銀杏肽鋅螯合物的制備、體外消化及抗氧化活性分析

鄭 義，李詩穎，李 闖，周小芮，陳亞楠，張秀蕓，張銀雨

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇徐州 221018；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇徐州 221018）

銀杏（Ginkgo biloba）種仁（白果）為衛健委公布的藥食同源物質，《本草綱目》記載其具有化痰、止咳、斂肺、平喘等功效。銀杏干制品中蛋白含量13.2%[1]，氨基酸組成合理，屬于優質植物蛋白[2]。目前我國對銀杏資源開發利用還處于初級階段，由于銀杏產量大，價格低，大量資源被浪費，迫切需要開發銀杏精深加工產品[3]。銀杏肽（Ginkgo bilobapeptides,GBP）為銀杏蛋白經過蛋白酶水解得到的肽類混合物，所選蛋白酶通常為風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等單一或復合蛋白酶；具有抗氧化[4-6]、降血壓[7]、降血糖[8]、降血脂[9]和肝保護[10]等作用，且易被吸收利用，具有廣泛的應用前景。

鋅是人體必需的微量元素之一，在蛋白質與核酸合成、生長發育、免疫調節、傷口愈合、維持正常味覺和食欲等方面具有重要作用[11]。近年來，我國人群鋅膳食攝入量顯著改善，但各年齡段仍存在不同程度的缺鋅，尤其老年人尤為嚴重[12]。傳統的無機鋅和有機酸鋅補充劑易與食物中的草酸、植酸等生成沉淀，鋅的生物利用率較低，且有一定的副作用[13]。因此亟待開發高效安全且生物利用度率高的鋅補充劑。研究表明，生物活性肽可通過羧基、氨基、亞氨基等基團與鋅離子配位形成穩定的可溶性肽鋅螯合物，一方面通過與鋅離子的協同作用提高生物活性肽的原有活性，另一方面肽鋅螯合物以肽的形式被消化吸收，可提高鋅的生物利用率[14]。國內外已有不少以動植物蛋白源生物活性肽與鋅金屬離子反應制備肽鋅螯合物的研究報道。Wang 等制備了一種用于補鋅的酪蛋白源肽鋅螯合物納米顆粒，經體外模擬胃腸消化吸收后仍然有40%的鋅離子以肽鋅螯合物的形式存在[15]。Liu 等采用菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶分步水解法制備低分子量雞皮膠原蛋白肽，進一步將雞皮膠原蛋白肽與硫酸鋅螯合制備了新型肽鋅螯合物，研究發現肽鋅螯合物的生物利用度高于硫酸鋅，可通過減少腫瘤細胞和微環境中的自噬而抑制腫瘤生長[16]。鄭英敏等通過Alcalase 酶水解大豆分離蛋白制備大豆多肽，并將大豆多肽與氯化鋅進行螯合反應制備肽鋅螯合物，結構分析表明鋅離子可以與多肽中的羧基、氨基和肽鍵結合，從而形成大豆多肽鋅螯合物[17]。現有研究報道存在鋅離子與肽的螯合率偏低、肽鋅螯合物在人體內的生物利用率不高等問題，因此亟需制備和鑒定新型肽鋅螯合物。我國銀杏資源豐富，銀杏肽具有廣泛的生物活性，以銀杏肽為原料制備銀杏肽鋅螯合物（Ginkgo bilobapeptides-zinc chelate, Zn-GBP）具有重要研究意義與應用前景，目前有關Zn-GBP 的研究未見報道。

本研究采用復合風味蛋白酶水解銀杏蛋白制備銀杏肽，將銀杏肽與硫酸鋅進行螯合反應制備Zn-GBP，采用響應面法優化Zn-GBP 的制備工藝，通過體外模擬胃腸道消化分析Zn-GBP 中鋅離子的生物利用率，以清除DPPH 和ABTS+自由基清除能力、還原能力為指標，評價了Zn-GBP 的體外抗氧化活性，旨在為銀杏資源的開發利用，為Zn-GBP 的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏 2021 年10 月采收于江蘇省邳州市；復合風味蛋白酶（1.5×104U/g） 丹麥諾維信公司；胃蛋白酶（EC 3.4.23.1, 1.2×104U/g）、胰蛋白酶（EC 3.4.21.4, 5.0×104U/g） 國藥集團化學試劑有限公司；還原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）、DPPH 和ABTS 美國Sigma-Aldrich 公司；其他試劑均為國產分析純。

