抗癌藥物遞送載體牛奶外泌體的研究進展

武大偉，寧 莉

天津醫科大學第二醫院檢驗科，天津 300211

1 前言

外泌體是天然的細胞外納米囊泡，通過攜帶諸如蛋白質、微小RNA、mRNA、DNA和其他分子的生物活性物質參與細胞間通訊［1-2］，因其體積小（直徑40～100 nm），外泌體是個性化治療中很有前途的遞送載體［3］。由于尚未開發出人工外泌體合成方法，因此，有效、安全地從自然資源中大量獲取外泌體是當下迫切的任務。外泌體可從各種生物體液中分離得到，如血漿、尿液、唾液、乳汁、羊水、腹水、腦脊液等。其中，乳汁是唯一可以量產的含有外泌體的生物液體。人乳外泌體于2007年首次描述。迄今為止，已從人、牛、豬、小袋鼠、駱駝、大鼠、馬、熊貓、綿羊和山羊奶中分離出外泌體［4］。牛奶外泌體被認為是開發新的治療方法以治療包括癌癥在內的各種疾病的最有希望的候選者。牛奶外泌體在癌癥治療的應用中有兩個方向，分別是抗腫瘤藥物和治療性核酸的遞送。在使用細胞毒性劑和細胞抑制劑的過程中發生的各種副作用是尚未解決的癌癥化療問題。使用細胞抑制藥物不僅會導致腫瘤細胞死亡，還會導致骨髓，皮膚，毛發，胃腸道上皮細胞等［5］死亡。有針對性的化療藥物輸送是化學療法中發生毒性作用的潛在解決方案［6］。外泌體可用作藥物傳遞系統，將治療性核酸的藥物載于表面，或使用電穿孔、超聲處理或配體“裝載”這些成分后攜帶于表面［7］。另一種方法是將外泌體與脂質體融合，并摻入必要的內容物以形成“嵌合”外泌體［8］。因此，本文就牛奶外泌體分離方法、生物成分分析及在癌癥治療中的應用前景進行綜述。

2 牛奶外泌體的分離

可以使用各種物理、物理化學和免疫學方法從牛奶中分離外泌體。在國際細胞外囊泡學會的指南中描述了有關外泌體分離和鑒定的一般性問題［9-10］。由于從單個人或動物身上獲得的乳汁量可能會從毫升到升不等。因此，從乳汁樣品中分離外泌體的一般方法通常就是離心。首先，在600～1 000×g 的低速下進行幾次連續離心，脫脂并沉淀細胞；然后在10 000～16 000×g 離心沉淀乳蛋白，最后在100 000～200 000×g［11］進行一次或數次超速離心以分離外泌體。

超速離心或凝膠過濾分離人乳、牛乳和馬乳中外泌體的可能性已被證實。凝膠過濾不適合直接從大量牛奶中分離外泌體，它可從超濾和/或超離心后獲得的共分離蛋白質制劑中純化樣品。連續的離心和超速離心后用0.22 μm過濾器進行超濾不足以獲得純化的外泌體。然而，通過對超離心法獲得的沉淀物進行凝膠過濾可以得到不摻雜共分離蛋白混合物的外泌體制劑。

3 牛奶外泌體的生物活性化合物

牛奶外泌體生物化學成分（包括蛋白質、脂類和核酸）明顯影響治療分子的傳遞。在這方面，需要對牛奶外泌體中這些分子的含量進行詳細分析，也稱為“外泌體學”（類似于基因組學、蛋白質組學和其他組學技術）［12］。

