姜黃素微膠囊的制備及其對小鼠腹瀉干預效果的研究

馮慧渝，許瀛引，張志遠，何曉蘭，郭秀蘭，彭衛紅,

（1.成都大學食品與生物工程學院，四川成都 610106；2.四川省食用菌研究所，四川成都 610066）

姜黃素（Curcumin）是從姜黃根莖中提取出來的一種脂溶性多酚類化合物，呈橙黃色結晶粉末狀，味稍苦[1]。研究發現，姜黃素在抗腫瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基以及保護心血管系統等多方面有廣泛的藥理作用[2-5]。近年來研究還發現姜黃素對腸道黏膜有保護作用[6]，能緩解伊立替康化療導致的遲發性腹瀉及其帶來的腸道損傷[7]。雖然姜黃素具有多種生物活性，但其耐光性、耐熱性、耐鐵離子性較差，易被氧化，穩定性低，且姜黃素屬于脂溶性成分，在水中的溶解度僅有0.6 μg/mL，極大地限制了姜黃素的應用[8]。姜黃素進入人體后，在體內代謝過程極快，很快被排出體外，難以發揮生理功效，導致生物利用度極低[9]。因此尋求一種方法來保護姜黃素，使其免受環境破壞，安全到達指定部位并增加其保留時間，達到緩釋的目的很重要。

微膠囊技術是利用天然或合成的高分子材料對固體、液體或氣體等核心物質進行包埋的技術[10]，由于能起到保護芯材、控制芯材釋放、增強芯材穩定性、提高芯材利用率等作用[11]，已被廣泛應用于醫藥、農藥、食品、化妝品等多個行業領域。采用微膠囊包埋技術可以將姜黃素制備成微膠囊顆粒，不僅可以提高姜黃素在水中的溶解性和產品的穩定性，而且便于儲運、應用范圍也更加廣闊。目前制備微膠囊的方法繁多，其中銳孔法因其設備簡單、操作簡便、投資少，所制得的微膠囊形態和粒徑都較為均一等優勢而備受關注[12]。但使用銳孔法制備姜黃素的研究較少，并且包埋率偏低。劉欣等[13]采用銳孔法以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材制備的姜黃素微囊，包埋率僅為60%，需要改進制備工藝。另外鮮少有 關于姜黃素微膠囊應用于腹瀉的研究，因此探索包埋效果好且能用于腹瀉治療的姜黃素微膠囊配方和制備方法具有應用推廣的研究價值。

本試驗選用姜黃素、海藻酸鈉、海綿膠煤炱菌多糖、吐溫80 和CaCl2為原料，通過銳孔法制備姜黃素微膠囊，以成型效果和包埋率為主要考察指標，通過單因素和正交試驗得到最佳制備工藝，并對制得的微膠囊進行形貌分析。首次采用動物模型探究了姜黃素微膠囊對小鼠腹瀉的干預作用及其機制，為優化姜黃素微膠囊制備工藝及其干預腹瀉的臨床應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素 純度98%，西安圣青生物科技有限公司；吐溫80 廣東潤華化工有限公司；無水氯化鈣、無水乙醇 分析純，成都市科隆化學品有限公司；羧甲基纖維素鈉 食品級，同發食化商行有限公司；番瀉葉 毫州市譙城區康美中藥城；海綿膠煤炱菌由四川省宜賓市竹海鎮提供；ELISA 試劑盒（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10） 江蘇酶免實業有限公司；試劑盒（DAO、D-乳酸、SOD、MDA） 南京建成生物工程研究所；蛋白抽提試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠 體重18～22 g，6～7 周齡，成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（川）2020-030，動物實驗經成都大學倫理委員會批準（批準號20180412）。