DCTZ-1000 多用途恒溫超聲提取機 北京弘祥隆生物技術開發有限公司；Labscale 小型切向流超濾系統 美國Millipore 公司；723C 可見分光光度計上海欣茂儀器有限公司；Alpha 1-2 LD plus 冷凍干燥機 德國Christ 公司；3K30 冷凍離心機 德國Sigma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GBP 的制備 采用超聲輔助堿提酸沉法制備銀杏蛋白[18]，考馬斯亮藍法測得純度為84.35%。采用復合風味蛋白酶水解銀杏蛋白制備銀杏肽[9]，酶解工藝流程為：銀杏蛋白→酶解→滅酶→離心分離→超濾膜分離→冷凍干燥→GBP 粉。

1.2.2 Zn-GBP 的制備 取GBP 粉，加適量去離子水溶解，接著加入適量七水硫酸鋅，超聲波混勻（超聲功率100 W，時間3 min），在一定的pH 和溫度條件下螯合一定時間。冷卻至室溫，4500 r/min 離心15 min，取上清液，加入5 倍體積預冷的95%乙醇，4 ℃下醇沉12 h。4500 r/min 離心15 min，收集沉淀，用無水乙醇洗滌沉淀2～3 次，凍干，得到Zn-GBP。

1.2.3 螯合率與螯合物得率的測定 采用《GB 5009.14-2017 食品安全國家標準 食品中鋅的測定》中的二硫腙比色法，測定樣品中鋅的質量。根據鋅的質量，計算螯合率和螯合物得率。

式中：m1為Zn-GBP 中鋅的質量，mg；m2為GBP 中鋅的質量，mg；m3為反應體系鋅的總質量，mg。

式中：m4為生成的螯合物質量，mg；m5為反應物的總質量，mg。

1.2.4 單因素實驗 采用單因素實驗考察肽鋅比（銀杏肽與鋅質量比）、螯合pH、螯合溫度和螯合時間對螯合率及螯合物得率的影響，試驗因素水平如表1所示。每組試驗重復3 次。

表1 單因素實驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.2.5 響應面法優化試驗 在單因素實驗的基礎上，采用響應面法中的Box-Behnken 試驗設計，以螯合率為響應值，設計四因素三水平試驗，因素水平如表2所示。

1.2.6 體外模擬胃腸道消化 采用Sun 等[19]報道的方法，略作修改。參照2015 版《中國藥典》二部附錄中的方法配制人工胃液與人工腸液。人工胃液：取4 mol/L 鹽酸16.4 mL，加雙蒸水約800 mL、胃蛋白酶10 g，混勻，加雙蒸水定容至1000 mL，4 mol/L 鹽酸調pH 至1.2。人工腸液：取0.68 g 磷酸二氫鉀，加50 mL 雙蒸水、7.7 mL 0.2 mol/L 氫氧化鈉，再加入1 g 胰蛋白酶，雙蒸水定容至100 mL，0.2 mol/L氫氧化鈉調pH 至7.2。取50 mg Zn-GBP，加入10 mL人工胃液，混勻后，37 ℃下振蕩水浴2 h。人工胃液消化后，調pH 至7.2 滅活胃蛋白酶，加入10 mL 人工腸液，移入到透析袋（2000 Da）中，37 ℃下振蕩水浴2 h。人工腸液消化后，沸水浴10 min 滅酶。將Zn-GBP 替換為相同質量的硫酸鋅作為陽性對照。

溶解率測定：分別取人工胃液和人工腸液消化后的消化液，10000 r/min 離心15 min。采用《GB 5009.14-2017 食品安全國家標準 食品中鋅的測定》中的二硫腙比色法分別測定上清液中鋅離子和消化液中總鋅質量。根據鋅的質量，計算溶解率。