3.1 牛奶外泌體蛋白質

牛奶外泌體包含幾種參與其形成的蛋白質：睪丸素控制膜融合，Rab GTPase與細胞骨架蛋白相互作用［13］，Alix和Tsg101 參與內吞作用［14］。此外，牛奶外泌體所含的蛋白質決定了它們生物學功能，即微小RNA的運輸和對靶細胞的黏附（四跨膜蛋白CD9，CD63，CD81）。牛奶外泌體還包含例如在Wnt信號通路中出現的涉及信號轉導的細胞骨架蛋白（肌動蛋白、微管蛋白、cofilin、熱激蛋白和分子）。嗜乳脂蛋白、乳黏附素和黃嘌呤脫氫酶是牛奶外泌體的特異性標記物。根據不相容分泌機制，α-，β-和κ-酪蛋白和核糖體蛋白不可能存在于外泌體制劑中［15］，因此這些蛋白質不是內在成分，可以被視為牛奶外泌體的“陰性標記物”。

3.2 牛奶外泌體核酸

外泌體RNA在腸內低pH值和存在RNA酶的情況下是穩定的。牛奶mRNA 主要集中在外泌體中，而microRNA（miRNA）集中在外泌體和上清液中。通過高通量測序（NGS）和微陣列技術分析牛奶外泌體的miRNA 含量。微陣列全球表達譜分析顯示，牛奶超速離心后，外泌體組分中有79 種不同miRNA，上清液中有91 種不同miRNA，有39 種miRNA 在兩種組分中均有出現。進一步研究［16］表明，這些miRNA 在外泌體部分的表達水平明顯高于上清液。牛奶和牛奶外泌體不同的miRNA通常具有多個靶標，并且在胎兒發育、細胞增殖、妊娠、免疫系統發育、炎癥、糖代謝、胰島素抵抗等許多過程中顯示出重要的作用［17］。

3.3 牛奶外泌體脂類

外泌體是由脂質雙分子層圍成的囊泡。在這方面，無論是對親水分子（與表面蛋白結合）還是疏水分子（作為脂質雙層的一部分），都可以在外泌體內部和外部傳遞具有藥理意義的化合物。眾所周知，外泌體膜含有膽固醇、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和神經酰胺；大多數磷脂酰膽堿和鞘脂已被證實位于外泌體膜的外層［18］。外泌體制劑在離心和超速離心分離過程中被脂滴、脂蛋白和其他顆粒污染的問題限制了固有的外泌體脂質的研究。研究［19］表明，從細胞培養物中分離出的外泌體包含花生四烯酸、前列腺素、脂肪酸代謝酶和白三烯。因此，需要進一步研究高純度外泌體制劑中的脂質。脂質體已廣泛用作靶向遞送載體已有40多年的歷史。脂質體膜可以通過單克隆抗體、核酸適配體、蛋白質和小分子進行修飾以改善靶向性。改變天然外泌體膜的一種有前途的方法是將其與具有人工功能化脂質的脂質體融合。與脂質體相比，聚合物納米粒子可能具有更高的穩定性，但是在長期給藥的情況下，它們的生物相容性和安全性仍未解決［20］。牛奶外泌體的天然脂質成分比人工脂質體更具相容性且毒性更低［21］。為了提高由牛奶外泌體給藥的效率，需要對外泌體的脂質組成（脂膜上的蛋白質）進行更深入的研究。修飾外泌體表面以靶向輸送和延長體內半衰期是生物藥理學和生物醫學的一項重要任務［22］。

4 牛奶外泌體在癌癥治療中的藥物遞送

2016年，牛奶外泌體針對惡性腫瘤的靶向作用首次被證實。在治療體內肺部腫瘤的細胞培養和異種移植中，載有藥物的外泌體顯示出比游離藥物更高的功效。牛奶外泌體表現出種間耐受性，無任何不良免疫反應和炎癥反應。因此，證實了牛奶外泌體的多功能性，與攜帶負荷和達到靶向腫瘤的能力有關［23］。在用于輸送化療藥物紫杉醇的牛奶外泌體的研究中，證實了負載的外泌體的大小略有增加。同時，含有該藥物的外泌體在模擬胃腸道條件下也很穩定，從而突出了它們適合口服藥物的遞送［24］。

