西藏蜂膠及其模擬消化液的活性成分和抗氧化活性

張 碩，王 芳, ，杜 琳，潘無(wú)雙

（1.成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 611130；2.特色園藝生物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014）

蜂膠是一種傳統(tǒng)的天然藥物，是由蜜蜂科昆蟲(chóng)的工蜂采集植物樹(shù)脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有粘性的固體膠狀物[1]。蜂膠中含有約500 多種化合物，其中黃酮和多酚具有很強(qiáng)的抗氧化活性[2-3]。研究顯示，蜂膠在自由基清除、還原力等方面顯示出優(yōu)異的抗氧化能力[4-6]。河南蜂膠的乙醇提取物濃度為800 μg/mL 時(shí)，DPPH·、ABTS+·清除能力和鐵還原力分別為62.43%、89.50%和0.52[7]。廣東蜂膠在濃度為8 mg/mL 時(shí)，DPPH·和ABTS+·清除能力分別為66.91%和55.91%[8]。西藏被稱為“世界屋脊”和“地球第三極”，具有獨(dú)特的地理位置和季節(jié)特征。西藏蜂場(chǎng)平均海拔4000 米以上，高度罕見(jiàn)，并有大量特色蜜源植物，所得蜂膠產(chǎn)品可能有其獨(dú)到的抗氧化功效。目前，這方面的報(bào)道甚是有限，充分理解西藏蜂膠的抗氧化活性是開(kāi)發(fā)該資源的關(guān)鍵。

開(kāi)發(fā)西藏蜂膠資源，還需考慮其在體內(nèi)的消化情況。蜂膠攝入后在人體胃腸道中進(jìn)行消化，其活性成分的化學(xué)組成和構(gòu)像在胃腸特殊環(huán)境，如pH、熱、氧、酶等因素影響下，可能發(fā)生改變并進(jìn)一步影響抗氧化能力[9-10]。胃腸模擬消化模型可用于預(yù)測(cè)酚類物質(zhì)的生物可及性和抗氧化能力，具有簡(jiǎn)便、快速和標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)[11]。該模型已廣泛用于蜂膠[12]、紅酒[13]和水果[14]等食物多酚的模擬消化研究。然而，未見(jiàn)西藏蜂膠的胃腸模擬消化相關(guān)報(bào)道。明確消化過(guò)程中西藏蜂膠抗氧化成分和活性變化，對(duì)開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品意義重大。

本研究以西藏蜂膠為研究對(duì)象，測(cè)定其體外抗氧化活性、總酚和總黃酮含量；利用體外胃腸消化模型，明確西藏蜂膠在模擬胃腸消化過(guò)程中抗氧化成分及活性的變化。以期為開(kāi)發(fā)西藏蜂膠資源提供依據(jù)，有助于發(fā)現(xiàn)新型的強(qiáng)效抗氧化劑，促進(jìn)西藏蜂膠的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西藏蜂膠（原料蜂膠） 由成都四十一度蜂業(yè)有限公司提供，2019 年5 月至7 月期間蜂膠收集者從西藏乃東區(qū)各地（海拔3560 m，北緯28°44′～29°36′，東經(jīng)91°32′～92°02′）的蜂箱中采收，貯藏于-20 ℃冰箱冷凍；沒(méi)食子酸、蘆丁 HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 分析純，成都格利普生物科技有限公司；水楊酸 分析純，成都叮當(dāng)時(shí)代醫(yī)藥科技有限公司；硫酸亞鐵 分析純，成都市科龍化工試劑廠；硫代巴比妥酸 分析純，上?？曝S實(shí)業(yè)有限公司；氯化亞鐵、胃蛋白酶（≥3000 U/g）、胰蛋白酶（≥4000 U/g）、Ferrozine、卵磷脂 百靈威科技有限公司；磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、三氯化鐵（FeCl3）、鄰苯三酚、鹽酸、過(guò)氧化氫、三氯乙酸、無(wú)水乙醇 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV754 紫外分光光度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JA303P 分析天平 鄭州安晟科學(xué)儀器有限公司；pHSJ-4F 酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；C-3610 低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HWS12 恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；DF-101S 磁力攪拌器 上海五相儀器有限公司；RE-52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司；DW-YL270 抽屜型低溫保存箱 上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂膠提取液的制備 西藏蜂膠提取液（記為T(mén)P）：選出西藏蜂膠中的蜜蜂尸體，將蜂膠置于-20 ℃低溫冰箱冷藏24 h，破壁機(jī)打碎過(guò)60 目篩。稱取1.00 g 蜂膠于小燒杯中，用80%乙醇溶解，磁力攪拌器在20 ℃持續(xù)攪拌48 h，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，濾膜過(guò)濾，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容至100 mL。