式中：m6為上清液中鋅離子的質量，mg；m7為消化液中總鋅質量，mg。

滲透率測定：人工腸液消化后，分別取透析袋內外的溶液，采用二硫腙比色法分別測定內外溶液中鋅離子質量。根據鋅離子的質量，計算溶解率。

式中：m8為透析袋外液中鋅離子的質量，mg；m9為透析袋內液中鋅離子的質量，mg。

1.2.7 體外抗氧化活性測定 以DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和還原能力為指標，評價Zn-GBP 的體外抗氧化活性。以GBP 作為組間對照，GSH 作為陽性對照。

1.2.7.1 DPPH 和ABTS+自由基清除能力測定 參照《GB/T 39100-2020 多肽抗氧化性測定 DPPH 和ABTS 法》。

式中：A1為樣品溶液與DPPH 溶液混合液的吸光度；A2為樣品溶液與乙醇溶液混合液的吸光度；A3為DPPH 溶液與樣品試劑溶液混合液的吸光度。

式中：A4為ABTS+溶液與樣品試劑溶液混合液的吸光度；A5為樣品溶液與ABTS+溶液混合液的吸光度。

采用Origin 軟件中的log3p1 模型，對數據進行非線性擬合，得到回歸方程，計算半數有效濃度（half maximal effective concentration, EC50）。

1.2.7.2 還原能力測定 采用Oraiza 報道的鐵氰化鉀法[20]。將2 mL 樣品溶液、2 mL 磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）與2 mL 1% （m/V）鐵氰化鉀溶液混合。樣品溶液50 ℃下孵育20 min 后，在上述反應體系中加入2 mL 10% （m/V）三氯乙酸，混勻，3500 r/min 離心8 min。離心后，取2 mL 上清液依次與0.4 mL 0.1% （m/V）氯化鐵和2 mL 去離子水混合，50 ℃孵育10 min，測定700 nm 處的吸光度。將樣品溶液替換為相同體積的去離子水作為空白對照。

1.3 數據處理

采用SPSS 24.0 軟件進行數據統計與分析；試驗重復三次，結果以平均值±標準差表示。采用新復極差法進行多重比較分析，P＜0.05 表示統計學差異顯著，P＜0.01 表示統計學差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 肽鋅比對螯合率及螯合物得率的影響 如圖1所示，當肽鋅比值由1:1 提高到3:1 時，螯合率及螯合物得率均隨著肽鋅比值的增加而升高，當肽鋅比值高于3:1 時，螯合率及螯合物得率均隨著肽鋅比值的增加而下降。當肽鋅比值較低時，大量鋅離子未參加螯合反應；當肽鋅比值較高時，溶液中產生聚集現象，銀杏肽的利用率不高，螯合物得率下降[21]。綜合考慮螯合率及螯合物得率，選擇較優肽鋅比為3:1。

圖1 銀杏肽與鋅質量比對螯合率及螯合物得率的影響Fig.1 Effect of mass ratio of Ginkgo biloba peptides to zinc on the chelation rate and chelate yield

2.1.2 螯合pH 對螯合率及螯合物得率的影響 圖2為不同螯合pH 對螯合率及螯合物得率的影響。在螯合pH 為6.0～8.0 時，螯合率及螯合物得率均隨螯合pH 的升高而增加，并在螯合pH 為8.0 時達到最大值。在螯合pH 為8.0～10.0 時，螯合率及螯合物得率均隨螯合pH 的升高而降低。螯合pH 過低時，H+與鋅離子爭奪供電子基團，不利于螯合反應的進行；螯合pH 過高時，大量鋅離子與OH-反應生成氫氧化鋅沉淀，導致參與螯合反應的鋅離子減少[21-22]。綜合考慮螯合率及螯合物得率，選擇較優螯合pH為8.0。

圖2 螯合pH 對螯合率及螯合物得率的影響Fig.2 Effect of chelating pH on the chelation rate and chelate yield

