糧油中多種真菌毒素檢測技術研究進展

李華英，閆文婧，李進春，龔 洋，何 瑞，李 莉

（四川省糧油科研所，四川 成都 610017）

0 引言

某些真菌生物在生長過程中會產生次生有毒代謝產物——真菌毒素，這類真菌毒素具有強毒性、極易污染糧食產品，對人體具有致癌、致畸、致突變等作用，常見的真菌毒素有黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、鏈格孢霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素等[1]。經真菌毒素污染的糧油產品被人體攝入后，會嚴重損害人體健康，甚至危害生命，檢測糧油中真菌毒素含量是監控其品質至關重要的手段和方式。綜述了近年來真菌毒素檢測技術研究進展，主要包括常規儀器分析法、免疫分析法、光譜分析法，對比各項技術存在的優勢及缺陷，以期為真菌毒素污染的糧食安全問題提供一定的技術幫助。

1 真菌毒素常見種類及危害性

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌等真菌代謝所產生，具有B1、B2、M1、M2、G1、G2等多種類型，發霉變質的糧油易受其污染，其中黃曲霉毒素B1作為目前已知致癌性最強的真菌毒素，具有極強的急性毒性和慢性毒性，短期內大量攝入對肝功能損傷嚴重，長期持續性攝入會紊亂多種器官和組織的正常運作功能，引發慢性肝損傷、誘發肝癌[2]。

赭曲霉毒素是由赭曲霉屬和青霉屬真菌代謝產生的有毒物質，其中赭曲霉毒素A 的毒性最強，具有腎毒性、肝毒性、胚胎毒性、致癌性、遺傳毒性等，主要損害腎臟器官，引發尿路上皮癌、巴爾干腎病、腎癌等[3]。

鐮刀菌毒素是由鐮刀菌合成代謝產出的毒性物質，包括玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。玉米赤霉烯酮會影響生物正常生長發育，具有生殖毒性、肝臟毒性、免疫毒性、致癌性等，引發腫瘤疾病。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，又稱為嘔吐毒素，具有免疫毒性、器官毒性、致畸性等，會引發嘔吐、厭食、腹瀉、血液病[4]。

2 糧油中真菌毒素檢測技術及優缺點分析

2.1 常規儀器分析法

2.1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是目前使用較為廣泛的真菌毒素定量測定方法，其基本原理為：選擇合適的有機溶劑提取毒素，后經液液萃取、免疫親和、固相萃取、凝膠色譜等技術進行凈化，通過色譜柱時由于樣品中各物質在流動相和固定相中的分配系數和親和力不同，在固定相和流動相中連續交換實現分離與檢測，常用的檢測器包括熒光檢測器、紫外檢測器、二極管陣列檢測器等[5]。Wang Weigang 等人[6]建立了復合免疫親和柱-在線光化學衍生-高效液相色譜法，同時對谷物及其制品中黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2、M1、M2）、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素（A、B） 進行檢測，在不同加標濃度下，9 種真菌毒素的回收率均大于80%，相對標準偏差為1.0%~5.6%，檢測限為0.02~5.00 μg/kg，定量限為0.07~16.70 μg/kg。邵亮亮等人[7]建立了復合免疫親和柱凈化高效液相色譜法，同時測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A 4 種真菌毒素，4 種真菌毒素的回收率均大于85%，相對標準偏差均小于5.0%。高效液相色譜法可對真菌毒素同時進行定性和定量分析，靈敏度高、重現性好，色譜柱可重復利用，但前處理操作繁瑣，對試驗人員檢測技術要求較高、設備昂貴、檢測時間長，無法滿足大批量樣品的快速測定[8]。