1.2.2 體外消化模型 模擬胃液（記為GS）[15]：將0.8 g 胃蛋白酶、4.375 g NaCl 溶于250 mL 去離子水中，用3 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至2.0 得到人工胃液。取10 mL 1.0 mg/mL 西藏蜂膠，分別加入40 mL 人工胃液，在37 ℃ 100 r/min 搖床中避光消化（0.5、1、2、3 h），70 ℃水浴滅酶，冷卻，迅速終止反應(yīng)，離心10 min，取上清液待測(cè)。

模擬腸液（記為IS）[15]：0.143 g 胰蛋白酶和0.857 g 膽汁溶于100 mL 0.1 mol/L 的NaHCO3溶液得到人工腸液。取消化2 h 的胃消化液10 mL 加入40 mL 人工腸液，用0.4 mol/L NaOH 溶液將pH 調(diào)至6.8，在37 ℃ 100 r/min 搖床中避光消化（0.5、1、2、3 h），70 ℃水浴滅酶，冷卻，迅速終止反應(yīng)，離心，取上清液待測(cè)。

1.2.3 總酚和總黃酮含量測(cè)定 測(cè)定西藏蜂膠未消化前、胃消化2 h 和腸消化2 h 后消化液的總酚和總黃酮含量。采用福林酚法測(cè)定總酚含量[16-17]。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.9469x+0.0101，R2=0.9992?？偡雍恳悦靠朔淠z中所含沒(méi)食子酸質(zhì)量百分比表示。

參考GB/T 20574-2006 采用硝酸鋁顯色法測(cè)定總黃酮含量。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.7334x-0.0287，R2=0.9994。總黃酮含量以每克蜂膠中所含蘆丁質(zhì)量百分比表示。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定 將TP 稀釋為不同濃度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），各濃度下以VC作為對(duì)照，測(cè)定各抗氧化指標(biāo)。

1.2.4.1 還原力的測(cè)定 還原力的測(cè)定參照Gulcin[18]的方法。將1 mL 樣品與磷酸鹽緩沖液（2.5 mL，0.2 mol/L，pH6.6）和鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]（2.5 mL，1%）混合。將混合物在50 ℃下孵育20 min。2.5 mL三氯乙酸（10%）加入混合物中。取上清液（2.5 mL）與蒸餾水（2.5 mL）和FeCl3（0.5 mL，0.1%）混合，用分光光度計(jì)在700 nm 處測(cè)量吸光度。反應(yīng)混合物吸光度的增加表明還原能力的增加。

1.2.4.2 ·OH 清除率的測(cè)定 水楊酸法測(cè)定·OH 清除率[19]。將1 mL 樣品溶液與1 mL 9 mmol/L 的FeSO4和1 mL 8.8 mmol/L 的H2O2在37 ℃混合10 min，然后加入1 mL 9 mmol/L 的水楊酸的乙醇溶液10 min，5000 r/min 離心5 min，取上清液在550 nm處測(cè)吸光值。每份樣品平行操作三次，·OH 清除率計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

式中，AHx：1 mL FeSO4+1 mL 樣品+1 mL H2O2+1 mL 水楊酸-乙醇；AH0：1 mL FeSO4+1 mL 樣品+1 mL 蒸餾水+1 mL 水楊酸-乙醇；AX0：1 mL FeSO4+1 mL 蒸餾水+1 mL H2O2+1 mL 水楊酸-乙醇。