B-395 Pro 型微膠囊造粒儀、L-200 Pro 型冷凍干燥機 BUCHI 公司；AH-NANO 型均質機 安拓思納米技術（蘇州）有限公司；WB-2000 型水浴鍋鄭州長城科工貿有限公司；SB-5200DT 型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SPECORD 210 PLUS 型分光光度計 Analytikjena 公司；SD-90 型離子濺射儀 北京博遠微納科技有限公司；FlexSEM 1000 型掃描電鏡 HITACHI 公司；JXFST PRP-CL 型冷凍研磨儀 上海凈信實業發展有限公司；ST16R 型高速冷凍離心機、Micro21R 型高速冷凍離心機、Multiskan GO 型全波長酶標儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海綿膠煤炱菌多糖的制備 將海綿膠煤炱菌鮮樣粉碎，以1:11 的料液比加入純水，然后在100 ℃熱水浴浸提20 min，8000 r/min 離心20 min 收集上清液，添加3 倍上清液體積的98%乙醇，攪拌均勻后靜置過夜，8000 r/min 離心20 min 后收集沉淀物，烘箱40 ℃烘干后得到海綿膠煤炱菌多糖，經硫酸苯酚法檢測多糖含量為92.16%。

1.2.2 微膠囊的制備步驟 a.壁材溶液的配制：稱取一定質量的海藻酸鈉和海綿膠煤炱菌多糖于燒杯中，加入蒸餾水充分攪拌至溶解，在50 ℃恒溫條件下保溫4 h，使海藻酸鈉完全吸水溶脹后備用；b.芯材和壁材混合液的配制：將乳化劑吐溫80 加入壁材溶液中混勻，再稱量一定量的姜黃素固體粉末加入壁材溶液中充分攪拌，在25 ℃條件下超聲2 min 混勻；c.乳液的制備：在4 ℃條件下，將混合液倒入高壓均質機中均質，壓力為330 bar，每100 mL 單次均質5 min；d.凝固液的配制：配制不同質量分數的CaCl2溶液，冷卻到室溫，備用；e.造粒：利用微膠囊造粒儀將乳液緩慢滴入凝固液（CaCl2溶液）中，形成微膠囊。其中凝固液的體積為混合乳液體積的三倍，參數設置分別為噴嘴孔徑200 μm，流速7 mL/min，頻率1200 Hz，電壓700 mV，攪拌速度30%；f.包埋、干燥：將微膠囊在室溫條件下攪拌包埋一定時間，分離出微膠囊，用清水洗去微膠囊表面殘留的CaCl2，置于-50 ℃，0.5 mbar 條件下冷凍干燥72 h，即得姜黃素微膠囊產品。

1.2.3 單因素實驗 單因素實驗在姜黃素質量分數0.3%、海綿膠煤炱菌多糖的質量分數0.15%、海藻酸鈉質量分數1.5%、CaCl2質量分數2.0%、吐溫80 體積分數0.5%、包埋時間1 h 的基礎上，依次變換相應的因素水平來開展實驗。選擇海藻酸鈉質量分數分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；CaCl2質量分數分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；包埋時間分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 h；海綿膠煤炱菌多糖質量分數分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%；姜黃素質量分數分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%；吐溫80 體積分數分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，進行單因素實驗。按上述條件制備姜黃素微膠囊，考察各因素對微膠囊包埋率的影響。

1.2.4 正交優化試驗 在單因素實驗的基礎上，采用正交試驗對姜黃素微膠囊工藝進一步優化，考察A（海藻酸鈉質量分數）、B（姜黃素質量分數）對微膠囊制備的影響，選擇L9（34）正交試驗，因素水平如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

1.2.5 姜黃素的測定

1.2.5.1 姜黃素標準曲線的繪制 參考高鳳苑等[14]方法，稱取10.0 mg 姜黃素置于燒杯中，用無水乙醇溶解后轉移到100 mL 容量瓶中，再用無水乙醇進行定容，得到100 μg/mL 的儲備液。分別移取2、3、4、5、6 mL 儲備液到100 mL 的容量瓶中，用無水乙醇進行定容，制成2～6 μg/mL 系列標準溶液。用無水乙醇做空白對照，分別在425 nm 處測定其吸光度。以濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。姜黃素溶液在425 nm 處的回歸方程為y=0.163x-0.0006，R2=0.9999＞0.99，姜黃素在2～6 μg/mL 范圍內具有可行度和良好的線性關系。

