燈盞花乙素對黑色素瘤B16 體內外的作用及機制研究

田沖沖，張 琦，包小波，陳延紳

（江蘇醫藥職業學院藥學院，江蘇鹽城 224005）

黑色素瘤是一種由黑色素細胞惡變產生的皮膚惡性腫瘤。據世界衛生組織數據統計，全世界每年約有132000 例新診斷的黑色素瘤患者[1]，且發病率在世界范圍內均呈逐年上升趨勢。雖然黑色素瘤只占皮膚癌總體的1%，但由于其惡性程度高、侵襲性強，是死亡率最高的皮膚癌類型[2]。隨著早期診斷、篩查、手術治療的改進以及革新性的靶向治療和免疫療法的出現，黑色素瘤的死亡率在過去的十幾年里有了明顯的下降[3]。但轉移性黑色素瘤患者5 年存活率仍舊不高，僅為16%[4]。我國多數黑色素瘤患者確診時常處于中晚期，平均生存期較短[5]。目前黑色素瘤的臨床治療方案仍然是以局部手術為主。放療、化療、靶向以及免疫治療等也可用于黑色素瘤的治療[6]。但是，這些治療方法存在一定的局限性[7]，如放、化療存在耐藥性以及明顯的毒性反應；靶向藥物和免疫治療的耐藥性以及高昂的治療成本也在一定程度上成為了療效提高的限制性因素。為此，迫切需要能夠治療黑色素瘤新的化學結構實體并闡明其作用機制。

燈盞細辛（Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz），又名燈盞花，是中國傳統藥材，具有消炎止痛、散寒解表、活血通絡等多種藥理作用[8]，臨床主要用于治療缺血性腦血管疾病、冠心病、心絞痛等。除此之外，燈盞花還被開發用于食品如茶飲以及化妝品領域[9-11]?，F代藥學研究證實，燈盞花中含有黃酮類、香豆素類、木脂素類、萜類等多種化學成分，其中以燈盞花乙素（Scutellarin，SCU）的含量最高[8]。進一步藥理學研究表明，SUC 具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等生物活性[12-14]。然而，目前尚無有關SCU 對黑色素瘤的作用及機制的研究。

本研究擬采用黑色素瘤B16 為研究對象，體外探究SCU 對B16 腫瘤細胞的直接作用，體內觀察其對小鼠腫瘤生長及腫瘤血管新生的影響。由于骨髓源性細胞（Bone marrow derived cells，BMDCs）在腫瘤血管新生過程中扮演著重要角色[15]，因此本研究擬進一步觀察SCU 對BMDCs 及其亞群動員的影響，以進一步闡明SCU 抗腫瘤作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性C57BL/6 小鼠（體重16±2 g） 由北京維通利華動物技術有限公司提供[動物許可證號：SCXK（京）2018-001]。飼養條件：溫度（24.0±1.0）℃，相對濕度40%～70%，晝夜交替進行光照，自由飲水和進食。所有操作均符合動物倫理學要求和實驗動物管理條例，本實驗已通過江蘇醫藥職業學院動物倫理委員會批準。

B16 細胞株 中科院上海細胞庫；胎牛血清 美國Gibco 公司；RPMI-1640 培養基 美國Gibco 公司；0.25%胰酶 Biosharp 生物科技公司；燈盞花乙素粉末 昆明龍津藥業有限公司；吉西他濱 豪森制藥有限公司；環磷酰胺 齊魯制藥（海南）有限公司；烏拉坦 上海山浦化工有限公司；肝素鈉注射液 上海上藥第一生化藥業有限公司；多聚甲醛 天津科密歐化學試劑有限公司；Matrigel 基質膠 美國BD 公司；兔IgG 免疫組化試劑盒 博士德生物工程有限公司；Laminin Abcam 公司；紅細胞裂解液、中性樹膠、DAB 博士德生物工程有限公司；蘇木素染色液 上海碧云天生物科技有限公司；乙醇、二甲苯 國藥集團化學試劑有限公司；PE-anti-mouse VEGFR2、PE-anti-mouse Gr-1、Alexa Fluor488 antimouse CD11b Biolegend 公司。

