枸杞葉多糖對小鼠代謝、抗氧化、免疫功能及腸道微生物的影響

白 敏，張 穎，李泉積，姬 錦，金亞婷，王 琦, ，趙嘉慶,3,4,5,

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，寧夏銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學醫(yī)學科學技術研究中心，寧夏銀川 750004；4.寧夏常見傳染病防控重點實驗室，寧夏銀川 750004；5.寧夏回族自治區(qū)醫(yī)學科學研究所，寧夏銀川 750004）

枸杞是中國傳統(tǒng)的中草藥，也是一種食品補充劑。隨著研究的深入，已證明枸杞是一種能夠增強免疫力[1-2]、緩解炎癥[3]，抗腫瘤[4]、降糖調(diào)脂[5]、保肝護肝[6]功效的藥食兩用植物。在發(fā)展食用枸杞果的同時，作為副產(chǎn)業(yè)的枸杞葉在市場上創(chuàng)造的效益也相當可觀[7]，不僅因其含有枸杞多糖和特殊的營養(yǎng)成分，更由于其既可作茶飲又可作為藥材食用，因此人們對枸杞葉的需求量呈逐年遞增的趨勢[8]。研究表明枸杞葉的化學成分，無論在活性成分、營養(yǎng)成分還是微量元素方面，與果實基本一致，而且在量上某些成分甚至超過果實[9]。增加對枸杞葉的研究開發(fā)可以變廢為寶，擴大資源并有效利用資源。

枸杞多糖作為枸杞葉中的主要有效成分，關于其提取工藝及食用療效的研究也在逐漸增加。目前的研究表明枸杞葉多糖對糖尿病[10]、過敏性哮喘[11]、阿爾茨海默癥[12]等多種疾病表現(xiàn)出有益作用。但關于枸杞葉多糖的使用劑量與功效仍不明確，對機體健康水平的評估如生物代謝、抗氧化能力及免疫功能等方面的研究鮮有報道，因此本工作主要研究不同劑量的枸杞葉多糖對小鼠腸粘膜的變化、抗氧化能力、免疫功能指標、生物代謝及腸道菌群的影響，從而評估枸杞葉多糖對機體的健康水平是否具有促進作用，為枸杞葉多糖的功效研究和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6～8 周C57BL/6 雌性小鼠 40 只，平均體重18～22 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司（合格證號：SCXK 京 2016-0006，倫理審查批準號：2019-121）。 隨機分為4 組分別為正常對照組、枸杞葉多糖低、中、高劑量組，每組10 只。喂養(yǎng)于濕度為50%～60%，溫度20～26 ℃明暗交替12 h 的SPF 級的動物房內(nèi)，用高壓滅菌處理的飲用水和飼料進行飼養(yǎng)。

枸杞葉多糖（含量為60%） 由寧夏森淼科技集團股份有限公司提供；小鼠飼料 購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物有限公司；流式抗體抗小鼠CD3-APC、APC Rat IgG2bκ（CD3 同型對照）標記T 細胞、抗小鼠CD19-PE、PE Rat IgG2aκ（CD19 同型對照）標記B細胞、抗小鼠CD11c-FITC、FITC Armenian Hamster IgG（CD11c 同型對照）標記樹突狀細胞（DC）細胞美國Biolegend 公司；小鼠脾臟淋巴試劑盒、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（pH7.2～7.4）、培養(yǎng)基1640、紅細胞裂解液 中國索萊寶公司；總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；文庫定量試劑盒 美國Kapa Illumina 公司。

BD Accuri C6 型流式細胞儀 美國BD Biosciences；THZ-98 型氣浴恒溫振蕩器 上海博訊實業(yè)有限公司；Z326k 型臺式冷凍離心機 德國Hermle公司；S-3400N 型掃描電鏡 日本日立公司；2100 型生物分析儀 美國Agilent 公司；AU400 型全自動生化分析儀 日本Olympus。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞葉多糖干預小鼠 正常對照組灌服生理鹽水200 μL。枸杞葉多糖低、中、高劑量組每日灌服等體積純枸杞葉多糖的劑量為50、100、150 mg/kg 枸杞葉多糖。以上操作1 次/d，連續(xù)7 周。灌胃劑量的選擇參考之前的報道[13]，其實驗結果表明在小鼠模型中灌服枸杞多糖在17.5～140 mg/kg區(qū)間，免疫量效關系呈現(xiàn)上升趨勢。因此設置將50、100、150 mg/kg 三個劑量作為本次枸杞葉多糖低、中、高劑量的研究對象，從而探究枸杞葉多糖對機體的影響。