1.2.5.2 樣品中姜黃素的測定 微膠囊產品中總姜黃素含量測定：參考吳玲玲等[15]方法，準確稱取0.01 g姜黃素微膠囊，加入1.5 mL 無水乙醇，放入冷凍研磨機，-20 ℃條件下研磨5 min，使姜黃素微膠囊完全破碎，再加入少量蒸餾水，攪拌，超聲10 min，使姜黃素完全溶解，離心后取上清液。用適量蒸餾水反復洗滌殘渣，過濾收集洗滌液，定容稀釋至合適濃度，用無水乙醇做空白對照，在425 nm 處測定其吸光度，然后根據標準曲線計算姜黃素的含量。

微膠囊產品表面姜黃素含量測定：準確稱取0.01 g 姜黃素微膠囊，加入少量無水乙醇，充分攪拌，使微膠囊表面的姜黃素完全溶解在無水乙醇中，離心后取上清液。用適量無水乙醇反復洗滌殘渣，過濾收集洗滌液，定容稀釋至合適濃度，用無水乙醇做空白對照，在425 nm 處測定其吸光度，然后根據標準曲線計算姜黃素的含量。

1.2.6 微膠囊包埋率的計算 微膠囊包埋率的計算公式為[13]：

式中：ER 為包埋率，W1-為微膠囊產品總姜黃素的質量，W2-為微膠囊產品表面姜黃素的質量。

1.2.7 微膠囊載藥量的測定 微膠囊載藥量計算公式為[16]：

式中：m1-微囊中姜黃素的質量，m2-所稱微囊樣品的質量。

1.2.8 微膠囊的微觀形態觀察 使用掃描電子顯微鏡觀察未包埋姜黃素的空白微膠囊和姜黃素微膠囊的微觀形態。在觀察之前，用金濺射涂覆姜黃素微膠囊30 s，再放入電鏡中觀察，觀察條件設置為20 kV，放大倍數為300 倍。

1.2.9 腹瀉試驗

1.2.9.1 造模試劑制備 番瀉葉煎劑的制備：參考玄靜等[17]的方法稍作調整：取番瀉葉40 g，加水400 mL煎煮2 次，每次20 min，紗布過濾，濾液水浴濃縮至100 mL，即0.4 g·mL-1番瀉葉煎劑，4 ℃保存，用前水浴加熱至25 ℃。

造模劑量設置說明：預實驗中小鼠體重約為22 g，每只灌胃番瀉葉煎劑0.4 mL，該濃度下小鼠腹瀉率為100%，腹瀉指數穩定且無死亡，與未灌胃的正常小鼠腹瀉指數形成顯著差異，以預實驗為依據確定番瀉葉煎劑的小鼠灌胃量為18.18 mL/kg。

姜黃素乳液的制備：取一定量的姜黃素，使用1%羧甲基纖維素鈉溶液配制（除了未進行包埋以外，成分和配制方法與微膠囊一致）為1.028 mg/mL的姜黃素溶液。

姜黃素微膠囊混懸液的制備：取一定量的姜黃素微膠囊，使用1%羧甲基纖維素鈉溶液配制為5、10 mg/mL 的姜黃素微膠囊混懸液。

1.2.9.2 動物分組 40 只小鼠在SPF 環境下適應性飼養7 d，溫度為25 ℃，濕度為60%，光照與黑暗時間各12 h，期間小鼠自由飲食與飲水。隨機分為正常組（Normal）、腹瀉組（Control）、非微膠囊組（Non-Microcap）、低濃度微膠囊組（L-Microcap）、高濃度微膠囊組（H-Microcap），每組8 只。分組說明：根據前期預實驗確定姜黃素微膠囊的灌胃量，以微膠囊載藥量為20.56%計算姜黃素的含量，非微膠囊組和低濃度姜黃素微膠囊組姜黃素含量一致；高濃度姜黃素微膠囊組的姜黃素含量為低濃度姜黃素微膠囊組的姜黃素含量的兩倍，以探究微膠囊的最適使用量。由于使用1%羧甲基纖維素鈉溶液來制備姜黃素微膠囊混懸液，正常組后續灌胃1%羧甲基纖維素鈉溶液作為對照。

