QuEChERS－超高效液相色譜－三重四極桿質譜法檢測茶葉中250種農藥殘留

袁荷芳　宋淑文　高蕙文　耿成鋼

摘要：建立了QuEChERS－超高效液相色譜－串聯質譜法測定茶葉中250種農藥殘留及代謝物的分析方法。前處理采用QuEChERS方法，樣品用含有1%乙酸-乙腈振蕩提取，經十八烷基硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB）和無水硫酸鎂混合型凈化劑固相分散萃取凈化。采用2 mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸水溶液－2 mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸甲醇溶液作為流動相，以0.3 mL/min的流速進行梯度洗脫，采用ACQUITY HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 ?m）分離，在ESI正離子模式下，采用動態反應監測S-MRM（Scheduled-MRM）模式進行掃描，外標法定量。結果表明，250種農藥在各自質量濃度范圍內均呈現良好線性關系，相關系數＞0.994，定量限為0.01 mg/kg，在3個添加水平（0.01、0.02、0.05 mg/kg）下回收率在71.3%～107.1%之間，相對標準偏差小于10%。由此可得，該新方法快速、靈敏、準確，適用于茶葉中農藥殘留檢測。

關鍵詞：QuEChERS；超高效液相色譜-串聯質譜；農藥殘留；茶葉

中圖分類號：TS272.3；TS201.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1000－3150（2023）08-39-10

Determination of 250 Pesticide Residues in Tea by

QuEChERS Method Coupled with High Performance

Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

YUAN Hefang， SONG Shuwen， GAO Huiwen， GENG Chenggang

Changzhou Center for Food Drug and Fibre Control， Changzhou 213000， China

Abstract： A multi residue analysis was developed for the simultaneous determination of 250 pesticide residues belonging to different chemical classes in tea by QuEChERS-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. The samples were prepared by the modified QuEChERS method， extracted with acetonitrile containing 1% acetic acid， salted out with anhydrous magnesium sulphate and anhydrous sodium acetate and purified by Octadecylsilane （C18）， primary secondary amine （PSA） and graphitized carbon black （GCB）．The compounds were separated on an ACQUITY HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 ?m） column using 2 mmol/L ammonium formate containing 0.01% acetic acid methanol solution and 2 mmol/L ammonium formate containing 0.01% acetic acid as mobile phase. The gradient elution was performed at a flow rate of 0.3 mL/min， analyzed by positive electrospray ionization tandem mass spectrometry under scheduled multiple reaction monitoring（S-MRM） mode. The external standard method was used for quantitative analysis. Two hundred kinds of pesticides showed good linear relationships in their respective mass concentration range， with correlation coefficients（r）?0.994， with the limits of quantitation （LOQ） of 0.01 mg/kg. Recoveries ranged from 71.3% to 107.1% at spiked levels of 0.01， 0.02 and 0.05mg/kg， with relative standard deviations （n=6） of less than 10%. The method is rapid， sensitive and accurate， and could be used in the screening and determination of 250 pesticide residues in tea.

Keywords： QuEChERS， high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry， pesticide residues， tea

茶葉是我國重要的農產品之一，富含茶多酚、生物堿、黃酮等生化成分，具有醒腦提神、抗衰老等保健功效，對人體健康益處頗多，廣受消費者喜愛[1-3]。農藥在防治病蟲害，提高茶葉產量上有著重要作用，然而，因其被過量使用所帶來的殘留，可能對環境和人體健康產生威脅，因此茶葉中的農藥殘留問題已經成為茶葉質量安全關注的焦點之一[4-6]。為了保證茶葉質量安全，2021年9月實施的《食品安全國家標準? 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規定了茶葉中106項農藥最大殘留限量要求[7]。茶葉中含有的大量茶多酚、生物堿、色素等物質會嚴重干擾痕量農藥殘留的分析，因此針對茶葉中的復雜基質，必須進行有效的前處理凈化工序，以降低基質對農藥殘留檢測的干擾[8-9]。

當前，農藥殘留樣品檢測的前處理技術主要包括傳統的液液萃取（LLE）、固相萃?。⊿PE）、基質固相分散（MSPD）、凝膠色譜（GPC）和QuEChERS法[10-17]。傳統前處理方法存在操作復雜耗時、有機溶劑用量較大、凈化效果不理想等不足，QuEChERS法作為近年來新發展起來的一種主要用于農藥殘留分析的前處理方法，選擇性地運用了凈化劑組合形式，能高效除去樣品中的多種雜質，因其具有簡單、快速、高效、綠色等優點而廣泛應用于食品中農藥殘留的檢測[18]。農藥殘留分析方法主要包括液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-質譜聯用法等，其中液相色譜-質譜聯用法具有高靈敏度、高選擇性、定量準確等優點[19-20]。因此本研究采用QuEChERS方法進行前處理，結合液相色譜-質譜聯用法對茶葉中250種農藥殘留進行快速測定，旨在為茶葉風險評估和監管部門日常監督提供技術參考。

