量值等問題，限量標準配套方法尚不完善[7-8]。文獻報道動物源性食品中農殘檢測多為肉及其制品、水產品、雞蛋等[9-11]，有關生乳的檢測項目少、種類單一[10,12]，難以滿足生乳中農藥多殘留快速篩查的要求[12]。因此，建立生乳中農藥多殘留快速檢測方法對保障乳制品食品安全具有現實意義。

生乳中農藥多殘留檢測面臨兩大挑戰：a. 目標物種類多，性質差異大，用同一種方法難以獲得好的回收率；b. 含量水平低，基質效應強，前處理復雜，生乳不易保存、時效性要求高[13]。傳統的液液萃取、固相萃取處理步驟多、操作繁瑣[14-15]，QuEChERS 影響因素多、方法摸索耗時長[16-17]、凝膠色譜需專用設備[18]等，簡單、高效的樣品前處理方法有待進一步研究[19]。固相支撐液液萃取（supported liquid extraction，SLE）是1997 年Johnson 團隊提出的一種新型的樣品前處理技術[20]。以均勻多孔材料為支撐介質，吸附水性樣品形成理想的液膜萃取界面，加入與水不相溶的洗脫溶劑后，溶劑與樣本之間形成連續的濃度差，從而實現目標物的高效萃取，萃取流程見圖1。SLE 在生物樣本中藥物、環境污染物、煙草及其代謝物的檢測中應用廣泛[21-25]。SLE 本質是液液萃取，但克服了傳統液液萃取效率低、易乳化等缺點，且操作十分簡單，只需上樣和洗脫兩個步驟。在水系樣本有機物萃取方面優勢明顯，可用于生乳中農藥多殘留樣品的前處理，在農藥殘留方面的應用暫無相關報道。

圖1 SLE 實驗流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental procedures of SLE

本研究以農業農村部《禁限用農藥名錄》中32 種高風險禁限用農藥殘留為目標物，采用固相支撐液液萃取進行樣品前處理，結合液相色譜串聯質譜在多殘留分析中靈敏度高、速度快、抗干擾能力強的優勢[10-12]，建立生乳中32 種農藥殘留的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，為動物源性樣品中農藥多殘留的檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

32 種農藥殘留標準品 100 mg/L，農業部環境保護科研監測所；乙腈、甲酸銨、甲酸 LC-MS 級，德國Merck 公司；二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯 HPLC級，德國Merck 公司；去離子水 18.0 MΩ·cm，由Milli-Q 去離子水發生器制備；生乳樣品 采自本地乳品生產企業及鮮乳配送點，4 ℃冷藏保存。

ACQUITY Xevo TQ-S 超高效液相色譜-串聯質譜儀、Wat200609 固相萃取裝置 美國Waters 公司；IKA MS3 漩渦混合器 德國IKA 公司；5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；N-EVAP112氮吹濃縮儀 美國Organomation 公司；Milli-Q 去離子水發生器 美國Millipore 公司；SLE 萃取柱 3 mL美國Agilent 公司；Mini-UniPrep 聚四氟乙烯非針式過濾器 0.2 μm 英國Whatman 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 準確吸取0.1 mL 單標溶液于10 mL 容量瓶，乙腈定容至刻度，配制成1 mg/L混合標準溶液，用生乳空白基質溶液稀釋為0.2、1、2、5、10、20、50 μg/L 系列標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取1 g（精確至0.01 g）混勻的生乳樣品，注入裝有1.5 mL 乙腈的離心管，渦旋混勻，4000 r/min 離心5 min，取上清液。樣品沉淀加入0.5 mL 水沖洗，合并清液，轉移至SLE 小柱，等待5 min。用4.5 mL 二氯甲烷洗脫2 次，待無液滴落下后抽真空5 s，洗脫液氮吹至近干，用20%乙腈甲酸（0.1%）水溶液定容至0.5 mL，非針式過濾器過濾。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：A 為0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L 甲酸銨），B 為0.1%甲酸乙腈（含5 mmol/L 甲酸銨），梯度洗脫程序：0～2 min，20% B；2～13 min，B 升至100%；13～15 min，保持100% B；15～16 min，B 降至20%；16～18 min，保持20% B；進樣體積：5 μL；流速：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃。