1.2.9.3 造模及處理方法 實驗前12 h 禁食不禁水，第1～3 d 除正常組按體重灌胃18.18 mL/kg 的蒸餾水外，其余組每天每只小鼠按體重灌胃18.18 mL/kg 番瀉葉煎劑，期間正常自由飲食。第4～6 d 正常組灌胃18.18 mL/kg 的蒸餾水、其余組小鼠灌胃18.18 mL/kg的番瀉葉煎劑1 h 后，正常組和腹瀉組按體質量灌胃18.18 mL/kg 的羧甲基纖維素鈉，非微膠組按體質量灌胃18.18 mL/kg 姜黃素乳液，微膠囊組小鼠按體重灌胃18.18 mL/kg 微膠囊混懸液。灌胃結束后，把小鼠置于有墊紙的小鼠籠內，每籠1 只，每隔1 h 換一次墊紙，連續觀察6 h。6 h 內觀察糞便，不成形或稀便且濾紙上有污跡者，視為造模成功。以稀便率（LSIR）、稀便級（ALSG）、腹瀉指數（DI）、腹瀉率為腹瀉指標，觀察并記錄連續6 h 內各小鼠的總排便次數、稀便數、稀便級、小鼠腹瀉數，統計相關腹瀉指標。

1.2.9.4 指標測定 觀察指標：參考文獻[18]。a.腹瀉率：一組動物中排稀便的動物數與該組動物總數之百分比。b.稀便率（LSIR）：每只動物所排的稀便數與總便數之比。c.稀便級（ALSG）：表示稀便的程度，以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級，分為4 級，標準表2。統計時先逐個統計每一堆稀便的級數，然后將該鼠所有稀便級數相加除以稀便次數得稀便的平均級數，簡稱稀便級。d.腹瀉指數（DI）：稀便率與稀便級的乘積。

表2 稀便等級表Table 2 Loose stool scale

檢測指標：第6 d 最后一次觀察結束后，立即將小鼠麻醉處死后腹腔動脈取血，將全血4 ℃靜置30 min 后，3000 r/min，4 ℃離心10 min，上清即為血清，4 ℃保存，用于炎癥指標IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、DAO、D-乳酸檢測，具體檢測方法參照試劑盒說明書。將小鼠空腸取出后按重量1:9 加緩沖液進行勻漿，用于檢測SOD 和MDA，具體檢測方法參照試劑盒說明書。采用碧云天蛋白抽提試劑盒對空腸蛋白抽提，通過BCA 濃度測定后用于Western blot 測定。取蛋白上樣進行SDS-PAGE 電泳，電泳結束后隨即轉膜（濕轉），洗滌，染色脫色、洗滌、孵育一抗、二抗、洗滌、曝光顯影等步驟，得到蛋白p-Nrf2、HO-1、NQO1、Keap1、Occludin、Claudin-1、ZO-2、TRL4、IRAK1、Myd88、TRAF6、NF-κB 相對表達量。

1.3 數據處理

使用 SPSS 22.0、Origin 2018 和 Excel 2016 等對試驗數據進行分析，每組實驗三次平行，實驗數據表示為均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 海藻酸鈉質量分數對微膠囊化效果的影響由圖1A 可知，隨著海藻酸鈉濃度的增加，溶液的粘稠度增加，形成的微囊硬度變大，包埋率呈上升趨勢，當海藻酸鈉濃度達到1.5%以后緩慢增加。在實際操作中，海藻酸鈉濃度低于1.5%時，形成的微囊質地軟、流動性大、容易破裂，凍干后呈塊狀粘連嚴重，無法形成單獨的微膠囊顆粒。海藻酸鈉濃度大于2.0%，儀器造粒較困難，濃度大于2.5%，無法通過銳孔，不能造粒。所以后續正交試驗海藻酸鈉濃度選擇1.5%、2.0%、2.5%作為試驗水平。