1? 材料與方法

1.1? 儀器與設備

液相色譜-串聯質譜儀QTRAP 4500（SCIEX）且配有電噴霧離子源（ESI）；高速冷凍離心機X4 PRO（ThermoFisher）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；IKA MS3漩渦混合器（德國IKA公司）；KQ-500DE超聲波清洗儀（昆山超聲波儀器有限公司）；Gd16Plus高速研磨均質機（深圳市新銳科技發展有限公司）；WT-5002K 電子天平（常州萬泰天平儀器有限公司）；色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 ?m）。

1.2? 試劑及耗材

色譜純乙腈（Merck公司）；甲酸（安譜，HPLC）；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；N -丙基乙二胺（PSA）固相吸附劑（安捷倫公司）；液體農藥殘留標準品（均購自振翔公司），質量濃度均為50 ?g/mL。茶葉樣品均為市售。

1.3? 標準溶液配制

混標中間溶液Ⅰ：分別準確移取質量濃度均為50 ?g/mL的各農藥混標80 ?L，至1 mL棕色進樣瓶中，再準確吸取120 ?L乙腈定容，配制成質量濃度為4 ?g/mL的標準中間溶液Ⅰ。

混標中間溶液Ⅱ：準確移取250種農藥混標中間溶液Ⅰ 250 ?L，至1 mL棕色進樣瓶中，再準確吸取750 ?L乙腈定容，質量濃度為1 ?g/mL。

混標中間溶液Ⅲ：準確移取250種農藥混標中間溶液Ⅰ 25 ?L，至1 mL棕色進樣瓶中，再準確吸取875 ?L乙腈定容，質量濃度為0.1 ?g/mL。

基質標準工作曲線：選擇與被測樣品性質相同或相似的空白樣品按照對應的前處理步驟進行前處理，得到空白基質溶液。分別準確吸取混標中間溶液Ⅲ 26.6、53.2、133.4 ?L，混標中間溶液Ⅱ 26.68、66.7 ?L，混標中間溶液Ⅰ 33.4、66.7 ?L，用空白基質液定容至2 mL，標準曲線質量濃度分別為1.33、2.67、6.67、13.34、33.35、66.7、133.4 ng/mL，現用現配。

1.4? 樣品前處理

提取：取2 g（精確至0.01 g）粉粹后的茶葉于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻，靜置30 min。加人1顆陶瓷均質子及15 mL含1%乙酸的乙腈溶液，刷烈振蕩1 min，加入6 g無水硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉，劇烈振蕩1 min后4 200 r/min離心5 min。

凈化：吸取8 mL上清液至15 mL塑料離心管中，加入1 200 mg無水硫酸鎂、400 mg十八烷基硅膠（C18）、400 mg PSA和200 mg石墨化碳黑（GCB），渦旋混勻1 min。4 200 r/min離心5 min，吸取上清液過0.22 μm濾膜，待測定。

1.5? 檢測條件

液相條件：Waters ACQUITY HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 ?m），流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流動相：A相為2 mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸水溶液，B相為2 mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸甲醇溶液。

梯度洗脫程序為：0～1.0 min，A為97%；1.0～1.5 min，A降為85%；1.5～2.5 min，A降為50%；2.5～18.0 min，A降為30%；18.0～23.0 min，A降為2%；23.0～27.0 min，A保持2%；27.0～27.1 min，A增加至97%；27.1～30 min，A保持97%不變。

質譜條件：動態多反應監測模式（S-MRM）；電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；正離子離子化電壓：+5 500 V；離子源溫度：350 ℃；氣簾氣：40 psi；噴霧氣GS1：50 psi；輔助加熱氣GS2：50 psi。