南蛇藤素是一種植物來源的三萜類化合物，具有抗炎、抗增殖和抗腫瘤的活性［25-26］。然而，這種藥物的使用由于其低的生物利用度和毒性而受到高度限制。在非小細胞肺癌的異種移植模型中，載有南蛇藤素的牛奶外泌體與游離南蛇藤素相比具有較高的抗腫瘤活性。同時，通過牛奶外泌體遞送的南蛇藤素沒有表現出明顯的全身毒性［27］。在順鉑耐藥卵巢癌細胞系的實驗中［28］，將基于漿果花青素的制劑裝載到牛奶外泌體中，顯著提高了藥物的抗增殖活性，這強調了外泌體封裝在各種抗腫瘤藥物使用中的前景。

在Clinicaltrials.gov上注冊的當前試驗中，還沒有一項將牛奶外泌體用作藥物遞送系統的研究。然而，研究［23］表明使用牛奶外泌體來遞送抗腫瘤藥物有助于提高治療的有效性并降低治療的毒性，這為將牛奶外泌體用于口服治療劑的應用開辟了極好的前景。

5 牛奶外泌體核酸的生物活性及核酸向癌細胞的傳遞

牛乳中主要的miRNA miR-21 靶向p57Kip2，這是一種抑制前列腺癌細胞中周期蛋白依賴性激酶的因子。乳腺癌患者血清和腫瘤組織中miR-21水平升高。P57kip2基因敲低增強了磷酸肌醇3-激酶的腫瘤相關突變變異體誘導的增殖表型。在形態發生過程中，它從細胞停滯中釋放出乳腺上皮腺泡，表明乳腺miR-21 對腫瘤生長過程具有潛在的作用。

外泌體刺激健康的腸上皮細胞增殖，但不刺激腫瘤培養物。牛奶外泌體對健康細胞的孵育導致磷酸酶和緊張素同源物（PTEN）表達水平的降低，這是miR-148a 的主要靶標，牛奶外泌體中也發現了miR-148a 的成分。在miR-148a 基因敲除細胞中，牛奶外泌體抑制DNMT1 的增殖和表達。

外泌體在細胞之間轉移mRNA 和miRNA 并隨后介導受體細胞中靶基因表達變化的能力也凸顯了它們傳遞外源性小干擾RNA（siRNA）的潛力。siRNA 是潛在的一種新療法。隨著對內源性RNA干擾的了解不斷增加，將siRNA用作許多疾病（包括不同類型的癌癥）基于核酸藥物的可能性正在增加。對siRNA 進行化學修飾以供其傳遞是不成功的，在某些情況下，導致其生物活性的喪失并發生毒性效應。聚合物納米顆粒、脂質和脂質體、多肽和合成納米載體被認為是將siRNA遞送到細胞的替代選擇;目前最先進的給藥系統是基于脂質體的。然而，這些方法從未解決非特異性靶向和免疫應答的問題。牛奶外泌體可以將內源性RNA負載到受體細胞，并保持穩定，抵抗降解。在肺癌細胞系和小鼠異種移植中，用siRNA 負載的外泌體干擾KRAS基因突變等位基因的劑量依賴性抗增殖活性被證實。

6 結語

與脂質體和其他人造納米顆粒相比，牛奶外泌體用于藥物遞送的主要優勢是更高的生物相容性，即較低的免疫原性和細胞毒性，這是由于外泌體的化學成分與細胞膜相似。牛奶外泌體攜帶的生物活性分子即使在消化道的惡劣條件下也保持穩定，這使得使用牛奶外泌體運送口服藥物成為可能。牛奶外泌體組成中各種miRNA的多樣性描述及其對受體細胞遺傳信息的影響，為外泌體在疾病（尤其是腫瘤性疾?。┑幕蛑委熤写蜷_了廣闊的潛力。在藥物和生物活性分子的傳遞中起著至關重要作用的牛奶外泌體的脂質成分，還沒有得到足夠的研究，因此，繼續進一步研究牛奶外泌體的生物化學組成具有重要意義。