HF90 細胞培養箱 上海力申儀器有限公司；醫用超凈工作臺 江蘇蘇凈集團有限公司；XD-202 倒置顯微鏡 德國ZEISS 公司；游標卡尺 世達工具有限公司；ELX808 酶標儀 美國BIOTEK 公司；TS-1000 脫色搖床 其林貝爾儀器制造有限公司;YB5001B 電子太平 上海衡際科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 B16 細胞培養 將小鼠惡性黑色素瘤B16 細胞培養于含10%的胎牛血清的RPMI 1640 培養基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。采用0.25%胰酶常規消化細胞并傳代。

1.2.2 CCK-8 實驗 參考彭布成等[16]的方法，取對數生長期的B16 細胞以8×103個/孔的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于培養箱中培養24 h 后，分別加入不同濃度梯度（0、20、40、80、160、320 及640 μmol/L）的SCU，同時設置空白對照組（無B16細胞）、陽性對照組 [0.1 μmol/L 吉西他濱（GEM）]，每組6 個復孔。48 h 后，向每孔中添加CCK-8 溶液10 μL，孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm 處的光密度（OD）值，計算細胞增殖率。上述實驗單獨重復3 次。

1.2.3 Transwell 實驗評估細胞的遷移和侵襲能力 參考張媛等[17]的實驗方法并進行修改。

1.2.3.1 遷移實驗 B16 細胞常規消化后，用無血清的RPMI-1640 培養基重懸細胞，按2×105個/孔的密度接種至Transwell 上室中，并加入含200 μL 無血清培養基。下室加入600 μL 用完全培養基配制的不同濃度藥物溶液（SCU 0、160、320 μmol/L；GEM 0.1 μmol/L），于培養箱培養48 h。取出上室，經無水酒精固定后，結晶紫染色，雙蒸水沖洗后于顯微鏡下隨機選取5 個視野進行觀察拍照，觀察并計算各組細胞穿出膜的數量。每組設置3 個復孔，實驗單獨重復3 次。

1.2.3.2 侵襲實驗 預先使用稀釋后的Martrigel 基質膠包被于Transwell 上室，自然晾干，其他步驟與遷移實驗步驟相同。

1.2.4 荷瘤小鼠模型的建立 參考 Fernandes 等[18]的方法建立B16 荷瘤小鼠模型，即B16 細胞經胰酶消化后，用RPMI-1640 培養基重懸并調整細胞濃度為1×107個/mL，接種于C57BL/6 小鼠股溝皮下，每只0.1 mL（1×106個細胞）。

1.2.5 實驗動物分組及給藥 C57BL/6 小鼠皮下注射接種B16 細胞后，隨機分為4 組，每組6 只：對照組（生理鹽水）、40 mg/kg 環磷酰胺（CTX）組、30 mg/kg SCU 組和60 mg/kg SCU 組，接種24 h 后，按上述分組分別采取腹腔注射給予CTX 以及灌胃給予相應劑量的SCU，之后每24 h 給藥一次，共給藥13 次。

1.2.6 小鼠稱重以及采集腫瘤組織樣本 小鼠每天稱重；待小鼠體內腫瘤長出后，用游標卡尺每隔1 天測量腫瘤長徑（a）與短徑（b），記錄并計算小鼠腫瘤體積（V=1/2ab2）。待小鼠腫瘤最大直徑約為10 mm時，20%（（w/v）烏拉坦腹腔注射麻醉小鼠，用1 mL注射器抽取腹腔靜脈血，剝離腫瘤組織，稱重并拍照，將腫瘤組織投入到預先配好的4%（w/v）多聚甲醛中固定。