2.1.2 液相色譜-質譜串聯法

液相色譜-質譜串聯法將液相色譜與質譜聯合使用，液相色譜作為分離系統，質譜作為檢測系統，集中了液相色譜對復雜樣品的高分離性能與質譜提供物質相對分子質量和結構信息兩大優勢，實現對多組分真菌毒素的定性與定量檢測[9]。Zhao H 等人[10]建立了一種改進的QuEChERS 方法，結合優化的HPLC-MS/MS 法，同時分析植物油中16 種常見的真菌毒素，采用一步提取法對植物油中的真菌毒素進行提取，測得16 種真菌毒素的回收率為72.8%~105.8%，檢出限為0.04~2.90 ng/mL。該方法相較傳統的液相色譜法具有高分離性、高靈敏度、高特異性的特點，無需對樣品進行衍生化處理便能夠進行真菌毒素多重檢測，但其檢測成本較高、儀器設備操作較復雜，通常用于大型實驗室的使用，暫不能滿足現場檢測的要求[11]。

2.1.3 氣相色譜法

氣相色譜法是利用不同物質沸點、極性及吸附性等方面的差異，對熱穩定性較好和易揮發性物質實現分離，完成真菌毒素定性和定量的測定，常用的檢測器有電子捕獲檢測器、氫火焰離子化檢測器、火焰光度檢測器等[12]。張正煒等人[13]采用氣相色譜法檢測小麥粉中嘔吐毒素含量，小麥粉經乙腈/水混合溶液提取，通過衍生化處理，采用電子捕獲檢測器（ECD） 測定。嘔吐毒素在0.01~1.0 mg/L 范圍內線性關系良好，線性相關系數為0.998 5。在加標濃度為0.04~1.0 mg/kg 的添加水平下，平均回收率為93.8%~108.5%，相對標準偏差為4.3%~8.6%，檢出限為0.01 mg/kg。氣相色譜法可以檢測不含熒光基團或發色基團、熒光或紫外光吸收較弱的真菌毒素，靈敏度高、特異性強、可以同時對樣品中多組分真菌毒素進行測定。但該方法的衍生化處理過程復雜繁瑣，檢測成本高、耗時長，不適用衍生化試劑的真菌毒素無法進行氣相色譜檢測。

2.2 免疫分析法

2.2.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法能夠快速檢測真菌毒素，其檢測原理為抗原與抗體特異性結合，在固相載體上包被抗原（或抗體），隨后制備酶標抗體（或抗原），樣品與酶標抗體（或抗原） 會進行競爭性結合，加入底物后由于酶的催化作用發生顯色反應，顯色深淺與被測抗原或抗原的濃度呈正比，包括直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法[14]。Pereira C S 等人[15]評估了黃曲霉毒素B1檢測試劑盒的定量測試能力，結果表明，檢出限為1.1 μg/kg，定量限為2.5 μg/kg，室內平均相對標準偏差的為9.3%，回收率達101.8%，所測數據符合制造商聲明、符合GIPSA 關于該參數的所有要求。根據酶聯免疫法制備試劑盒進行測定，靈敏性高、時間短、速度快、成本低、前處理簡單、無需使用大型儀器，已廣泛應用于真菌毒素的檢測中，但該法仍存不足，受環境因素影響顯著，試驗結果重復性差，對試劑的選擇性較高，化學結構相似的物質無法辨別，存在假陽性。

2.2.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法是通過膠體金標記抗原或抗體的免疫結合分析技術，免疫層析試紙條由樣品墊、結合墊、層析膜、吸水濾紙、PVC 板構成。檢測原理為：膠體金作為標記物，硝酸纖維膜作為固相載體，通過毛細管作用和層析作用，結合標記物與游離標記物在層析膜上逐步分離，樣品中的真菌毒素與金標試劑特異性結合形成免疫復合物被截留，并發生顯色反應，顯色深淺與真菌毒素的含量呈正比[16]。杜兵耀等人[17]采用膠體金免疫層析法檢測谷物中黃曲霉毒素的含量，同時采用高效液相色譜法檢測樣品，比較驗證膠體金免疫層析法可行性，相符率高達90%。該法試驗操作及設備簡單、體積小、易攜帶、即時可測、簡便快捷、篩選量大，但由于膠體金納米粒子穩定性較差、受溫度影響大、無法長時間保存、顏色亮度較淺等問題，導致其存在檢測靈敏度低、定量困難、結果不準確等缺點。