1.2.2 掃描電鏡觀察 7 周灌胃結束后，麻醉小鼠，從距Treitz 韌帶約10 cm 處取下一段空腸，縱行切開腸管，用生理鹽水充分沖洗腸內(nèi)容物，沖洗干凈后浸入2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定2 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗三次，每次10 min；加入1%鋨酸，4 ℃，固定1 h，0.1 mol/L 磷酸緩沖液清洗兩次；梯度乙醇脫水：30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇室溫各10 min。75%、100%的叔丁醇中干燥兩次，每次15 min，置于-20 ℃冰箱冰凍10 min。真空干燥后，進行真空鍍膜噴涂，使用S-3400N 掃描式電子顯微鏡觀察[14]。

1.2.3 小鼠血清抗氧化能力的測定 7 周灌胃結束后麻醉小鼠，眼球取血于1.5 mL 高壓滅菌后的EP管中，4 ℃、2000 r/min、離心15 min，分離出血清。進行T-SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量的檢測，其檢測均采用南京建成生物工程研究所試劑盒，操作步驟按照說明書進行。

1.2.4 脾臟組織單細胞懸液的制備 采血取眼球血后，處死小鼠，打開小鼠腹腔，分離脾臟，將其浸浴在預冷的完全培養(yǎng)基中。將脾臟放在兩層300 目尼龍網(wǎng)膜中間，浸浴在完全培養(yǎng)基中，用5 mL 注射器活塞沿同一方向側向研磨脾臟，使脾細胞游離出來。用300 目尼龍網(wǎng)膜過濾研磨好的脾細胞懸液，15 mL離心管收集濾液。4 ℃、400×g、5 min 離心，棄上清，留沉淀。向沉淀中加入5 mL 1×紅細胞裂解液，混勻，冰上孵育5 min。用適量的磷酸鹽緩沖液重懸細胞沉淀，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×107個/mL。

1.2.5 流式細胞術檢測脾臟免疫細胞數(shù)量 取出100 μL 制備好的脾臟組織單細胞懸液，其細胞數(shù)量為1×106個/mL，各加入2 μL CD3-APC 標記T 細胞、CD19-PE 標記B 細胞、CD11c-FITC 標記DC 細胞。同時設置同型對照組，分別加入同型抗體APC Rat IgG2bκ、PE Rat IgG2aκ、FITC Armenian Hamster IgG。冰上孵育30 min，染色緩沖液洗滌兩次，流式細胞儀BD Accuri C6 上機檢測。

1.2.6 小鼠血清生化指標的測定 取各組小鼠全血于抗凝管中，將全部全血樣本置于高速離心機3000×g離心15 min 分離血清，進行生化指標的測定。測定指標包括血糖、膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯、膽固醇、總蛋白、白蛋白、球蛋白、肌酐、尿酸、尿素氮等18 項生化指標的檢測，所有生化檢測指標均由寧夏醫(yī)科大學科技中心醫(yī)學分析檢測中心OlympusAU400 全自動生化分析儀檢測。

1.2.7 小鼠糞便16S RNA 測序 收集連續(xù)灌胃7 周后，正常對照組及高劑量枸杞葉多糖組小鼠糞便。十六烷基三甲基溴化銨法提取各組糞便樣本中的總DNA，采用紫外分光光度計對DNA 進行定量。用引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'） 805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）PCR 擴增16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)。PCR 擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對純化后的PCR 產(chǎn)物使用Agilent 2100 生物分析儀和Illumina 的文庫定量試劑盒進行評估。根據(jù)測序所到的樣本中的序列信息與Silva 和NT-16S 數(shù)據(jù)庫進行比對作物種分類及后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Graphpad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，各組實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，枸杞葉低、中、高劑量組分別同正常對照組進行兩樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 枸杞葉多糖干預后對小鼠腸粘膜的影響

根據(jù)1.2.2 節(jié)的方法，結果發(fā)現(xiàn)小鼠腸絨毛呈比較寬厚的葉片狀，排列整齊、規(guī)則，表面有縱橫交錯，深淺不一的裂隙，不同劑量的枸杞葉多糖干預后同正常對照組相比無明顯變化（見圖1）。表明不同劑量的枸杞葉多糖不會對小鼠腸粘膜造成損傷。

圖1 枸杞葉多糖干預后對腸粘膜的影響Fig.1 The effect of Lycium barbarum leaves polysaccharides intervention on intestinal mucosa

