基于高分辨質譜的darobactin的結構解析策略

張含智?田振華?羅煜?秦東光?郭鋒

摘要：目的 Darobactin（達羅巴汀）是一類經核糖體合成的翻譯后修飾肽，該七肽具有獨特的稠和雙環結構，本研究建立了系統的基于高分辨質譜的darobactin組分的結構解析策略。方法 依據文獻中報道的在高能碰撞裂解（HCD）和碰撞誘導裂解（CID）模式下獲得的一級及二級高分辨質譜數據，以碎片離子結構式的方式呈現了darobactin A的裂解途徑，并修正了文獻中部分碎片離子結構和質荷比的錯誤。針對特殊的雙環結構，本文提出了基于生物合成路徑的“逆向裂解途徑”來確證1位和3位色氨酸之間因醚鍵斷裂而生成的特征離子，并首次解析出包含特殊碳碳鍵的色氨酸-賴氨酸的碎片離子，為判斷5位色氨酸被其他氨基酸（如精氨酸）取代提供了直接證據。結果 建立了系統的darobactin A的結構解析策略，并以darobactin B/D/E的碎片離子加以驗證，從理論上推導了其他darobacitn組分如C和F的特征離子。結論 本文為快速判定darobactin新組分及其前體肽的結構提供了研究基礎。

關鍵詞：Darobactin A；雙環七肽；高分辨質譜；結構解析策略；逆向裂解途徑

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Structural analysis strategy of darobactins based on high resolution

mass spectrometry

Zhang Han-zhi， Tian Zhen-hua， Luo Yu， Qin Dong-guang， and Guo Feng

（Abiochem Biotechnology Co.， Ltd， Shanghai 200241）

Abstract? ? Objective Darobactin， which is a heptapeptide with unique condensed and bicyclic scaffold， belongs to a class of post-translational modified peptide synthesized by ribosome. In this study， a systematic structure analysis strategy for darobactin components based on high-resolution mass spectrometry was established. Methods Based on the m/z of adduct ions and fragment ions obtained in HCD and CID modes reported in the literature， a systematic structural analysis strategy based on high-resolution tandem mass spectrometry was established. The fragmentation pathway of darobactin A is presented in the form of fragment ions' structures. The errors in the structure and m/z of some fragment ions in the literature were corrected. It is proposed an idea of “reversed fragmentation pathway” based on the biosynthetic pathway to confirm the characteristic ions formed by the C-O-C bond breaking between tryptophan1 and tryptophan3 of the special bicyclic scaffold. Besides， the fragment ions of tryptophan3-lysine5 residue containing special C-C bond were characterized for the first time， providing direct evidence for judging whether tryptophan5 is replaced by other amino acids （such as arginine）. Results The established structural analysis strategy can be reasonably used to determine the structure of known darobactin components （such as B/D/E）， and can predict the fragment ions of homologous components （such as darobactin C/F， no MS/MS is given in the references）. Conclusion This study provides a resolution for rapid determination of the structure of new components of darobactin and its precursor peptides.

Key words Darobactin A; Bicyclic heptapeptide; High resolution MS/MS; Structural analysis strategy; Reversed fragmentation pathway

多重耐藥性的出現是全球公共衛生面臨的主要威脅之一，2017年，世界衛生組織公布了一份耐藥菌清單，其中耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬等革蘭陰性菌被確定為“I級優先”要被迫切解決的病原菌[1]。針對如上病原菌感染，多黏菌素B/E具有較好的臨床治療效果，在一定程度上被稱為“最后一道防線”，然而隨著該類藥物的使用量加大，也出現了耐藥菌[2]。發現新型抗生素來應對耐藥菌危機迫在眉睫，基于對細菌基因組和天然產物生物合成基因簇的了解不斷增加，挖掘尚未被利用的天然菌群可能是尋找具有新型骨架和作用模式的抗生素的一個富有成效的策略[3]。美國東北大學Kim Lewis團隊[3]在線蟲共生菌Photorhabdus khanii分離株中發現了一種新型抗生素darobactin（達羅巴?。?，darobactin屬于核糖體合成的翻譯后修飾肽，主要組分darobactin A的氨基酸序列為色氨酸1（Trp）-天冬酰胺2（Asn）-色氨酸3-絲氨酸4（Ser）-賴氨酸5（Lys）-絲氨酸6-苯丙氨酸7（Phe），結構式見圖1所示，氨基酸之間除了以常見的酰胺鍵連接之外，還具有獨特的稠和雙環結構。Darobactin A的Trp1吲哚環7位與Trp3-β位碳之間形成醚（C-O-C）鍵，Trp3吲哚環6位與Lys5-β碳之間形成碳碳（C-C）鍵，Trp3–Lys5之間非活化位點的C-C鍵是比較罕見的[4]。張琪等[5]通過H218O插入實驗發現和驗證了DarE這種S-腺苷甲硫氨酸酶（rSAM）經自由基歷程催化形成了C-O-C鍵及C-C鍵。Darobactin A具有優異的抗菌活性，對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等一系列革蘭陰性菌（包括多黏菌素、碳青霉烯和β-內酰胺的耐藥菌）均展示出強力的抗菌活性（MIC=2 mg/mL）[4]。這是因為darobactin具有全新的作用機制，以細菌外膜的插入酶（insertase）BamA為靶點，雙環骨架采用剛性β-鏈構象與BamA結合，破壞細菌外膜誘導細胞裂解，最終導致細菌死亡[6]。