1.2.4.3 DPPH·清除率的測(cè)定 參照Yang 等[20]的方法測(cè)定DPPH·清除率。將樣品（100 μL）與DPPH自由基（100 μL，0.2 mmol）攪拌混勻，在黑暗中靜置15 min。于517 nm 處測(cè)定吸光度。所有的測(cè)定都重復(fù)進(jìn)行3 次。DPPH·清除率計(jì)算見(jiàn)公式（2）：

式中，A0為對(duì)照（不含樣品）的吸光度，A1為樣品存在時(shí)的吸光度，A2為不含DPPH 自由基的樣品的吸光度。

1.2.4.4 金屬離子螯合率的測(cè)定 參照Cai 等[21]的方法測(cè)定金屬離子螯合率。取0.8 mL 樣品溶液與50 μL 2 mmol/L 的氯化亞鐵溶液和2.75 mL 蒸餾水。通過(guò)添加200 μL 5 mmol/L 的菲洛嗪引發(fā)反應(yīng)，劇烈搖動(dòng)混合物，并在室溫下培養(yǎng)10 min。檢測(cè)562 nm 處的吸光度。以EDTA-2Na 為陽(yáng)性對(duì)照。每份樣品平行操作3 次，金屬離子螯合率計(jì)算見(jiàn)公式（3）：

式中，A0為對(duì)照品的吸光度（蒸餾水代替樣品溶液）；A1為反應(yīng)混合物中樣品的吸光度；A2僅為樣品的吸光度（蒸餾水代替氯化亞鐵溶液）。

1.2.4.5 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的測(cè)定 參照趙博等[22]的方法測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率。300 mg 卵磷脂溶于300 mL 10 mmol/L pH7.4 的磷酸緩沖液中，水浴振蕩，制成脂質(zhì)體PBS 分散系（LLS）。15 g TCA，0.375 g TBA，2.1 mL 濃鹽酸加入100 mL 水中，制成TCA-TBA-HCl 混合液。1.0 mL LLS 依次加入1.0 mL 400 μmol/L FeCl3溶液、1.0 mL 樣品，于37 ℃恒溫避光60 min，再加入2.0 mL TCA-TBA-HCl 混合液，沸水浴15 min，迅速冷卻，2000 r/min 離心10 min，取上清液在535 nm 下測(cè)吸光度?？瞻坠芪舛纫?.0 mL 蒸餾水代替1.0 mL 樣品測(cè)定。脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的計(jì)算見(jiàn)公式（4）：

式中，Ac 為空白管吸光度；As 為水解產(chǎn)物的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各處理重復(fù)3 次，采用IBM SPSS Statistics 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 7.00 對(duì)結(jié)果制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏蜂膠總酚和總黃酮含量

西藏蜂膠總酚含量為7.02%，總黃酮含量為10.05%。與已有文獻(xiàn)對(duì)比可知，西藏蜂膠總黃酮含量高于遼寧綏中蜂膠（5.35%）、吉林吉安蜂膠（6.38%）、吉林長(zhǎng)白山蜂膠（8.41%）、南昌蜂膠（3.91%）、安徽舒城蜂膠（4.44%）[23-25]。雖然黃酮類化合物屬于酚類物質(zhì)的亞組，但在本研究中總酚含量低于總黃酮含量，與Yesiltas 等[26]的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)榉止夤舛确](méi)有檢測(cè)出所有種類的酚類化合物[27]。

由表1 可知，西藏蜂膠總酚和總黃酮含量從消化前的7.02%和10.05%降到模擬胃液的0.43%和6.43%，而模擬腸液會(huì)進(jìn)一步降低到0.32%和5.11%。這可能是由于消化酶的存在降低了胃或腸消化產(chǎn)物中總酚和總黃酮的含量[12]。

表1 西藏蜂膠及其模擬消化液的總酚和總黃酮含量（%）Table 1 Contents of total phenolics and flavonoids in Tibetan propolis and its simulated digestive juices (%)

2.2 西藏蜂膠及其模擬消化液的的抗氧化活性

2.2.1 西藏蜂膠及其模擬消化液的還原力 西藏蜂膠和VC的還原力隨質(zhì)量濃度的增加而增加（如圖1A 所示）。各質(zhì)量濃度下西藏蜂膠還原力遠(yuǎn)低于VC的還原力（P＜0.05）。