2.2 枸杞葉多糖干預后對小鼠抗氧化能力的影響

大多數(shù)植物多糖都有抗氧化功能[15-16]，譚連杰[17]在評估多糖對機體產(chǎn)生的影響時，對實驗動物抗氧化能力、免疫功能及生物代謝等方面的作用進行了評估，因此進行了參考。為了進一步驗證枸杞葉多糖對小鼠機體抗氧化能力的影響，通過口服不同劑量枸杞葉多糖后，檢測小鼠血清中丙二醛（MDA），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），總超氧化物歧化酶（T-SOD）指標。T-SOD 具有抗氧化能力，且消除代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基，保護細胞免受損傷。MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其濃度與細胞損傷程度呈正相關性，其濃度可間接反映膜脂過氧化程度[18]。GSH-Px 是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，通過將脂質(zhì)過氧化氫還原為相應的醇，并將H2O2還原為水來保護機體免受氧化損傷[19]。由表1可知，與正常對照組比較，中、高劑量枸杞葉多糖組均可以升高血清中T-SOD 水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量枸杞葉多糖組可以降低血清中MDA 水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中、高劑量枸杞葉多糖可升高GSH-Px 的活性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。目前的研究中許多植物多糖均有抗氧化的能力[20]，在一些動物如，蝦[21]、鯉魚[22]、雞[23]、小鼠[24]等動物的飼料中添加多糖或以口服的方式灌胃多糖類食品均可起到抗氧化的能力，同時起到提高免疫力的作用。研究結果表明，來源于枸杞葉中的多糖同樣具有一定的抗氧化作用。

2.3 枸杞葉多糖干預后對小鼠免疫應答能力的影響

T 細胞具有直接殺傷靶細胞、輔助和抑制B 細胞產(chǎn)生抗體、分泌細胞因子等作用，可以抵御疾病的感染和腫瘤的形成。B 細胞受到抗原刺激后就會轉(zhuǎn)變成漿細胞，漿細胞可以合成和分泌各種抗體，發(fā)揮體液免疫的功能。樹突狀細胞是機體免疫系統(tǒng)中功能最強大、最有效的抗原遞呈細胞，能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原[25]。一些植物多糖已經(jīng)表現(xiàn)出對免疫細胞的調(diào)節(jié)能力[26-28]。為了評價枸杞葉多糖對小鼠免疫功能的影響，采用1.2.4 與1.2.5 節(jié)的方法，口服不同劑量的枸葉多糖后，同正常對照組相比，脾臟淋巴細胞流式結果橫坐標表示抗體類型，縱坐標表示相對細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)枸杞葉多糖低、中、高劑量組的T 細胞水平顯著提升，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（見圖2）。同正常對照組相比，低、中、高劑量枸杞葉多糖組B 細胞數(shù)量無明顯變化（見圖3）。同正常對照組相比，枸杞葉多糖低、中、高劑量組DC 細胞數(shù)量顯著上升（P＜0.05）（見圖4）。不同種類免疫細胞數(shù)量的統(tǒng)計結果見圖5，縱坐標為細胞在脾臟總細胞中所占比例。實驗通過檢測小鼠脾臟的淋巴細胞數(shù)量變化探究枸杞葉多糖對免疫細胞的作用可知，枸杞葉多糖可增強機體特異性免疫中的T 細胞免疫，但對B 細胞數(shù)量產(chǎn)生無明顯變化。有報道顯示，DC 細胞是機體免疫系統(tǒng)中重要的抗原提呈細胞，功能強大，可活化初始T 細胞從而調(diào)控天然免疫和獲得性免疫[29]，因此枸杞葉多糖可提高天然免疫與特異性免疫功能。這對提高機體免疫力具有重要意義。

圖2 枸杞葉多糖干預對小鼠T 細胞的影響Fig.2 Effect of Lycium barbarum leaves polysaccharides intervention on T cells in mice

圖3 枸杞葉多糖干預對小鼠B 細胞的影響Fig.3 Effect of Lycium barbarum leaves polysaccharides intervention on B cells in mice

圖4 枸杞葉多糖干預對小鼠DC 細胞的影響Fig.4 Effect of Lycium barbarum leaves polysaccharides intervention on DC cells in mice

圖5 枸杞葉多糖干預后對小鼠脾臟淋巴細胞數(shù)量的影響Fig.5 Effect of Lycium barbarum leaves polysaccharides intervention on the number of spleen lymphocytes in mice