在darobactin A的結構確認中，Lewis等[4]從發酵液中經陽離子交換色譜純化了darobactin A，采用高分辨質譜并通過高能碰撞裂解串聯質譜（HCD-MS/MS）獲得了darobactin A的分子量和二級碎片離子，但并未對特征離子（特別是雙環部分的離子）進行歸屬，主要通過氫譜、碳譜、H-C相關譜及COSY譜、ROESY譜確定了其結構，經ROESY譜確定了Trp3-β位碳為R構型，Lys5-β位碳為S構型。除darobactin A外，Lewis等[4]還在Photorhabdus菌中發現了darobactin B（4位為蘇氨酸，Thr；6位為精氨酸，Arg），在Yersinia菌中發現了darobacitn C（2位為Ser，5位為Arg）/D（5位為Arg）/E（2位為Ser），它們之間具有較高序列同源性，結構式見圖1，與darobactin A有區別的氨基酸殘基以紅顏色標示。張琪等[5]對darobactin A前體肽DarApk（43-58）-1、darobactin D前體肽DarAyi（55-66）-1的b/y離子進行了解析，但并未解析雙環部分的特征離子，而是以（b/y+12 Da）代表形成了雙環結構。B?hringer等[7]又通過異源表達的途徑產生了darobactin F[2位為Lys，6位為Asn，7位為亮氨酸（Leu）]，以碰撞誘導裂解（CID）獲得了darobactin A/B/D/E的串聯質譜數據，并以折線斷鍵的方式在如上組分的結構式上對碎片離子進行了歸屬，但由于darobactin獨特的雙環結構，這種方式并不直觀，且存在誤判碎片離子結構的風險；另外與Lewis等[4]的結果比較，其特征離子較少，如未獲得關鍵性的Trp3-Lys5碎片離子。高分辨串聯質譜可以提供詳細、準確的結構信息，在同源多肽類化合物的結構鑒定中發揮了重要作用[8]。假設能對雙環部分的特征離子進行確認，那么對于darobactin A及其同源化合物的結構確認將起到事半功倍的效果。

本實驗室在前期建立了基于高效液相色譜-高分辨串聯質譜的多肽類抗生素的結構解析策略，已成功解析了不飽和多黏菌素、磺酸化桿菌肽、共軛雙鍵化替考拉寧等多個新組分，這種解析思路同樣適用于darobactin組分的結構分析[9-11]。但darobactin具有的特異性的雙環結構又使得對其結構解析具有很大的挑戰。由于無法得到darobactin的實際樣本，本文參考Lewis[4]和B?hringer等[7]的MS/MS圖，借鑒自由基關環的生物合成路徑，提出了“逆向裂解途徑”的解析機理，合理解析了雙環部分的特征離子，建立了一級及二級高分辨質譜數據的系統的darobactin A的結構解析策略，并以B/D/E的碎片離子加以驗證，從理論上推導了其他darobacitn組分如C和F的特征離子。本文為快速判定darobactin新組分及其前體肽的結構提供了研究基礎。

1 儀器與試藥

由于在國內尚未收集到darobactin組分，本文綜合依據Lewis[4]和B?hringer等[7]提供的darobactin組分的MS/MS圖建立結構解析策略，前者選擇的儀器為配有電噴霧（ESI）離子源的Q Exactive Hybrid Quadrupole 質譜儀（美國Thermo Scientific公司），后者使用的儀器為1290 UPLC（美國Agilent公司）-microOTOFQ 質譜儀（德國Bruker Daltonics公司）。