圖1 西藏蜂膠（A）及其模擬消化液（B）的還原力Fig.1 Reducing power of Tibetan propolis (A) and its simulated digestive juices (B)

如圖1B 所示，模擬胃液還原力隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，消化3 h 時(shí)吸光度達(dá)到0.39，顯著高于0～2 h 時(shí)。說(shuō)明胃消化能提高西藏蜂膠的還原力。模擬腸液還原力隨消化時(shí)間的推移先增加后降低，消化1 h 時(shí)還原能力達(dá)到最大值0.13，之后再增加消化時(shí)間，還原力逐漸降低。縱觀模擬胃腸消化過(guò)程，模擬腸液還原力遠(yuǎn)低于模擬胃液。模擬腸消化階段還原力降低可能是因?yàn)樾∧c中性或微堿性環(huán)境下酚類形成不穩(wěn)定的醌中間體和其他氧化物[28]，進(jìn)而改變其抗氧化活性[29]。

2.2.2 西藏蜂膠及其模擬消化液的·OH 清除率 西藏蜂膠·OH 清除率隨著質(zhì)量濃度的增加先略降低后增加（如圖2A 所示），清除率在78.41%～96.60%。在0.2～0.6 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，西藏蜂膠·OH清除率顯著高于VC，0.8～1.0 mg/mL 范圍略低于VC（P＜0.05）。已有文獻(xiàn)顯示，陜西蜂膠的·OH 清除率在67.50%～84.70%之間，低于西藏蜂膠的清除率[30]。由此可見(jiàn)，西藏蜂膠在·OH 清除上具有優(yōu)勢(shì)。

圖2 西藏蜂膠（A）及其模擬消化液（B）的·OH 清除率Fig.2 ·OH scavenging capacity of Tibetan propolis (A) and its simulated digestive juices (B)

由圖2B 可知，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，模擬胃液的·OH 清除率逐漸提升，消化3 h 達(dá)到最高值11.84%。此時(shí)清除能力顯著高于0～2 h 的清除能力（P＜0.05）。模擬腸液對(duì)·OH 的清除率先增加后降低，在2 h 時(shí)達(dá)到最大值99.72%。模擬腸液·OH 的最高清除率高于模擬胃液。說(shuō)明腸消化能提高西藏蜂膠的·OH 清除率，這可能與胃腸不同的pH 環(huán)境有關(guān)。酚類化合物的自由基清除率活性依賴于反應(yīng)體系的pH，其能力會(huì)隨pH 的增加而增加[31-32]。

2.2.3 西藏蜂膠及其模擬消化液的DPPH·清除率隨著質(zhì)量濃度的增大，西藏蜂膠DPPH·清除率逐漸增大（如圖3A 所示）。在0.2～1.0 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，西藏蜂膠DPPH·清除率在76.04～92.53%之間，顯著低于VC（P＜0.05）。已有研究顯示，立陶宛蜂膠DPPH·清除率在23.00%～80.00%之間[33]，土耳其蜂膠則在26.49%～65.64%之間[34]，均低于西藏蜂膠。由此可見(jiàn)，西藏蜂膠具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力。

圖3 西藏蜂膠（A）及其模擬消化液（B）的DPPH·清除率Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of Tibetan propolis(A) and its simulated digestive juices (B)

如圖3B 所示，模擬胃液的DPPH·清除率在1 h時(shí)達(dá)到最大值95.69%，說(shuō)明西藏蜂膠在模擬胃階段能有效清除DPPH·。模擬腸液DPPH·的清除率先緩慢增加，在1 h 時(shí)迅速增加，2 h 時(shí)達(dá)到最大值74.74%，后略有降低。說(shuō)明模擬腸消化階段，西藏蜂膠仍有較強(qiáng)的DPPH·清除能力。Tu 等[11]指出，胃腸消化后的DPPH·清除率與其消化過(guò)程的總酚含量有關(guān)。西藏蜂膠模擬胃液DPPH·清除率高于模擬腸液，可能與總酚含量的變化相關(guān)。

2.2.4 西藏蜂膠及其模擬消化液的金屬離子螯合率

西藏蜂膠和VC的金屬離子螯合率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大（如圖4A 所示）。在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度相同時(shí)，西藏蜂膠金屬離子螯合率顯著低于VC（P＜0.05）。