2? 結果與分析

2.1? 質譜條件的優化

將質量濃度為0.1 ?g/mL的250種農藥殘留混合標準品溶液，采用針泵進樣方式注入離子源，分別在ESI正離子模式下進行一級質譜分析，得到每個化合物的母離子，再對母離子進行二級質譜分析，得到碎片離子信息和二級質譜圖。選擇豐度較大、丟失合理的子離子分別作為定性和定量離子，分別再對去簇電壓及碰撞能量等參數進行優化，確定碎片離子有最大響應強度時的最佳碰撞電壓值。250種農藥化合物的母離子、子離子、響應的錐孔電壓（DP）及碰撞電壓（CE）見表1。為了保證每個分析物的色譜峰至少有15個數據點，且盡量提高化合物的響應，根據化合物的保留時間，采用分時段多反應檢測S-MRM方式進行采集，設定窗口時間為40 s?；旌蠘藴势返目傠x子流圖如圖1所示，250種農藥在色譜柱上峰型良好，無明顯峰拖尾和峰展寬，保留時間也比較理想。

2.2? 液相條件的優化

由于本試驗檢測的250種農殘化合物性質差異較大，本試驗分別采用乙腈—水、甲醇—水、甲醇—甲酸溶液、甲醇—甲酸銨溶液、甲酸+甲酸銨甲醇溶液—甲酸+甲酸銨水溶液作流動相，結果表明其中大部分目標物在2 mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸水溶液－2 mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸甲醇溶液流動相條件下有較高的響應值且峰形尖銳對稱。正離子模式下，向流動相中添加甲酸銨有助于分析物預形成[M+H]+和[M+NH4]+，并且可以提高保留時間的穩定性及形成良好的峰形，同時也能提高分析的靈敏度。加入一定量的甲酸有利于化合物的分離度及離子化效率。同時，有機相和水相中的鹽濃度及甲酸濃度相等，保證了梯度變化過程中鹽的濃度和離子化氛圍穩定。

因此，本試驗最終采用2 mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸水溶液－2 mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸甲醇溶液作為流動相體系。本研究采用Waters ACQUITY HSS T3色譜柱，與常規的液相色譜柱相比，粒徑更小，在提供更高分離度、高靈敏度的同時，可以獲得更快的分析速度，縮短分析時間。

2.3? 采集方式的優化

本試驗一次測定250種化合物，使用傳統的MRM采集方式難以保證每個化合物都有足夠的數據點，所以采用新的S-MRM（Scheduled-MRM）采集方式。傳統的MRM 采集方式僅能夠在整個分析時間內監測所有離子對，如同時分析超過30個以上的化合物時，監測MRM離子需要更長的循環時間，由于每個色譜峰上沒有采集到足夠多的數據點，導致峰型變差及定量結果差。相比于傳統的MRM采集方式，S-MRM可以根據每對離子的保留時間設置較窄的時間窗口，在一次進樣中能夠監測更多的MRM離子對，在色譜峰上獲得比傳統MRM方法更多的數據點，從而改善峰的認定和峰積分，能夠有效地提高目標化合物的響應值，從而保證定量分析的重現性和數據的可靠性，最終獲得更低的變異系數和更低的檢測限。

2.4? 提取溶劑的優化

本研究分別考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑。比較發現，甲醇作為提取試劑時，鹽析效果比較差，需要加大量的氯化鈉，否則容易出現不分層的現象。乙酸乙酯作為提取液時，最后上機前需要進行氮吹來轉換溶劑，過程相對繁瑣。乙腈作為提取液極性較強，對大部分化合物具有較高的提取效率，鹽析效果也比較好。茶葉水分含量低，即使采用極性較強的有機試劑，也不能完全提取，必須向試樣中加入適量的水，讓樣品充分浸泡后，再加入有機試劑進行提取，這樣能夠大大提高農藥提取的回收率。大多數農藥為酸性、弱酸性或中性，這些農藥在堿性環境中容易分解，比如說有機磷類、氨基甲酸酯類農藥，因為這些農藥分子結構中都含有酯類的結構，所以在堿性條件下易分解。因此，大部分農藥對堿性環境敏感，在堿性基質中極易降解，所以考慮在提取溶液中加入乙酸，從而提高堿性敏感農藥的回收率。分別考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、0.5%乙酸-乙腈、1%乙酸-乙腈、2%乙酸-乙腈的提取效果，對250種農藥在茶葉基質中的加標（0.02 mg/kg）回收率進行對比，結果見表2。從表中可以看出，使用1%乙酸-乙腈溶液作為提取溶劑具有較高的提取效率，更適合于茶葉樣品中多農藥殘留的提取。

2.5? 凈化劑用量的優化

PSA是一種常用的吸附劑，其有效成分為表面鍵合的氨基，有較強的離子交換能力。同時PSA可與金屬離子產生鰲合作用，可用于提取金屬離子。對于樣品中的金屬離子、糖類、脂肪酸等極性物質具有良好的凈化作用，但是對色素的凈化作用不理想，尤其對于茶葉、蔬菜等色素含量較高的樣品凈化效果較差。因此，本研究在凈化試劑包中加入一定量的PSA試劑。