Darobactin A由Photorhabdus khanii菌發酵產生并經XAD16N樹脂、陽離子交換色譜純化得到[4]。B?hringer等[7]在大腸埃希菌中異源表達產生了darobactin A-F組分，并經反相色譜或快速柱色譜（flash chromatography）分別純化了darobactin A/B和D/E組分，并給出了以上4種組分的MS/MS譜圖。

2 方法

2.1 儀器方法

根據文獻[4]描述，darobactin A溶于含有0.1%甲酸的水溶液中，直接進樣流速為5 mL/min；質譜選擇正離子掃描模式，噴霧電壓為1.50 kV，噴霧電流為50 μA，毛細管溫度為125℃，不使用鞘氣，輔助氣設置為2；MS/MS采用HCD模式，碰撞能量為55 eV。

根據文獻[7]描述，色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱（1.7 mm，2.1 mm×100 mm），柱溫設置為45℃，流動相A：含0.1%甲酸的水溶液，流動相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液，流速為0.6 mL/min，梯度洗脫條件：0 min： 95%A; 0.80 min： 95%A; 18.70 min： 4.75%A; 18.80 min： 0%A; 23.00 min： 0%A; 23.10 min： 95%A; 25.00 min： 95%A。質譜選擇正離子掃描模式，MS采集范圍m/z 100～1500，Auto MS/MS采用CID模式，在m/z 100～1000范圍內，雙電荷離子碰撞能量設置為15～32 eV，單電荷離子碰撞能量設置為18～45 eV。

2.2 結構解析策略

Lewis等[4]提供了darobactin A在HCD模式下的實測值（observed adduct ions）如下：單/雙電荷離子峰分別為m/z 966.4105 [M+H]+、m/z 483.7086 [M+2H]2+，與理論計算值（calculated adduct ion，m/z 966.4104[M+H]+，m/z 483.7089 [M+2H]2+基本一致，見表1。Darobactin B-F未提供實測值，它們的單/雙電荷離子峰（理論計算值）均展示在表1中[7]，其中雙電荷離子分別為m/z 525.2512、m/z 484.2065、m/z 497.7119、m/z

470.2034和m/z 487.2482 [M+2H]2+。由于Lewis[4]和B?hringer等[7]分別采用了HCD和CID兩種碎裂方式，darobactin組分的特征離子見表1所示，兩種裂解方式得到的碎片離子并不完全一致，可以相互驗證和補充；Lewis未放大低m/z區間（小于200）的圖譜，故低端m/z信息量較少。從表1中可以看出，HCD得到更豐富的碎片離子信息，以此為基礎并輔以CID獲得的低端m/z確定了darobactin A的裂解規律。B?hringer等[7]還給出了darobactin B/D/E的MS/MS圖，驗證了如上裂解規律的正確性，并為預測darobactin C和F的碎片離子提供了依據。

綜合以上信息，建立darobactin組分的結構解析策略：①獲得darobactin組分的高分辨一級質譜實測值，若與已知組分的分子量相同，且與理論計算數值（可通過結構式畫圖軟件獲得該數值，如KingDraw 軟件）相同，可初步判斷為該已知組分或其同分異構體。②獲得darobactin組分的二級質譜圖，無論一級質譜數據是否與已知組分相同，均可與darobactin A裂解途徑中的特征碎片離子進行比較，判斷哪個位點的氨基酸發生改變。如通過y2、y1離子確定側鏈結構；通過b2、b1、a1、（y5-y2）及其脫NH3、脫CO或脫H2O等離子確認雙環部分的結構；特別是Trp3-Lys5（darobactin A）的特征離子如m/z 228.1595可用于判斷5位氨基酸。需注意的是，碎片離子的實測值與理論值應基本一致，如文獻[7]中，誤差小于2 ppm。③結合darobactin組分的生物合成路徑，生成Trp1和Trp3之間的醚鍵經歷了雙鍵化Trp3的中間體過程，則在二級質譜碎裂過程中可經歷“逆向裂解途徑”也會產生具有雙鍵Trp3的特征離子。④結合一級、二級高分辨質譜數據，并與理論計算數值比較，共同確定darobactin組分的結構。