1.2.7 腫瘤組織免疫組化染色 參考試劑盒說明書和李湘平等[19]的方法，略作修改。將經脫水處理后的腫瘤組織放入熔融石蠟中進行包埋，包埋后的組織塊切成約5 μm 厚的切片。切片經二甲苯、乙醇中浸泡后，滴加過氧化物酶去除劑、封閉液，作用后分別加入用PBS 稀釋的Laminin 一抗，4 ℃過夜后，分別加入二抗、SABC（鏈霉親和素-過氧化物酶復合物）。用DAB 染色水沖洗，蘇木素溶液中復染，二甲苯溶液中透明處理，中性樹膠封片，后在光學顯微鏡下觀察腫瘤組織微血管分布情況。

1.2.8 流式細胞術檢測SCU 對荷瘤小鼠循環血液中BMDCs 動員的影響 參考Zhou 等[20]的實驗方法，將抽取的腹腔靜脈血于1000 r/min，離心5 min，棄上清。加入10 倍體積的紅細胞裂解液，于冰上裂解5 min。待裂解完成后于4 ℃，1000 r/min，離心5 min，棄紅色上清。加入500 μL PBS 重懸，調整細胞數至1×106個/mL。加入100 μL 抗體稀釋液于4 ℃避光孵育45 min 后，1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS 重懸，重復洗滌2 次。用500 μL 1%（w/v）多聚甲醛固定后上流式儀進行檢測SCU 對荷瘤小鼠循環血液中VEGFR2+和Gr-1+CD11b+BMDCs細胞計數的影響。

1.3 數據處理

所有細胞實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 23.0 統計軟件對數據進行統計和分析；采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SCU 對B16 腫瘤細胞增殖的影響

本實驗首先在體外水平考察SCU 對B16 細胞的增殖抑制作用。由圖1 CCK-8 檢測結果可知，用濃度為20、40、80、160、320、640 μmol/L 的SCU以及0.1 μmol/L 的GEM 處理細胞48 h 后，與空白對照組相比，各組B16 細胞的相對增殖率分別為 96.04%、 88.59%、 79.34%、 52.85%、 41.93%、25.62%和34.20%。其中，當SCU 濃度為160、320、640 μmol/L 時，B16 的增殖率明顯減少，差異具有極顯著意義（P＜0.01）。且320、640 μmol/L SCU 處理組的增殖抑制作用與陽性藥0.1 μmol/L GEM 處理組相當。結果提示，SCU 可明顯抑制B16 細胞的增殖。

圖1 SCU 對B16 腫瘤細胞增殖的影響Fig.1 Effect of SCU on the proliferation of B16 cells

2.2 SCU 對B16 腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響

基于抗增殖實驗的結果，選擇了160 和320 μmol/L 兩個SCU 濃度進行后續的侵襲和遷移實驗。通過Transwell 實驗檢測了SCU 作用于B16細胞48 h 后對腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響。如圖2 所示，與空白對照組相比，160、320 μmol/L 的SCU 以及0.1 μmol/L 的GEM 處理組穿過小室的細胞更少。說明SCU 抑制了細胞的遷移和侵襲。經統計（圖3），160 μmol/L 的SCU 以及0.1 μmol/L 的GEM 均可顯著抑制黑色素瘤B16 細胞的遷移（P＜0.05）；320 μmol/L 的SCU 可極顯著抑制黑色素瘤B16 細胞的遷移（P＜0.01）。無論是0.1 μmol/L 的GEM 還是160、320 μmol/L 的SCU 均可極顯著抑制黑色素瘤B16 細胞的侵襲（P＜0.01）。以上結果提示SCU 能夠抑制B16 腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。

圖2 SCU 對B16 腫瘤細胞遷移和侵襲的影響Fig.2 Effect of SCU on the migration and invasion capacity of B16 cells

圖3 SCU 對B16 細胞遷移（A）和侵襲（B）的統計分析Fig.3 Statistic analysis of SCU on the migration (A) and invasion (B) ability of B16 cells