圖1 各因素對包埋率的影響Fig.1 Effects of various factors on microencapsulation efficiency

2.1.2 CaCl2質量分數對微膠囊化效果的影響 由圖1B 可知，當CaCl2濃度小于1%時，鈣離子與海藻酸鈉交聯反應不完全、影響了微膠囊的形成，導致包埋率偏低。隨著氯化鈣濃度的增加，包埋率呈上升趨勢，濃度達到1.0%以后緩慢增加，到達2.0%以后基本保持穩定。當CaCl2濃度大于2%時，微囊膜增厚且顆粒增大，并且成品有澀味。最終確定CaCl2質量分數為2.0%，在正交試驗中不再將其列為試驗因素。

2.1.3 包埋時間對微膠囊化效果的影響 由圖1C可知，當包埋時間小于0.5 h 時，鈣離子與海藻酸鈉還未充分發生交聯反應，導致包埋率偏低。隨著包埋時間的增加，包埋率呈上升趨勢，到達1.5 h 以后基本保持穩定。由于對包埋率影響不明顯，且為保證制備效率，最終確定包埋時間為1.5 h，在正交試驗中不再將其列為試驗因素。

2.1.4 海綿膠煤炱菌多糖質量分數對微膠囊化效果的影響 由圖1D 可知，隨著多糖濃度的增加，包埋率呈現先下降后上升的趨勢，當多糖濃度為0.15%時，包埋率大于未添加多糖的包埋率。并且隨著多糖濃度的增加，溶液黏度增大，濃度大于0.15%時，儀器造粒困難，因此在實際操作中選擇0.15%為最終濃度，在正交試驗中不再將其列為試驗因素。

2.1.5 姜黃素質量分數對微膠囊化效果的影響 由圖1E 可知，隨著芯材含量的增加，包埋率也隨之增加。當姜黃素含量在0.3%左右時，微膠囊的成型效果和包埋率都較好。此后，由于芯材增加，通過濕微膠囊狀態在體視顯微鏡下觀察到芯材逐漸充滿微膠囊內部，壁材不能將姜黃素完全包埋，部分姜黃素暴露在壁材表面，且壁材在溶液中所占百分比的減少使得形成的微膠囊膜較薄，質地硬度有所下降，不能包埋內部的姜黃素，導致包埋率明顯下降。綜上所述，姜黃素濃度在0.2%～0.4%范圍內較適宜。

2.1.6 吐溫80 體積分數對微膠囊化效果的影響 姜黃素為脂溶性物質，加入乳化劑吐溫80 以后，能使姜黃素溶于壁材溶液中形成混合乳液，并且能使微膠囊造粒相對容易。由圖1F 可知，吐溫80 的添加量為0.3%時，包埋率達到最高，0.5%以后基本持平，由于對包埋率影響不明顯，在正交試驗中不再將其列為試驗因素。

2.2 正交優化試驗

根據單因素實驗結果，確定包埋時間為1.5 h、CaCl2質量分數2.0%、海綿膠煤炱菌多糖質量分數0.15%、吐溫80 體積分數0.3%，采用正交試驗對姜黃素微膠囊工藝進一步優化，考察 A（海藻酸鈉質量分數）、B（姜黃素質量分數）對微膠囊包埋率的影響，設計L9（34）正交試驗。正交試驗結果及極差分析見表3。

表3 正交試驗結果及極差分析Table 3 Orthogonal experiment results and analysis of range

由表3 可知，A3B3組的包埋率最高，為92.26%。RB（2.43）＞RA（2.39），各因素對制備姜黃素微膠囊包埋率影響的主次順序為：B＞A，即姜黃素質量分數＞海藻酸鈉質量分數。且各因素R 值均大于空列R 值，表示各因素水平效應存在差異，該模型可信。由K 值大小判斷銳孔法制備姜黃素微膠囊的最佳工藝條件組合為：A3B3。

