雞傳染性支氣管炎診斷方法的研究進展

夏立業

摘 要：雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起的一種呼吸道傳染病。傳染性支氣管炎病毒傳染性較強，給養雞業的健康發展帶來嚴重威脅。該病毒具有較多的血清型，且經常出現變異，因此需要做好雞傳染性支氣管炎的診斷工作，能最大程度控制本病的傳播。本文綜述了病毒分離鑒定、血清學診斷和分子生物學診斷等幾種常用的雞傳染性支氣管炎診斷方法，以期為生產中該病的準確診斷提供參考。

關鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒；病毒分離鑒定；血清學診斷；分子生物學診斷

中圖分類號：S854.4+3 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2023）08-0070-04

傳染性支氣管炎是危害雞的一種重大疾病，給世界養雞業造成了巨大的經濟損失[1]。該病的病原為雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV），是一種典型的RNA病毒，具有突變率和重組率高的特點，在不同的國家或地區往往流行不同的血清型[2]。雞傳染性支氣管炎的臨床癥狀與其他禽類的呼吸道感染性疾病相似，很難與其他呼吸道病毒感染區分開來[3]，這就對雞傳染性支氣管炎病毒感染的診斷方法提出了很高的要求。近年來，由于禽類養殖業的快速發展，也給該病的防控帶來了極大的挑戰。本文綜述了病毒分離鑒定、血清學診斷和分子生物學診斷等幾種用于雞傳染性支氣管炎診斷的主要方法，以期為該病的準確診斷提供一定的參考。

1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是雞傳染性支氣管炎的常見診斷方法。在養殖過程中，為了診斷雞群中是否存在感染傳染性支氣管炎病毒的雞，應分別從健康雞和有臨床癥狀的雞體內采集樣本。由于該病主要侵害雞的呼吸系統和生殖系統，通常選擇疑似感染傳染性支氣管炎的患病雞氣管組織或拭子作為待檢測的樣本，若處于急性發病期，特別是剖檢存在病變時，也可以采集患病雞的腎臟或輸卵管[4]；同時可以嘗試采集盲腸扁桃體和泄殖腔拭子，但這些部位的病毒分離率一般較低。當試圖采取分離病毒的方法進行該病的診斷時，應盡早采集樣本，因為雞傳染性支氣管炎病毒的滴度在感染后第一周即達到峰值，這時可能某些患病雞的臨床表現還不明顯。所采集的樣本應小心地存放在冰上，并迅速送往實驗室，以最大限度地保持病毒活力。雞胚腎上皮細胞和腎成纖維細胞等可用于雞傳染性支氣管炎病毒的分離，但無特定病原體雞的雞胚尿囊腔或氣管組織培養物接種被認為是分離該病毒更有效的方法[5]。雞傳染性支氣管炎病毒在雞胚中培養時可引起尿酸鹽沉積，胚胎發育遲緩、蜷曲或死亡，而在氣管組織培養物中培養可造成纖毛停滯。當使用雞胚接種培養時，通常需要連續傳代三次才能夠觀察到病變，而使用氣管組織培養物接種培養時則在第一次傳代后即可見。但無論采取上述哪種接種方式，不能僅僅依靠觀察到的上述病變作為確診該病的依據，還應該采用血清學或分子生物學的方法對病毒分離株進行進一步鑒定。金娟等[6]利用雞胚培養、氣管環及動物回歸試驗、電鏡觀察、RT-PCR等多種方法相結合的方式成功從疑似患病雞組織病料中分離到1株雞傳染性支氣管炎病毒。目前，病毒分離鑒定的診斷方法耗時較長且實驗要求較高，因此在實際生產中并不常用，但它仍用于病毒致病性評估、疫苗保護作用評估等其他幾個領域。

2 血清學診斷方法

目前，用于雞傳染性支氣管炎病毒診斷的血清學方法主要包括瓊脂凝膠沉淀試驗、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、病毒中和試驗與血凝抑制試驗。

瓊脂凝膠沉淀試驗反應快速，成本也不高，但需要制備用于沉淀反應的IgM抗體，且其反應的敏感性較差，只有在感染幾周后才能檢測出來，所以沒有得到廣泛的應用。

考慮到成本和操作的便捷性等因素，ELISA是最常用于傳染性支氣管炎病毒常規血清學檢測的方法，該方法還可用于監測蛋雞和種雞中雞傳染性支氣管炎疫苗接種后的反應情況。程旭等[7]以感染QX型雞傳染性支氣管炎的Vero細胞適應株為包被抗原建立了一種間接ELISA抗體檢測方法，可應用于免疫雞群后抗體水平監測及早期感染預警。李新偉[8]針對新疆某養禽公司雞傳染性支氣管炎免疫情況進行ELISA抗體監測，通過監測數據為新疆雞傳染性支氣管炎免疫程序的調整提供了依據。由于抗體滴度可能會受到雞群的品種、日齡、接種計劃和時間等多種因素影響，因此，對于定期監測養殖場，需要確定基準值以確保監測結果的準確性和穩定性[9]。現有的大多數ELISA試劑盒在設計時主要是采用的針對雞傳染性支氣管炎病毒全病毒粒子的多克隆抗體，并不能用于血清分型。近年來，研發人員已經陸續開發出了幾種新型的商用ELISA試劑盒，這些試劑盒采用的是基于病毒血清型或菌株特異性設計的單克隆抗體，可精準檢測出病毒的血清型分類[10]。