2.3 SCU 對黑色素瘤B16 荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

為了進一步驗證SCU 對黑色素瘤的增殖抑制作用，接下來，在體內水平探索了不同劑量SCU 對B16 細胞荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用。如圖4A所示，在給藥13 d 后，與空白對照組相比，30 mg/kg SCU 組、60 mg/kg SCU 組腫瘤平均體積分別減少了30.1%和60.5%，差異具有極顯著性（P＜0.01）。同時，整個給藥期間，無論是30 mg/kg 還是60 mg/kg SCU 處理組均未引起小鼠體重明顯的下降（圖4B）。提示SCU 在抑制B16 荷瘤小鼠腫瘤生長的同時并未引起明顯的毒性。

圖4 SCU 對B16 荷瘤小鼠腫瘤體積（A）和體重（B）的影響Fig.4 Effect of SCU on tumor volume (A) and weight (B) of B16-bearing mice

實驗結束后處死小鼠并剝離腫瘤組織稱重，如圖5 所示，空白對照組以及各給藥組（CTX 40 mg/kg、SCU 30 mg/kg 和60 mg/kg）的瘤重分別為1.22±0.09 g、0.68±0.46 g、0.31±0.17 g 和0.24±0.17 g。與空白對照組相比，40 mg/kg CTX 組瘤重減少44.3%，具有顯著性差異（P＜0.05）；30 mg/kg SCU 組和60 mg/kg SCU 組瘤重分別減少74.6%和80.3%，均具有極顯著性差異（P＜0.01）。由以上結果可知，SCU 能夠顯著抑制在體腫瘤B16 的生長。

圖5 SCU 對B16 荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Fig.5 Effect of SCU on the growth of B16 tumor from mice

2.4 SCU 對B16 荷瘤小鼠微血管密度的影響

微血管密度（Microvascular density，MVD）是直觀評估腫瘤血管生成程度的定量指標，間接判斷血管生成能力[21]。層粘連蛋白（Laminin，LN）是構成細胞間質的一種非膠原糖，與膠原一起構成基底膜的成分，在體內參與細胞黏附、轉移、分化、生長，以及信號轉導、組織修復，且在血管生成中也具有重要作用[22]。LN 主要存在于微血管基底膜中，檢測LN 可反映微血管結構完整性[23]。為了在體內水平探討SCU 抑制黑色素瘤的機制，采用免疫組化方法對腫瘤組織切片進行了LN 染色以評估SCU 能否影響B16腫瘤的微血管密度（Microvascular density，MVD）。如圖6 所示，顯微鏡下觀察組織切片可見陽染的微血管廣泛分布于腫瘤組織間質（圖中箭頭所指）。通過免疫組織化學半定量分析結果顯示，與空白對照組相比，40 mg/kg CTX 組腫瘤組織的MVD 減少25.44%，差異具有顯著性（P＜0.05）；30 mg/kg SCU組及60 mg/kg SCU 組腫瘤組織的MVD 分別減少36.03%和44.61%，具有極顯著差異（P＜0.01）。結果表明，SCU 可以降低B16 荷瘤小鼠腫瘤組織的MVD。

圖6 SCU 對B16 腫瘤組織微血管密度的影響Fig.6 Effect of SCU on microvessel density in B16 tumor tissue

2.5 SCU 對B16 荷瘤小鼠循環血液中BMDCs 動員的影響

骨髓源性細胞（Bone marrow-derived cells,BMDCs）由內皮和周細胞祖細胞以及促血管生成、腫瘤浸潤的免疫細胞組成，在腫瘤血管新生、腫瘤生長和轉移中發揮著十分重要的作用[24]。其中，血管內皮生長因子受體2 陽性（Vascular endothelial growth factor receptor 2 positive，VEGFR2+）內皮祖細胞傾向于沉積于血管生成活躍的血管腔中，促進血管形成[25-26]。抑制內皮細胞祖細胞可抑制腫瘤移植物的血管生成，從而增加動物存活率[27]。晚期癌癥患者循環VEGFR2+BMDCs 細胞水平升高則與總生存期更差相關[28]。因此，為了進一步闡明SCU 的抗腫瘤作用，首先采用流式細胞技術檢測了SCU 對B16 荷瘤小鼠外周循環血液中VEGFR2+BMDCs 亞群細胞計數的影響。結果如圖7 所示，對照組及各給藥組VEGFR2+BMDCs 計數分別為14.33%、6.83%、4.59%及4.25%。與空白對照組相比，40 mg/kg CTX 組、30 mg/kg SCU 組及60 mg/kg SCU 組計數平均減少52.32%、67.95%及70.35%，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。結果表明SCU 可以減少B16 荷瘤小鼠外周循環血中VEGFR2+BMDCs 水平。