所以制備姜黃素微膠囊的最佳條件是：海藻酸鈉濃度2.5%，姜黃素質量分數0.4%，包埋時間為1.5 h、CaCl2質量分數2.0%、海綿膠煤炱菌多糖質量分數0.15%、吐溫80 體積分數0.3%，此時產品包埋率可達92.26%，載藥量為20.56%，且該條件下微膠囊易成型，質地較硬，制備效果好。

2.3 微膠囊的形態表征

由圖2 可知，制備出的姜黃素微膠囊產品結構完整，表面凹凸不平，顆粒飽滿，多數呈球形，表面的褶皺是銳孔法微膠囊的特征，主要是因為干燥后失去水分造成聚縮[19]。而未包埋姜黃素的空白微膠囊表面結構致密，無凸起，較扁平，與包埋姜黃素的微膠囊形態形成鮮明對比，表明該法能夠有效將姜黃素進行包埋。

圖2 微膠囊干燥后的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of posterior drying microcapsules

2.4 姜黃素微膠囊降低小鼠腹瀉指數

經番瀉葉灌胃后，腹瀉組、非微膠囊組、低濃度微膠囊組、高濃度微膠囊組小鼠均出現穩定的腹瀉現象，腹瀉率與正常組形成明顯差異，說明造模成功。由表4 可知，隨著時間推移小鼠的腹瀉指數逐步下降可能是因為小鼠機體漸漸適應了番瀉葉的刺激。非膠囊組小鼠雖然腹瀉指數逐步下降，從75.03±7.79 下降至50.09±7.91，但與腹瀉組相比不構成顯著差異（P＞0.05），說明非膠囊組處理無法有效干預腹瀉。灌胃微膠囊后，小鼠腹瀉均呈現顯著下降趨勢（P＜0.05），至第6 d 時，低濃度微膠囊組腹瀉指數降至51.62±6.89，高濃度微膠囊組小鼠腹瀉指數下降至41.71±6.09，其中高濃度微膠囊組小鼠腹瀉指數下降更明顯，說明微膠囊工藝使得各組分聯合作用能夠達到干預小鼠腹瀉的目的，且高劑量組效果更好。

表4 藥物干預后五組小鼠腹瀉指數（DI）及腹瀉率變化Table 4 Changes of diarrhea index (DI) and diarrhea rate in five groups of mice after drug intervention

2.5 姜黃素微膠囊提高腹瀉小鼠抗氧化能力

檢測小鼠腸組織勻漿中SOD 活力和MDA 含量，SOD 活力的高低間接反映機體清除氧自由基的能力，而MDA 的高低間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[20]。由表5 可知，小鼠腹瀉后，SOD 活力顯著下降（P＜0.05），機體脂質過氧化程度加深，MDA 含量升高，說明機體清除自由基能力下降。經非微膠囊組和微膠囊組分別處理后，機體清除自由基能力有不同程度提升，其中，高濃度微膠囊提升程度最高，SOD 含量提升至9.24±0.97 U/mgprot，MDA降至5.41±0.65 nmol/mgprot，其次是低濃度微膠囊和非微膠囊組。相比非微膠囊組，經過微膠囊包埋工藝后，姜黃素乳液的抗氧化能力明顯上升。雖然進行干預治療后非微膠囊組、低濃度微膠囊組、高濃度微膠囊組小鼠抗氧化能力未能恢復至正常組小鼠水平，但相比于腹瀉組小鼠機體清除自由基能力已產生大幅度回升。