1.2.4 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），氟蟲腈為負離子模式，其余31 種為正離子模式；監測方式：多反應監測（MRM）模式；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；各化合物參考保留時間、監測離子、錐孔電壓、碰撞電壓等參數見表1。

表1 32 種目標物的保留時間和質譜參數Table 1 Retention times and mass parameters of target compounds

1.3 數據處理

采用基質匹配校準曲線外標法定量，通過標準加入法和控制變量法優化實驗條件。應用儀器配套Masslynx 工作站進行數據采集與標準曲線繪制，導出數據使用Origin 2017 進行數據分析與作圖。前處理和分析條件優化中實驗重復測試3 次取均值，回收率與精密度實驗重復測試6 次計算相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 預處理條件優化

生乳含有大量的蛋白、脂肪和磷脂等物質，易殘留在液質系統中，改變分析物峰型，增加色譜柱壓力，影響離子化效率，上機測試前應盡量去除[26]，固相支撐液液萃取以改性多孔材料為支撐，表面活性低、比表面積大，可形成微孔液膜實現目標物的高效萃取。同時，保留樣本中的磷脂、蛋白等干擾物，有效減少基質干擾[27]。SLE 只有上樣和洗脫兩個步驟，上柱樣本狀態及洗脫液的選取是影響實驗的關鍵因素[25]。上樣前對樣本進行稀釋、調酸堿度、沉淀蛋白等預處理可以獲得更好的萃取與凈化效果[23]。生乳含有大量蛋白直接上柱易造成柱子堵塞影響柱效，采用有機試劑沉淀蛋白后上柱，可大幅降低樣品中的蛋白含量，且水溶性有機溶劑的加入可改善部分極性化合物萃取率[28]。實驗比較了甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈三種溶劑的沉淀效果，乙腈沉淀效果優于甲醇，少量酸的加入有利于穩定酸性農藥但不利于蛋白沉淀，故選擇乙腈為沉淀劑。比較加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL 乙腈的沉淀效果，不同體積乙腈沉淀效果見圖2，當加入體積達到1.5 mL，離心后樣本呈澄清狀態，且最終回收率在60%～120%之間，符合GB/T 27404 對回收率的要求，故選擇1.5 mL 乙腈進行沉淀。此外，將生乳樣品注入乙腈中，可以讓樣本與溶劑充分接觸，沉淀效果更好。

圖2 不同乙腈用量對生乳樣品的沉淀效果Fig.2 Precipitation effect of different acetonitrile volumes on raw milk samples

2.2 萃取柱條件優化

固相支撐液液萃取的本質是目標物在兩相中的分配，32 種目標化合物中含有機磷、氨基甲酸酯、磺酰脲、苯基吡唑等多類化合物，油水分配系數差異大，洗脫溶劑的選擇需充分考慮目標物的極性和溶解度。實驗考察乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、正己烷四種常用溶劑的洗脫效果。結果表明，正己烷極性小，對苯線磷、涕滅威、久效磷等水溶性較好的農藥洗脫效果不佳。乙腈極性大，與水性樣本互溶，容易造成樣品穿漏，影響凈化效果。乙酸乙酯洗脫甲基異柳磷、蠅毒磷、氟蟲腈回收率低于20.0%，二氯甲烷對各目標化合物的回收率均較理想，平均回收率為69.4%～113.6%，故選擇二氯甲烷作為洗脫溶劑。進一步優化洗脫溶劑用量，考察溶劑體積分別為柱容量2、3、4 倍時的洗脫效果，加標濃度為10 μg/kg 時總體回收率比較見圖3。由圖可知，當體積達到9 mL時全部目標物回收率均超過60.0%，平均回收率為89.8%，繼續增加溶劑體積總體回收率增幅不明顯，基于后續操作及環保考慮不再增加溶劑用量。根據分配定律，同樣體積的溶劑多次萃取比單次萃取效率高，比較9 mL×1 和4.5 mL×2 洗脫效果，結果與理論一致，最終選擇用4.5 mL 二氯甲烷洗脫2 次。

圖3 目標化合物回收率與洗脫溶劑用量的關系Fig.3 Relationship between the recovery of target compounds and the amount of elution solvent