GCB對色素具有較強的吸附能力，能有效去除茶葉中葉綠素、類胡蘿卜素、茶黃素等。但GCB表面的六元環結構會吸附一些平面及對稱結構的農藥，影響部分農藥的回收率。需要優化凈化過程中GCB的用量，使其在起到凈化作用的同時不會對農藥的回收率產生較大的影響。本研究分別考察了GCB用量為10、15、25、35、45、55 mg時對部分農藥回收率的影響。由圖2可知，當GCB用量為25 mg時，綜合回收率較高，且提取液澄清透明，所以對于此類基質使用25 mgGCB凈化。

2.6? 方法學驗證

2.6.1? 線性關系和定量限

為了驗證本方法的可行性和準確性，稱取2 g空白基質樣品，按照上述樣品前處理方法進行前處理，用空白樣品基質溶液配制成1.33、2.66、6.67、13.34、33.35、66.70、133.40 ng/mL混合基質，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。各組分在1.33～133.4 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.994，定量限均為0.01 mg/kg。

2.6.2? 回收率和精密度

取基質空白茶葉樣品，選擇3個含量水平（0.01、0.02、0.05 mg/kg）進行加標，每個加標水平進行6次平行試驗，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD）。結果顯示，所有目標化合物的回收率在71.3%～107.1%之間，RSD為0.5%～9.6%，滿足《實驗室質量控制規范食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中的標準要求，該方法可用于茶葉樣品中農藥殘留的檢測分析。

2.6.3? 基質效應

基質效應（Me）指樣品分析液中分析物以外的混雜組分改變分析物響應值，使定量分析準確度的重現性受到影響的現象。采用標準曲線斜率比值（sloperatio）來評價基質效應Me。當Me在0.8～1.2之間表示基質效應可以接受，Me越接近1基質效應越弱；當Me小于1時為基質抑制效應，當Me大于1時為基質增強應[21]。本試驗以乙腈溶劑和茶葉空白基質液分別配制農藥混合標準溶液，測得各農藥在1.33～133.4 ng/mL質量濃度范圍內，茶葉空白基質中校正曲線斜率（A）及純溶劑標準工作液中校正曲線斜率（B），考察基質效應強弱（Me=A/B）。本研究考察了250種農藥的基質效應，如表1顯示，其中24種農藥Me在0.13～0.72之間，茶葉基質減弱效應比較明顯。其余農藥的基質效應在0.80～1.20之間，基質效應可以接受。綜合考慮，本研究用茶葉基質匹配標準工作液來繪制標準曲線進行校準，盡可能消除基質效應對定量的影響。

2.7? 實際樣品測定

對市場上購買的30批茶葉樣品進行檢測，磨碎后充分混勻，稱取制備好的茶葉樣品2 g，按照1.4樣品前處理進行檢測。共檢出15種農藥，其中啶蟲脒、殺蟲脒、苯醚甲環唑、呋蟲胺、噻嗪酮、多菌靈檢出率較高，檢出含量在0.072～0.890 mg/kg之間。13批次茶葉檢出農藥殘留，其中，5批次茶葉僅檢出1種農藥，8批次茶葉檢出2種或2種以上農藥，單批次樣品最多檢出7種農藥成分；其余17批次茶葉均未檢出農藥。此外，值得關注的是嘧菌酯、殺蟲脒及氟環唑在GB 2763—2021中還未有具體限值，其中殺蟲脒檢出率比較高。

3? 小結

本研究在QuEChERS方法的基礎上對前處理過程中提取和凈化等條件進行了優化，建立了超高效液相色譜－三重四極桿質譜法測定茶葉中250種農藥殘留的快速檢測方法。該方法在3個添加水平下回收率在71.3%～107.1%之間，相對標準偏差小于10%，定量限為0.01 mg/kg，30 min內即可完成茶葉樣品中農藥殘留的高通量檢測。該方法具有操作簡單、靈敏度高、高通量等特點，能滿足農藥殘留日常風險監測的需求，為農藥殘留定性定量分析提供了可靠的技術手段，為高效和準確地評價茶葉的質量安全提供了新的參考。

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基金項目：食用農產品中農藥殘留的非靶向篩查應用研究（CE2022029）

作者簡介：袁荷芳，女，高級工程師，長期從事食品中污染物檢測，E-mail：335001631@qq.com