圖7 SCU 對B16 荷瘤小鼠外周血中VEGFR2+ BMDCs計數的影響Fig.7 Effect of SCU on numbers of VEGFR2+ BMDCs in peripheral blood of B16-bearing mice

BMDCs 中的骨髓抑制細胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）在腫瘤免疫抑制以及血管形成過程中也扮演著重要的角色[29-30]。MDSCs 是由未成熟的髓系細胞組成的異質性細胞群體，其中CD33+CD11b+HLA-DRlow-/-是人的MDSCs 標志物，Gr1+CD11b+為小鼠的MDSCs 標志物[31]。因此，采用流式細胞技術也檢測了SCU 對B16 荷瘤小鼠外周循環血液中Gr-1+CD11b+MDSCs 細胞計數的影響。結果如圖8 所示，空白對照組、40 mg/kg CTX 組、30 mg/kg SCU 組及60 mg/kg SCU 組的Gr-1+CD11b+MDSCs 計數分別為84.73%、61.62%、44.74%及24.90%。與空白對照組相比，40 mg/kg CTX 組計數減少27.28%，差異具有統計學意義（P＜0.05）；30 mg/kg SCU 組及60 mg/kg SCU 組計數分別減少了47.20%及70.61%，具有極顯著差異（P＜0.01）。結果表明SCU 也可以減少B16 荷瘤小鼠外周循環血中Gr-1+CD11b+MDSCs 的水平。

圖8 SCU 對B16 荷瘤小鼠外周血中Gr-1+CD11b+MDSCs 計數的影響Fig.8 Effect of SCU on numbers of Gr-1+CD11b+MDSCs in peripheral blood of B16-bearing mice

3 結論

本實驗對SCU 的抗黑色素瘤作用進行了探究。結果顯示，SCU 在160～640 μmol/L 濃度范圍內均可顯著抑制B16 細胞的增殖，且160 μmol/L 與320 μmol/L 的SCU 還能夠顯著抑制B16 腫瘤細胞遷移和侵襲。接下來的體內移植瘤實驗結果表明，SCU 可明顯抑制B16 腫瘤生長，與空白對照組相比，30 mg/kg SCU 組和60 mg/kg SCU 組瘤重分別減少74.6%和80.3%。同時30 mg/kg 及60 mg/kg SCU處理組還可顯著降低腫瘤組織的MVD。證實SCU 在體內水平也具有抗黑色素瘤作用。后續的流式細胞術分析結果證實，30 mg/kg 和60 mg/kg SCU 可明顯減少小鼠循環血液中VEGFR2+BMDCs及Gr-1+CD11b+BMDCs 的計數。以上結果也驗證了SCU 的抗腫瘤作用可能也與其抑制BMDCs 的動員，從而間接減少了腫瘤血管新生有關。

綜上所述，SCU 具有抑制B16 腫瘤的生長的作用，這一作用與其直接抑制腫瘤細胞增殖、遷移侵襲能力有關，更與其抑制BMDCs 的動員，從而間接削弱了腫瘤血管新生密切相關。本次研究雖為深入了解SCU 抗癌的藥理學作用規律機制提供了一定的理論依據，但僅僅是從體內外實驗的角度初步探討了SCU 對B16 腫瘤生長的抑制作用，后續還需要對具體的作用機制進行更為深入的研究和驗證，以便全面、準確地掌握SCU 的藥理作用規律，提高腫瘤治療效果，加快其早日應用于臨床腫瘤治療的步伐。