表5 小鼠腸組織SOD 和MDA 值Table 5 Value of SOD and MDA in intestinal tissue of mice

2.6 姜黃素微膠囊提高腹瀉小鼠抗炎癥能力

細胞因子是腸道免疫調控中的關鍵信號，包括促炎因子和抗炎因子。關鍵的促炎因子是白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）。抗炎因子白介素10（IL-10）參與炎癥和免疫抑制[21-22]。小鼠腹瀉后，由圖3 可知，血清中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α分別顯著升高至114.07±6.55、75.71±2.44、900.58±45.33 pg/mL（P＜0.05），抗炎因子IL-10 顯著下降至919.46±124.40 pg/mL（P＜0.05），說明腹瀉引起了機體炎癥反應（圖3D）。非微膠囊組血清中促炎因子IL-6 和IL-1β下降可能與樣品成分中含有抗炎作用的姜黃素和海綿膠煤炱菌多糖有關。高劑量組微膠囊灌胃后小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α分別顯著降低至79.71±6.10、56.27±5.83、596.98±43.17pg/mL（P＜0.05），IL-10 顯著升高至1147.75±124.68 pg/mL（P＜0.05），表明高劑量微膠囊能夠有效降低機體炎癥指標。

圖3 小鼠血清中炎癥指標Fig.3 Inflammatory indicators in mice serum

2.7 姜黃素微膠囊對腹瀉小鼠腸道屏障的保護作用

一定程度腹瀉會影響腸粘膜屏障功能，血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-Lactate）水平能夠有效評價腸道功能損傷情況，反映腸機械屏障功能，DAO 和D-乳酸血清中含量越高，腸道功能損傷情況越嚴重[23]。經腹瀉造模后，腹瀉組小鼠與正常組小鼠相比，血清DAO 含量顯著上升至72.25±4.15 U/L（P＜0.05），說明腹瀉已經一定程度損傷了小鼠腸道屏障（圖4A），高劑量的微膠囊有效抑制了DAO 在血清中釋放，DAO 顯著降至48.82±5.69 U/L（P＜0.05），緩解小鼠腸道屏障損傷。由于血清中D-乳酸是由腸道菌群無氧代謝葡萄糖形成的，除了腸道屏障受損影響血清中D-乳酸含量之外，腸道菌群的微生態平衡也影響D-乳酸含量[24]。血清中D-乳酸含量在各個實驗組間并沒有產生顯著差異（P＞0.05）（圖4B），這可能跟小鼠腸道菌群狀態有關，因此無法直接說明腸道屏障是否受損。

圖4 小鼠腸道屏障功能指標Fig.4 Index of intestinal barrier function in mice

2.8 姜黃素微膠囊對腹瀉小鼠的干預機制

機體為了控制活性氧誘導自由基鏈反應，形成了一套復雜的抗氧化防御體系，其中包括核因子NFE2 相關因子（Nuclear factor-erythroid 2-related factor2，Nrf2）[25]。小鼠腹瀉后，p-Nrf2 表達下調，經過高劑量微膠囊灌胃后能夠顯著恢復小鼠p-Nrf2 表達活性（P＜0.05）（圖5B），結合SOD 和MDA 結果，高劑量微膠囊提升機體抗氧化能力的效果最好，證明了高劑量微膠囊通過上調Nrf2 蛋白表達提升機體氧化應激能力的作用。醌氧化還原酶1（NAD（P）HN:quinone oxidoreductase 1，NQO1）通過維持泛醌和α-生育酚醌的還原形式保護內源性抗氧化劑，而Nrf2 是NQO1表達的中心控制因子[26]。血紅素氧合酶1（Heme Oxygenase-1，HO-1）主要催化血紅素分解，位于Nrf2下游，是一種重要的抗氧化酶[27]。各實驗組對蛋白NQO1 和HO-1 沒有顯著影響（P＞0.05）可能是由于此類腹瀉模型與灌胃樣品不通過醌類和催化血紅素影響抗氧化作用（圖5C、圖5E）。Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap）可與Nrf2 結合從而負調控Nrf2 轉錄活性[28]。各實驗組對蛋白Keap-1 沒有顯著影響（P＞0.05），可能是因為Keap1 只是Nrf2 的結合位點之一，微膠囊樣品可能通過其他結合方式激活Nrf2 調節機體氧化應激功能，還需進一步實驗探究（圖5D）。