3 結果與討論

3.1 Darobactin A的結構解析策略

通過比較Lewis[4]和B?hringer等[7]提供的darobactin A碎片離子的實驗m/z數值和理論m/z數值，見表1，兩組數據是基本吻合的，誤差在0.1～1.8 ppm范圍內，本文采用碎片離子的理論m/z數值來建立結構解析策略。歸屬線性多肽的碎片離子時，經常采用折線斷鍵的方式標示b/y離子[5]，但這種方式并不能準確展示環狀多肽或者通過重排方式形成的特征離子，如磺酸化桿菌肽經SO3中性丟失及氫轉移后形成的烯基化離子[10]，B?hringer等[7]把m/z 650.2929歸屬為y5+NH3環狀離子應是不恰當的。鑒于此，本文以化學結構式的方式呈現碎片離子并合理解釋離子的產生途徑，建立了結合HCD及CID模式的基于高分辨一級及二級質譜數據的darobactin A的結構解析策略，在“2.2”項下已有所表述。在本節中，對darobactin A的裂解規律（見圖2）進行詳細闡述，通過比較表1，在HCD和CID模式下較易碎裂產生b/y離子及脫氨基離子等，如b6（m/z 801.3315）、b5（m/z 714.2994）、y2（m/z 253.1183）、y1（m/z 166.0863）及a1（m/z 175.0866）；Darobactin上的Trp1容易失去一分子NH3得到具有共軛結構的碎片離子，如脫氨基darobactin A離子（m/z 949.3839）、b6-NH3（m/z 784.3049）、b5-NH3（m/z 697.2729）。Trp1-Trp3發生四元環重排及氫轉移從而斷裂C-O-C醚鍵而產生特征共軛結構離子y5-H2（m/z 650.2933），此過程可能為自由基SAM催化形成醚鍵的逆反應，稱之為“逆向裂解途徑”，見圖2中所示，隨后會依次失去Phe7、Ser6及1分子H2O得到特征離子y5-y1-H2（m/z?485.2143）、y5-y2-H2（m/z 398.1823）和y5-y1-H2-H2O（m/z 380.1717）。另外，m/z 650.2933也可能是具有Trp3-β位碳正離子結構的離子。Trp1-Trp3醚鍵斷裂的同時可能伴生著Asn2-Trp3酰胺鍵的斷裂從而形成b2-NH3（m/z 300.0979），并繼而形成b1-NH3（m/z 186.0550）。在CID模式下，可以明顯觀察到離子m/z 160.0757，推測是Trp1殘基失去1分子CO和NH3及H轉移至α位后形成的離子，B?hringer等[7]通過折線方式呈現該離子的結構應是不正確的。

整體比較而言，HCD得到的離子信息較為全面，并且在高能碰撞下還可以得到C-C鍵斷裂的離子，如a1丟失一分子亞甲胺得到吲哚亞甲基正離子m/z 146.0600，推測具有共軛結構的吲哚環穩定了該正離子。借鑒離子m/z 146.0600的結構，在HCD-MS/MS譜中發現并推導了碎片離子m/z 228.1495的結構，采用常規的斷裂酰胺鍵、連接雜原子的鍵或重排反應均無法得到合理的結構，推測可能與Trp3-Lys5相關。Darobactin A-NH3斷裂失去（Ser4+y2）后得到離子b5-NH3-Ser4（m/z 611.2481），繼續丟失Lys5殘基上的CO并經Trp3-β位碳上的氫轉移得到離子m/z 582.2459，Trp1-Trp3之間的醚鍵發生斷裂得到Trp3-Lys5殘基的特征吲哚亞甲基正離子m/z 228.1595或與吲哚環的共軛離子。若Lys5殘基被Arg取代而形成darobactin C或D，則該特征離子將是一個直接證據。離子m/z 611.2481和m/z 582.2459未觀測到，僅作為推導m/z 228.1595的過渡態離子。

張琪等[5]在分析darobactin的生物合成路徑時，曾推測Trp3-α， β位碳在自由基SAM催化下形成碳碳雙鍵，并通過質譜捕獲到了經雙鍵化修飾的Trp3的多肽片段DarApk（43-53），所以本文推測在HCD或CID過程中經“逆向裂解途徑”也會產生具有雙鍵Trp3的特征離子，并得到了驗證，如y5-H2。李進等[12-13]曾采用“逆羥醛縮合”的方式解析了萬古霉素中的β-羥基間氯酪氨酸開環形成含有醛基的特征離子，如離子m/z 1306，而羥醛縮合反應是實現萬古霉素雜質CDP-Ⅰ-Major和CDP-Ⅰ-Minor之間轉化的途徑。這說明“逆向裂解”在多肽類抗生素的結構解析中是合理的。