病毒中和試驗與血凝抑制試驗可以識別雞傳染性支氣管炎病毒血清型特異性抗體，因此有助于區分野毒毒株和疫苗毒株。然而，由于使用血凝抑制試驗時容易發生交叉反應，而病毒中和試驗進行常規監測又過于費時費力，因此病毒中和試驗更多的是作為血清分型的方法來應用。此外，最近還開發了其他血清學診斷方法，但這些方法的商業化和臨床使用還需要一段時間[11-12]。

3 分子生物學診斷方法

近年來，隨著分子生物學檢測手段的不斷發展和完善，該方法已成為雞傳染性支氣管炎病毒檢測中使用最多的工具。這類方法的靈敏度高、反應時間快，不僅能用于病毒的快速檢測，還可以從遺傳角度對檢測到的毒株特征進行描述，從而可以合理地制定疫苗接種方案。目前，很多分子生物學的診斷方法都是基于反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR），這些方法有的是針對幾乎所有雞傳染性支氣管炎病毒亞型的通用方法，有的則是針對其基因型或毒株的特異性方法。采用RT-PCR方法可對樣本中存在的病毒進行定量，這有助于判斷疾病是否主要由雞傳染性支氣管炎病毒引起，而且定量檢測疫苗毒株滴度還可用于評估疫苗接種效果和持久性。趙秀美等[13]通過設計針對雞傳染性支氣管炎病毒株5′端非編碼區保守區域序列的特異性引物，建立了一種能夠快速定量檢測該病原且具備良好特異性和重復性的RT-PCR方法。雞傳染性支氣管炎病毒的遺傳變異主要集中于病毒的S1基因，因此該基因也成為PCR方法最常用的靶向區域。陳淑琴等[14]根據不同基因型的雞傳染性支氣管炎病毒S1基因序列差異較大的區域設計特異性引物和探針后建立的RT-PCR檢測方法，能夠快速鑒別GVI-1基因型毒株與其他基因型毒株。當存在多個毒株同時感染的情況時，通用的RT-PCR和Sanger測序只能檢測到具有最高滴度的一個毒株。而不同引物的特異性不同也可能引起檢測結果的偏差，因此不同的檢測方法檢測到不同的毒株是很常見的。在實際生產中，應該針對養殖地區流行的毒株來選擇通用或特異性的RT-PCR檢測方法。

限制性酶切片段長度多態性分析是一種通過病毒基因限制性酶切圖譜進行分型的方法。該方法結合了RT-PCR技術，主要原理是提取編碼病毒抗原表位基因，采用RT-PCR擴增DNA片段，隨后用限制性內切酶進行處理，根據酶切圖譜進行病毒分型。Kwon等[15]采用RT-PCR技術擴增出含S1基因、長度為1 720 bp的傳染性支氣管炎病毒基因序列，隨后進行純化及限制性內切酶處理檢測，發現檢測結果與中和試驗得出的病毒血清分型一致，表明限制性酶切片段長度多態性分析技術可用作雞傳染性支氣管炎病毒診斷。但值得注意的是，雞傳染性支氣管炎病毒會不斷發生變異和進化，因此需要定期更新所用的限制性內切酶。

近年來，其他的分子生物學診斷技術，如環介導等溫擴增技術（LAMP）、核酸探針技術和基因芯片技術等也已被用于雞傳染性支氣管炎病毒的檢測。Wu等[16]將RT-LAMP與橫向流動試紙（LFD）相結合，建立了一種能同時檢測雞傳染性支氣管炎病毒和新城疫病毒的新型檢測方法。趙玉佳等[17]構建了聯合檢測雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒和新城疫病毒的基因芯片，并對芯片的敏感性、特異性及穩定性進行了評價，結果顯示該檢測技術能夠用于臨床病料中上述三種病原的檢測和快速診斷。此外，下一代測序技術最近也被用于研究，盡管目前這種方法對于常規使用來說過于昂貴和費力，但也可實現特定的檢測目的[18]。

4 小結

傳染性支氣管炎嚴重影響到雞的健康生長，為了降低該病的發生率，需做好日常監測和預防，而對該病的準確診斷是有效開展防控的基本保障，具有十分重要的意義。目前，該病的診斷方法除了上述提到的病毒分離鑒定、血清學診斷和分子生物學診斷三種主要方法外，免疫組織化學技術和蛋白芯片技術等也得到了探索和應用。但無論哪種方法都有各自的優勢和缺點，單一一種方法在目前都還難以完全滿足檢測所要求的快速、靈敏、特異、簡便、經濟和實用等。因此，在實際檢測時應該根據需要，結合擁有的實驗條件和操作經驗，選擇最適宜的檢測方法或將不同的方法結合起來應用，以便能夠獲得最好的效果。

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Advances in Diagnostic Methods of Avian Infectious Bronchitis

XIA Liye

（People's Government of Aoqi Town in the Suburb of Jiamusi City， Jiamusi ?154012， China）

Abstract： ?Avian infectious bronchitis is a respiratory infectious disease caused by infectious bronchitis virus. Infectious bronchitis virus （IBV） is highly infectious， which poses a serious threat to the healthy development of chicken industry. The IBV has many serotypes and often mutates， so it is necessary to do a good job in the diagnosis of infectious bronchitis in order to control the spread of the disease. In this paper， several common diagnostic methods of avian infectious bronchitis， such as virus isolation and identification， serological diagnosis and molecular biological diagnosis， were reviewed in order to provide the reference for the diagnosis of the disease.

Keywords： ?Avian infectious bronchitis virus; Virus isolation and identification; Serological diagnosis; Molecular biological diagnosis