2.1.3 螯合溫度對螯合率及螯合物得率的影響 圖3為不同螯合溫度對螯合率及螯合物得率的影響。螯合率及螯合物均隨螯合溫度的升高而先增加后降低，并在螯合溫度為70 ℃時達到最大值。螯合溫度較低時，隨著螯合溫度的升高，反應體系的分子運動加快，增加了銀杏肽與鋅離子的碰撞幾率，螯合率及螯合物得率上升；螯合溫度較高時，隨著螯合溫度的升高，銀杏肽結構可能被破壞，減少了螯合位點，或者生成的肽鋅螯合物結構不穩定[23]。綜合考慮螯合率及螯合物得率，選擇較優螯合溫度為70 ℃。

（52）合葉裂齒苔Odontoschisma denudatum（Dumort.）Dumort. 李粉霞等（2011）

圖3 螯合溫度對螯合率及螯合物得率的影響Fig.3 Effect of chelating temperature on the chelation rate and chelate yield

2.1.4 螯合時間對螯合率及螯合物得率的影響 如圖4 所示，當螯合時間在1.0～2.0 h 時，螯合率及螯合物得率均隨著螯合時間的延長而升高，當螯合時間超過2.0 h 后，螯合率及螯合物得率的增幅均趨于平緩。螯合時間從2.0 h 延長至3.0 h 時，螯合率及螯合物得率增幅趨于平緩。綜合考慮螯合率及螯合物得率，選擇較優螯合時間為2.0 h。

圖4 螯合時間對螯合率及螯合物得率的影響Fig.4 Effect of chelating time on the chelation rate and chelate yield

2.2 響應面法優化結果

以螯合率為響應值，采用Box-Behnken 試驗設計，優化Zn-GBP 的制備工藝參數。Box-Behnken試驗設計及結果如下表3 所示。

表3 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗 利用Design Expert軟件對表3 數據進行多元非線性回歸分析，得到螯合率（Y）與肽鋅比（A）、螯合pH（B）、螯合溫度（C）和螯合時間（D）的二次多項回歸方程：Y=48.06+1.00A+2.66B+1.24C+1.37D-1.78AB+4.01AC+0.20AD-3.80BC+1.06BD-0.47CD-3.97A2-5.64B2-7.88C2-7.03D2。對該回歸方程進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance with regression model

由表4 可知，該模型達極顯著水平（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），校正決定系數R2Adj為0.94，表明該回歸方程具有較高的擬合度和可信度，誤差較小，可用于分析和預測Zn-GBP 的制備工藝。

一次項中，A 的回歸系數顯著（P＜0.05），B、C、D 的回歸系數極顯著（P＜0.01）；二次項的回歸系數均極顯著（P＜0.01）；交互項中，AB 的回歸系數顯著（P＜0.05），AC、BC 的回歸系數極顯著（P＜0.01），表明肽鋅比與螯合溫度、肽鋅比與螯合pH、螯合溫度與螯合pH 等因素間的交互效應對螯合率有顯著影響。

2.2.2 交互效應分析 響應面坡度越陡峭，表明兩因素間的交互效應對螯合率的影響越大。圖5A 為肽鋅比與螯合pH 的交互效應對螯合率的影響。當肽鋅比從2:1 上升到3:1 時，螯合率隨之增加；肽鋅比超過3:1 后，螯合率隨之下降。螯合pH 從7.0 提高到8.0 時，螯合率隨之增加；螯合pH 超過8.0 后，螯合率逐漸下降。圖5B 為肽鋅比與螯合溫度的交互效應對螯合率的影響。當肽鋅比為3:1 左右，螯合溫度為70 ℃左右時，螯合率較高。圖5C 為螯合pH 與螯合溫度的交互作用對螯合率的影響。當螯合pH 處于較低水平時，隨著螯合溫度的增大，螯合率先急劇增加后緩慢降低；當螯合pH 處于較高水平時，隨著螯合溫度的增大，螯合率先緩慢增加后急劇降低。

圖5 交互效應對銀杏肽鋅螯合率的影響Fig.5 Interactive effect on the chelation rate of Ginkgo biloba peptides-zinc