圖4 西藏蜂膠（A）及其模擬消化液（B）的金屬離子螯合率Fig.4 Metal iron chelating activity of Tibetan propolis (A) and its simulated digestive juices (B)

如圖4B 所示，模擬胃液的金屬離子螯合率隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，先增加后略減少，消化時(shí)間為2 h時(shí)達(dá)到最大值（10.49%），顯著高于0、0.5、1 和3 h時(shí)（P＜0.05）。模擬腸液的金屬離子螯合率隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)上漲，且在3 h 時(shí)達(dá)到最大值69.26%，均高于模擬胃液。說(shuō)明模擬腸消化過(guò)程有利于提高西藏蜂膠的金屬離子螯合率。這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)黃酮類化合物在pH 為6.8 和7.5 下具有高螯合活性，而在酸性條件（pH≤4.5）下活性低，甚至無(wú)活性[35]。

2.2.5 西藏蜂膠及其模擬消化液的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率 西藏蜂膠的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率隨著質(zhì)量濃度的增大變化不大，略有增加（如圖5A 所示）。VC則在0.2～0.6 mg/mL 范圍內(nèi)保持平穩(wěn)，0.6～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)迅速降低。在0.2～1.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，西藏蜂膠的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率保持在80%以上，顯著高于VC（P＜0.05）。說(shuō)明蜂膠具有較好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制力。這與曹煒和盧珂等[36]的研究結(jié)果類似。其機(jī)制是酚類作為氫供體，將氫供給脂類化合物自由基，形成穩(wěn)定的酚基自由基，降低了自動(dòng)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳遞速度[36]。

圖5 西藏蜂膠（A）及其模擬消化液（B）的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率Fig.5 Lipid peroxidation inhibition ability of Tibetan propolis(A) and its simulated digestive juices (B)

如圖5B 所示，模擬胃液脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率先增加后略降低，2 h 時(shí)達(dá)到最大值26.69%，顯著高于0、0.5 和3 h 時(shí)（P＜0.05）。腸消化對(duì)西藏蜂膠脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的提升較大，該階段最高值為80.69%，高于模擬胃液的最高值。說(shuō)明經(jīng)過(guò)腸消化，西藏蜂膠具有較好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制力。模擬胃腸消化下，蜂膠的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的研究較少，腸消化引起脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率提高的原因還有待進(jìn)一步研究。

2.3 西藏蜂膠總酚、總黃酮含量和體外抗氧化活性間的相關(guān)性

西藏蜂膠總酚和總黃酮含量和體外抗氧化活性間的相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)表2。西藏蜂膠的總酚含量和總黃酮含量之間呈極顯著正相關(guān)，總酚與DPPH·、·OH 的清除率和金屬離子螯合率具有極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r分別為0.981、0.922、0.935；總酚與還原力具有顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r為-0.817。總黃酮與DPPH·、·OH 清除率和金屬離子螯合率具有極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r分別為0.990、0.993、0.966；總黃酮與還原力具有顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r為-0.815。表明西藏蜂膠抗氧化活性主要與總酚和總黃酮的存在有關(guān)，與之前的研究結(jié)果一致[37]。

表2 西藏蜂膠總酚、總黃酮與抗氧化活性的相關(guān)性Table 2 Correlation between total phenolics and flavonoids and the antioxidant capacity of Tibetan propolis

3 結(jié)論

綜上，西藏蜂膠總酚和總黃酮含量分別為7.02%和10.05%。在體外抗氧化活性多個(gè)指標(biāo)上表現(xiàn)優(yōu)異，其中·OH、DPPH·清除率和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率分別高達(dá)96.60%、92.53%和97.01%。在模擬胃腸消化過(guò)程中，模擬消化液總酚和總黃酮含量持續(xù)降低。模擬胃液DPPH·清除率高達(dá)95.69%；模擬腸液仍具有很高的·OH 清除率（99.72%）、DPPH·清除率（74.74%）、金屬離子螯合率（69.26%）和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率（80.69%）。因此，西藏蜂膠可作為優(yōu)質(zhì)天然抗氧化劑進(jìn)行后續(xù)研發(fā)。