3.2 以darobactin B/D/E的碎片離子驗證解析策略

以darobactin A為模型建立的解析策略可以適用于其他darobactin組分的碎片離子歸屬中，表1中對有可能出現在HCD或CID譜圖中的離子m/z進行了總結，同時對出現錯誤的碎片離子的m/z進行了修正。darobactin B中4位氨基酸為Thr，6位氨基酸為Arg，主要發生變化的是與Thr4、Arg6相關的離子，如b6（m/z 884.4162）、b5（m/z 728.3151）及其脫氨基離子b6-NH3（m/z 867.3896）、b5-NH3（m/z 711.2885，B?hringer等[7]給出的m/z 697.2729有誤）和y5-H2（m/z 733.3780）、y5- y2-H2（m/z 412.1979）、y2（m/z 322.1874），而b2-NH3未發生變化，這些離子基本與CID得到的碎片離子結果一致。Arg的引入是否會出現新的碎片離子暫不在討論范圍內。

Darobactin D的5位氨基酸為Arg，主要發生變化的是與Arg5相關的離子，如b6（m/z 829.3376，B?hringer等[7]給出的m/z 830.3454有誤）、b5（m/z 742.3056）及其脫氨基離子b6-NH3（m/z 812.3111）、b5-NH3（m/z 725.2790）、和y5-H2（m/z 678.2994）、y5- y2-H2（m/z 426.1884，B?hringer等[7]給出的m/z 384.1666為脫去Arg5甲脒基后的離子）等，見圖3，而b2-NH3、b1-NH3、y2及y1未發生變化，說明側鏈結構未發生變化，這些離子基本與CID得到的碎片離子結果一致。如果能通過HCD獲得Trp3-Arg5殘基的特征離子m/z 256.1557，預測結構式見圖3所示，則可以證明5位氨基酸為Arg。

Darobactin E的2位氨基酸為Ser，主要發生變化的是與Ser2相關的離子，如b6（m/z 774.3206）、b5（m/z 687.2885）及其脫氨基離子b6-NH3（m/z 757.2940）、b5-NH3（m/z 670.2620）、b2-NH3（m/z 273.0870），均比Darobactin A的相應離子少27（為Asn與Ser的分子量差值），其他離子如y5-H2、y5- y2-H2、y2未發生變化，如上碎片離子基本與CID得到的碎片離子結果一致。

3.3 Darobactin C/F的碎片離子預測

B?hringer等[7]未提供darobactin C和F的MS/MS譜圖，根據本文所建立的解析策略，可以預測其特征碎片離子，具體的離子信息見表1。Darobactin C的2位氨基酸為Ser，5位氨基酸為Arg，主要發生變化的是與Ser2、Arg5相關的離子，如b6（m/z 802.3267）、b5（m/z 715.2947）及其脫氨基離子b6-NH3（m/z 785.3002）、b5-NH3（m/z 698.2681）、b2-NH3（m/z 273.0870）和y5-H2（m/z 678.2994）、y5- y2-H2（m/z 426.1884），而y2及y1未發生變化。與darobactin D類似，HCD圖譜中也將獲得Trp3-Arg5殘基的特征離子m/z 256.1557。

Darobactin F中改變了3個氨基酸，分別為Lys2、Asn6和Leu7，發生變化的離子包括Darobactin F脫氨基離子（m/z 956.4625）、b6（m/z 842.3944）、b5（m/z?728.3515）及其脫氨基離子b6-NH3（m/z 825.3678）、b5-NH3（m/z 711.3249）、b2-NH3（m/z 314.1499）和y5-H2（m/z 643.3198）、y5- y1-H2（m/z 512.2252）、y2（m/z 246.1448）、y1（m/z 132.1019），見圖4；其他與這3個位點無關的特征離子如b1-NH3、y5-y2-H2將不會有所變化。

4 結論

本研究根據已知darobactin組分在HCD或CID模式下的一級及二級質譜數據，建立了darobactin組分系統的結構解析策略，能夠通過在線HPLC-MS快速判定darobactin已知組分的結構，并可以預測同源組分及其前體肽的裂解行為。針對darobactin的雙環結構結合其生物合成路徑，提出了“逆向裂解途徑”來確證Trp1-Trp3醚鍵斷裂生成的特征離子，并首次解析了Trp3-Lys5之間特殊碳碳鍵形成的特征離子，為判斷5位氨基酸（如Lys被Arg取代）提供了直接證據。由于采用文獻中披露的已知數據，可能因碎片離子的缺失導致解析策略不夠完善，如Arg取代組分脫去甲脒基后的離子，尚需采用實際樣品試驗后再進行補充。

參 考 文 獻

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