2.2.3 最優提取工藝優化以及驗證試驗 對上述回歸方程求二階偏導，得到Zn-GBP 的最佳制備工藝參數為：肽鋅比3.11:1、螯合pH 8.21、螯合溫度70.51 ℃、螯合時間2.06 h，在此條件下螯合率的理論值為49.50%。為便于實際操作，將最佳工藝參數調整為肽鋅比3:1、螯合pH 8.2、螯合溫度70 ℃、螯合時間2 h。在此修正條件下，實測螯合率為49.23%±0.35%（n=3），與理論值較一致，表明此模型可用于指導生產實踐；在此工藝條件下，螯合物得率為42.34%±0.45%（n=3）。

2.3 體外模擬胃腸道消化分析

圖6為Zn-GBP 與ZnSO4分別經模擬胃腸道消化后的鋅離子溶解率。Zn-GBP 與ZnSO4經人工胃液消化后的鋅離子溶解率分別為99.23%±2.4%和90.86%±2.3%，存在顯著差異（P＜0.05）；經人工腸液消化后的鋅離子溶解率分別為69.47%±2.3%和45.83%±2.1%，亦存在顯著差異（P＜0.05）。Zn-GBP 經人工胃液消化后表現出良好的鋅離子溶解率，原因可能是Zn-GBP 具有良好的穩定性，在胃蛋白酶水解過程中環狀螯合結構未被破壞[24]。Zn-GBP 經人工腸液消化后鋅離子溶解率有一定的降低，可能是因為Zn-GBP 的螯合結構被胰蛋白酶部分水解，游離出的鋅離子在腸液環境中生成氫氧化鋅沉淀[25]。ZnSO4經人工腸液消化后的鋅離子溶解率大幅降低，是因為大量的鋅離子形成了沉淀。

圖6 銀杏肽鋅螯合物與ZnSO4 經模擬胃腸道消化后鋅離子溶解率的比較Fig.6 Comparison of dissolution rates of zinc ions from Zn-GBP and zinc sulfate after in vitro simulated gastrointestinal digestion

圖7為Zn-GBP 與ZnSO4分別經人工腸道消化后的滲透率。Zn-GBP 與ZnSO4經人工腸液消化后的滲透率分別為47.57%±1.8%和23.42%±1.3%，二者存在顯著差異（P＜0.05）。Zn-GBP 的滲透率高于ZnSO4的原因是Zn-GBP 經胃腸道消化后只有部分被降解，可通過透析袋；大多數鋅離子形成了沉淀，無法通過透析袋[21]。綜上，鋅離子溶解率和滲透率結果表明，Zn-GBP 在胃腸道消化過程中具有良好的穩定性，避免了無機鋅鹽在腸道環境中因形成沉淀而導致生物利用率的問題。

圖7 銀杏肽鋅螯合物與ZnSO4 經模擬腸道消化后滲透率的比較Fig.7 Comparison of permeabilities of zinc ions from Zn-GBP and zinc sulfate after in vitro simulated intestinal digestion

2.4 體外抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 受試物對DPPH 自由基清除能力主要依賴于其供氫能力，當DPPH 自由基接受供體提供的氫原子時，奇數電子的氮原子減少，進而導致反應體系的吸光度降低[26]。Zn-GBP和GBP 對DPPH 自由基的清除能力如圖8 所示。由圖可知，在20～1000 mg/L 的質量濃度下，Zn-GBP和GBP 對DPPH 自由基的清除率均隨質量濃度增加而增大；Zn-GBP 對DPPH 自由基的清除率始終高于GBP。在低質量濃度下，Zn-GBP 清除DPPH 自由基能力低于GSH；而當質量濃度高于800 mg/L時，Zn-GBP 對DPPH 自由基的清除能力與GSH 相當。

圖8 銀杏肽鋅螯合物和銀杏肽對DPPH 自由基的清除能力Fig.8 Scavenging effects of Zn-GBP and GBP against DPPH radicals