2.3 色譜條件優化

液相色譜串聯質譜分析農藥多殘留，流動相多選擇水、甲醇或乙腈的流動相體系。實驗對比了幾種常用流動相的分離效果，水相包括0.1%甲酸、5 mmol/L 甲酸銨、5 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸），有機相包括5 mmol/L 甲酸銨甲醇、5 mmol/L 甲酸銨乙腈、5 mmol/L 甲酸銨乙腈（含0.1%甲酸）。實驗發現，5 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）-5 mmol/L甲酸銨乙腈（含0.1%甲酸）流動相體系分離效果最佳[17]。乙腈洗作為流動相洗脫力強峰型更加尖銳對稱。目標物多為酸性農藥，加入少量甲酸有利于[M-H]+離子的生成，保持化合物穩定，減少基質中共萃物的干擾，提高方法的穩定性和重現性。加入甲酸銨有利于[M-H]-離子的生成，增強離子響應強度，同時降低保留時間長的化合物的柱保留，可有效改善色譜峰型[9]。初始流動相水相比例過高久效磷等極性較大的化合物難以保留，易與極性基質一起流出影響測定。調低初始水相比例至80%，保持2 min，有利于極性化合物的分離與測定。

2.4 基質效應評價

基質效應（matrix effect，ME）是指受樣品基質影響導致化合物響應值增強或抑制的現象[29]。痕量水平殘留檢測易受基質效應影響，目前有關動物源性樣本對農藥殘留的基質效應的研究較少。本實驗用生乳空白基質標曲與純溶劑標曲的斜率比值對基質效應大小進行評估。ME 值大于1.2 為基質增強，ME值小于0.8 為基質抑制，ME 值在0.8～1.2 認為基質效應可接受，32 種農殘ME 值分布見圖4。32 種目標化合物產生基質抑制效應的農殘占比34.4%，產生基質增強效應的農殘占比9.4%。目標物在生乳中的基質效應不可忽略，實驗中采用基質匹配標準曲線減小基質效應，提高測定結果的準確度。

圖4 目標化合物ME 值分布圖Fig.4 Matrix effect distribution of target compounds

2.5 線性范圍和檢出限

在優化條件下測試1.2.1 配制的基質匹配標準工作溶液。以目標物峰面積（y）對質量濃度（x，μg/L）進行線性擬合，得到32 種農藥殘留的線性方程（見表2）。由表可知，32 種目標物在相應濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.9962。選擇低添加水平樣品，以3 倍信噪比（S/N=3）計算檢出限，以10 倍信噪比（S/N=10）計算定量限，結合樣品前處理過程，得到檢出限為0.1～2.5 μg/kg，定量限為0.3～7.5 μg/kg。

表2 線性范圍、線性方程、相關系數、方法檢出限和定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, detection limits and quantitation limits

2.6 回收率與精密度

選取陰性生乳樣品，開展低、中、高3 水平加標回收實驗，平行測試6 次，結果見表3。32 種目標物平均回收率為69.4%～113.8%，相對標準偏差（RSD，n=6）為1.4%～8.2%，符合GB/T 27404[30]對食品理化檢測的質量控制要求，方法具有良好的回收率與精密度。

表3 加標回收和精密度的測定結果（n=6）Table 3 Determination results of recovery and precision (n=6)

2.7 實際樣品的檢測

采用本方法測定乳品企業樣品9 份，配送鮮乳樣品9 份，均未檢出32 種農藥殘留。

3 結論

本研究結合固相支撐液液萃取在水系樣本有機物萃取方面的優勢，建立了生乳中32 種農藥殘留的超高效液相色譜-串聯質譜快速檢測方法。前處理過程無需活化，沉淀蛋白后上柱洗脫即可，15 min 內完成樣品上柱與洗脫。相比于傳統的液液萃取、固相萃取，簡單快速，影響因素少，易于自動化。32 種目標物檢出限為0.1～2.5 μg/kg，定量限為0.3～7.5 μg/kg，平均回收率為69.4%～113.8%，相對標準偏差小于8.2%，符合GB/T 27404 標準要求。以生乳基質為研究對象, 充實了動物源性食品中農藥殘留的檢測方法，可為乳制品中農藥殘留的監管和風險評價提供技術支持。