2.2.3 熒光定量免疫層析法

熒光定量免疫層析技術的原理為熒光標記物在特異性基團或親和素-生物素的作用下與抗原、抗體進行特異性結合形成復合物追蹤整個化學反應進程，進而對待測物進行定性定量分析，現今常見的熒光標記物有熒光素、量子點、量子點微球、時間分辨熒光微球等[18]。Li J 等人[19]采用量子點微球作為標記物能夠在10 min 內快速檢測黃曲霉毒素B1含量，檢出限為0.005 ng/mL，相對標準偏差小于10%，回收率在78%~88%，其研究結果表明可用于谷物產品黃曲霉毒素B1的快速現場檢測。該法雖起步較晚，但具有靈敏度高、檢測時間短、定量精準、操作便捷、多種熒光標記物可供選擇等優點，各方面均優于膠體金免疫層析技術，是目前的研究熱點。

2.3 光譜分析法

2.3.1 近紅外光譜

近紅外光譜分析技術依靠于含氫基團振動倍頻與合頻的特征信息，近紅外光照射使得樣品的含氫基團受到刺激發生共振，近紅外光的能量被部分吸收后形成近紅外光譜圖。真菌毒素中不同基團對近紅外光有選擇性吸收的效果，由此反應出有機化合物的組成和分子結構信息，從而對真菌毒素進行定性和定量分析[20]。蔣雪松等人[21]利用可見/近紅外光譜在線檢測系統采集小麥的光譜圖，提取其特征波長后建立定量預測模型，基于LDA 和PLS-DA 2 種判別分析方法建立的定性分析模型建模集總體準確率分別為88.46%，89.23%，對未超標的樣品能夠準確識別，但無法進行可靠的定量預測。該法具有無需對樣品進行前處理、無需消耗化學試劑、檢測高效快捷等優點，在真菌毒素高污染的糧食中呈現較好的檢測能力，但真菌毒素分子量小、含量低、分子振動信號弱，不適用于微量真菌毒素的檢測[22]。

2.3.2 拉曼光譜法

拉曼光譜是將真菌毒素與入射光作用后的散射信號進行收集而形成的振動光譜。拉曼頻移與真菌毒素分子的振動和轉動能級有關，與入射光波長無關，具有特征性，由此可對分子結構表征、內部應力分布、成鍵效果等進行分析。楊雪倩等人[23]采用拉曼光譜法檢測6 個不同霉變等級的玉米中黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量，經過對光譜數據處理及有效特征波長的篩選構建BPNN 預測模型，黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量預測值的相關系數和均方根誤差分別為0.986 9，0.098 7，0.967 3，0.092 2。對表面增強拉曼散射改善了傳統拉曼光譜靈敏度低的缺點，具備快速、高效、低成本，同時滿足多種真菌毒素測定等特點。但作為近年來的創新技術，存在機理尚未清晰、基底復現性差、“拉曼光譜指紋”數據庫未完善等諸多問題。

3 結語

目前，真菌毒素的檢測分析技術方法較多，但對于大批量樣品的檢測暫未探索出同時滿足微量、高效、靈敏、快速、準確、低成本的檢測方法。常規儀器分析法具有極高的準確性和靈敏性，但前處理繁瑣、測試成本高、獲取數據結果慢、對操作人員要求高。免疫分析法更適合大批量樣品現場快速檢測的需要，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、成本低、快速等特點，但檢測結果準確性具有局限性，存在假陰性、假陽性的干擾。光譜分析法在真菌毒素的檢測領域具有廣闊的應用前景，無需預處理、檢測速度快、靈敏度高、可進行定性判別，但在認可度、穩定性和精密度方面存在不足，仍處于試驗探索階段。為了更好地滿足糧油質量檢驗的需要，結合具體的生產生活需求，探索或選擇糧油產業更為先進的真菌毒素檢測手段，促進我國糧油產業的進步和發展。