EC50是評價抗氧化能力的重要指標，EC50越小表明受試樣品的抗氧化能力越強。Zn-GBP、GBP和GSH 清除DPPH 自由基的非線性回歸方程分別為y=-31.12+18.01ln（x-10.65），R2=0.9921；y=-48.28+19.77ln（ x -4.24） ，R2=0.9778； y=3.79+13.20ln（ x -19.38），R2=0.9646。計算得到，Zn-GBP、GBP 和GSH 清除DPPH 自由基的EC50分別為101、148 和52.5 mg/L。由EC50可知，Zn-GBP 清除DPPH 自由基能力高于GBP，但低于GSH。

2.4.2 ABTS+自由基清除能力 ABTS+自由基在734 nm 處有最大吸收峰，加入受試樣品后，如果734 nm 的吸光度降低，則表明受試物具有清除ABTS+自由基能力。圖9 為Zn-GBP 和GBP 對ABTS+自由基的清除能力。由圖可知，在測定的質量濃度下，Zn-GBP 和GBP 對ABTS+自由基的清除率均隨質量濃度增加而增大；Zn-GBP 對ABTS+自由基的清除率始終高于GBP。質量濃度在25～100 mg/L范圍內，Zn-GBP 清除ABTS+自由基能力低于GSH；而當質量濃度高于100 mg/L 時，Zn-GBP 對ABTS+自由基的清除能力始終高于GSH。

圖9 銀杏肽鋅螯合物和銀杏肽對ABTS+自由基的清除能力Fig.9 Scavenging effects of Zn-GBP and GBP against ABTS+radicals

Zn-GBP、GBP 和GSH 清除ABTS+自由基的非線性回歸方程分別為y=-27.08+18.16ln（x-13.97），R2=0.9587；y=-31.79+17.99ln（x-12.93），R2=0.9644；y=10.27+14.26ln（x-17.09），R2=0. 0.9550。計算得到，Zn-GBP、GBP 和GSH 清除DPPH 自由基的EC50分別為83.6、107 和85.5 mg/L。由EC50可知，Zn-GBP 清除ABTS+自由基能力高于GBP 和GSH。

2.4.3 還原能力 采用鐵氰化鉀法測定受試物的還原能力時，如果受試物具有還原能力，則鐵氰化鉀被受試物還原為亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀進一步與三氯化鐵反應生成亞鐵氰化鐵，后者在700 nm 處有最大吸收峰，利用吸光度評價受試物還原能力的強弱。鐵氰化鉀法測定的Zn-GBP 和GBP 的還原能力如圖10 所示。在測定的質量濃度下，Zn-GBP、GBP和GSH 的還原能力均隨著質量濃度的增加而提高。當質量濃度為1 g/L 時，Zn-GBP、GBP 和GSH的還原能力分別為0.386、0.353、0.426；質量濃度為3 g/L 時，Zn-GBP、GBP 和GSH 的還原能力分別為0.971、0.892、1.037。由此可知，Zn-GBP、GBP 和GSH 的還原能力強弱順序為GSH＞Zn-GBP＞GBP。對分光光度法而言，當吸光度大于1.0 時，測量誤差較大，故不再進一步提高待測樣液的質量濃度。

圖10 鐵氰化鉀法測定的銀杏肽鋅螯合物和銀杏肽的還原能力Fig.10 Reduction power of Zn-GBP and GBP determined by potassium ferricyanide method

3 結論

通過單因素試驗及Box-Behnken 試驗設計，獲得了Zn-GBP 的最佳制備工藝參數為銀杏肽與鋅質量比3:1、螯合pH 8.2、螯合溫度70 ℃、螯合時間2 h；在此條件下，螯合率為49.23%±0.35%（n=3），螯合物得率為42.34%±0.45%（n=3）。與無機鋅鹽相比，Zn-GBP 經人工胃液消化后表現出良好的鋅離子溶解率和滲透率，具有較好的生物利用率。Zn-GBP 具有較好的清除DPPH 自由基、清除ABTS+自由基能力和還原能力，且較GBP 有所提高，TOP-2 清除DPPH 和ABTS+自由基的EC50值分別為101 和83.6 mg/L。本研究得到了一種具有良好抗氧化活性且生物利用率較高的Zn-GBP，獲得了該肽鋅螯合物的最佳制備工藝參數，后續將進一步篩選并表征高抗氧化活性的肽段、分析抗氧化作用機制及構效關系。