2.4 枸杞葉多糖干預后對小鼠機體生物代謝的影響

通過不同劑量枸杞葉多糖對小鼠腸粘膜的影響結果可知，高劑量的枸杞葉多糖對小腸粘膜無損害。其次，根據(jù)枸杞葉多糖對小鼠的抗氧化能力和免疫功能的研究結果發(fā)現(xiàn)，高劑量的枸杞葉多糖對小鼠的促進作用最佳。因此，檢測高劑量枸杞葉多糖組對小鼠生物代謝的改變。結果顯示，同正常對照組相比較，枸杞葉多糖高劑量組甘油三脂、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著低于正常對照組（P＜0.05），有統(tǒng)計學意義（見表2）。其它生化指標無顯著差異。甘油三酯來自于脂肪物質(zhì)的分解，甘油三酯過多會導致皮下脂肪的堆積，引起肥胖[30]，表明服用高劑量的枸杞葉多糖可在一定程度上幫助機體分解脂肪。谷草轉(zhuǎn)氨酶存在于肝細胞中，當肝功能受到損傷時谷草轉(zhuǎn)氨酶會升高[31]，口服高劑量的枸杞葉多糖可降低谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量，表明高劑量枸杞葉多糖的攝入對正常小鼠肝臟的保護具有一定的促進作用。其次其它生化指標沒有影響，表明高劑量的枸杞葉多糖不會對機體的基本生物代謝產(chǎn)生損害。

表2 枸杞葉多糖干預后對小鼠血清生化指標的影響（xˉ±s，n=10）Table 2 Effect of Lycium barbarum leaves polysaccharides intervention on serum biochemical indexes (xˉ±s，n=10)

2.5 枸杞葉多糖干預后小鼠體內(nèi)腸道菌群的變化

為了確定灌胃枸杞葉多糖后，小鼠腸道微生物區(qū)系是否發(fā)生變化，使用16S RNA 測序技術檢測正常對照組及高劑量枸杞葉多糖組小鼠糞便菌種的RNA，并進行差異性分析，篩選P值小于0.05 的物種繪制柱狀圖。圖中橫坐標為分組，縱坐標為物種相對豐度。枸杞葉多糖高劑量組與對照組相比（圖6），在門水平上，灌胃高劑量枸杞葉多糖的小鼠疣微菌門顯著增加（P＜0.05）。在屬水平上，灌胃了高劑量枸杞多糖的小鼠腸道菌群中杜氏桿菌（Dubosiella）、糞桿菌屬（Faecalibaculum） 、 乳桿菌 HT002（LactobacillaceaeHT002）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）這些有益菌均增加。這些菌參與調(diào)節(jié)代謝途徑，例如參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝、短鏈脂肪酸代謝和信號轉(zhuǎn)導途徑等[32-34]。疣微菌門的代表菌屬——嗜黏蛋白阿克曼菌，它利用腸道粘蛋白作為能量來源，保護腸道免受病原體的侵襲，是一種潛在的益生菌[35]；乳桿菌和瘤胃球菌屬通過產(chǎn)生抑制病原體增殖和減少腸道炎癥的短鏈脂肪酸來減少細菌感染[36]。這一研究表明服用枸杞葉多糖能夠改善腸道菌群，增加益生菌的豐度，能夠抵抗和預防更多疾病。

圖6 枸杞葉多糖干預后對小鼠體內(nèi)腸道菌群的影響Fig.6 Effect of Lycium barbarum leaves polysaccharides intervention on intestinal flora in mice

3 結論

本研究著重于枸杞葉多糖對機體的功效，通過服用不同劑量的枸杞葉多糖，表明服用高劑量（150 mg/kg）枸杞葉多糖對腸粘膜的結構及生物代謝無任何損傷，且有助于甘油三酯的分解及肝臟的保護。同時，增加機體的抗氧化能力、調(diào)節(jié)免疫功能、改善腸道菌群，使機體抵御病原體的侵害，從而達到預防疾病的目的。而低、中劑量枸杞葉多糖與正常對照組相比有較小差異或無差異，造成此現(xiàn)象最大的原因是由于動物實驗中灌胃的時間有限，低、中劑量的效果發(fā)揮可能需要更長的時間。其次通過不同劑量的比較時發(fā)現(xiàn)，枸杞葉多糖高劑量（150 mg/kg）服用時效果最佳，為枸杞葉多糖劑量的選擇提供參考。同時，為枸杞葉的開發(fā)利用提供了理論支撐，提高枸杞葉的利用率，具有創(chuàng)新和實用性。