圖5 小鼠腸道Nrf2 信號通路相關蛋白表達豐度Fig.5 Abundances of the intestinal Nrf2 signaling pathway-related proteins in mice

腸道氧化應激會通過多種途徑破壞腸上皮細胞間的緊密連接狀態，導致腸上皮屏障功能受損和腸道通透性增加，提升氧化應激能力也是維持機體腸道屏障的重要途徑[29]。緊密連接蛋白是腸道機械屏障的基礎結構，包括跨膜蛋白Occludin 和Claudin，以及細胞質蛋白ZO-2 等，用于維持腸道細胞旁通透性，防止大分子有毒物質通過細胞旁連接入侵機體[30-31]。小鼠腹瀉后，ZO-2 表達顯著下降（P＜0.05），經非微膠囊和微膠囊樣品灌胃后，ZO-2 表達量有效回復，說明非微膠囊和微膠囊樣品成分對緊密連接蛋白均能起一定作用（圖6C）。實驗組對跨膜蛋白occludin 和claudin沒有顯著作用（P＞0.05）（圖6A、圖6B），可能是因為番瀉葉誘導的腹瀉模型主要細胞內緊密連接蛋白ZO-2 起作用，姜黃素微膠囊也是通過細胞內ZO-2 起到恢復腸道屏障的作用[32]。結合高劑量微膠囊對DAO的抑制作用，表明高劑量微膠囊能一定程度改善小鼠腸道細胞質緊密連接蛋白，干預DAO 釋放至血清。

圖6 小鼠腸組織緊密連接蛋白表達豐度Fig.6 Abundances of the intestinal tight junction proteins in mice

Toll 樣受體4（TLR4）在腸道中可特異性識別病原體相關分子模式和損傷相關分子模式[33]。MyD88、IRAK1、TRAF6、p-NF-κB 是TLR4 信號通路下游分子，其中NF-κB 是調控促炎因子產生的重要核轉錄因子[34]。小鼠腹瀉后TLR4 和p-NF-κB 表達顯著上調（P＜0.05），高濃度微膠囊有效降低TLR4、MyD88、p-NF-κB 表達活性（圖7），這與炎癥指標檢測結果一致，而實驗組對IRAK1 和TRAF6 沒有顯著作用（P＞0.05），表明微膠囊樣品是通過TLR4/NF-κB 通路抑制炎癥因子釋放，調控腹瀉小鼠炎癥反應。

圖7 小鼠腸組織Toll 樣受體4（TRL4）信號通路相關蛋白表達豐度Fig.7 Abundances of the intestinal Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway-related proteins in mice

3 結論

本研究采用單因素變量法結合正交試驗確定了銳孔法制備姜黃素微膠囊的最佳工藝條件，海藻酸鈉、海綿膠煤炱菌多糖、姜黃素、吐溫80、CaCl2濃度分別為2.5%、0.15%、0.4%、0.3%、2.0%，包埋時間1.5 h，此條件下制備的姜黃素微膠囊包埋率高達92.26%。制備出的姜黃素微膠囊產品結構完整，顆粒飽滿。

采用灌胃番瀉葉誘導的腹瀉小鼠模型來檢測姜黃素微膠囊的作用效果。試驗結果表明工藝優化后的姜黃素微膠囊能通過TRL4/NF-κB 通路提升機體氧化應激能力，降低促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6 并促進抗炎因子IL-10 釋放；通過Nrf2 信號通路提升小鼠腸道抗氧化性，促進超氧化物歧化酶SOD 生成，抑制丙二醛MDA 生成；最終在抗氧化和抗炎的共同作用下維持小鼠腸道屏障，降低小鼠腹瀉指數，緩解小鼠腹瀉程度，證實了姜黃素微膠囊干預小鼠腹瀉的效果，并研究了微膠囊的作用機理，為姜黃素微膠囊干預腹瀉制劑的推廣應用奠定了理論基礎。