基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討沙棘活性成分對(duì)非酒精性脂肪肝作用機(jī)制

高 健，吳勝男，王曉靜，紀(jì)景馨，張 然，程景民*

1.山西醫(yī)科大學(xué)管理學(xué)院，山西 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括脂肪變性、脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化及肝細(xì)胞癌癥的廣泛性系列疾病[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球成人非酒精性脂肪肝病的患病率高達(dá)23%～25%，其中20%非酒精性脂肪肝病病人受脂肪肝炎的影響[2]。現(xiàn)階段，在“二次打擊”學(xué)說(shuō)不斷發(fā)展的基礎(chǔ)上，針對(duì)除脂肪變性、氧化應(yīng)激以外的胰島素抵抗、線(xiàn)粒體功能紊亂、脂質(zhì)毒性等多重平行打擊在致病機(jī)制方面表明，非酒精性脂肪肝病為多種危險(xiǎn)因素的相互作用導(dǎo)致[3-4]。考慮到非酒精性脂肪肝病受基因遺傳、表觀遺傳和環(huán)境暴露等諸多復(fù)雜因素的相互影響，除使用非針對(duì)性藥物治療或接受身體運(yùn)動(dòng)的建議以外[5]，現(xiàn)階段提出的“營(yíng)養(yǎng)遺傳學(xué)”和“營(yíng)養(yǎng)表型基因組學(xué)”，通過(guò)研究飲食暴露與基因組的相互作用，改善臨床與健康營(yíng)養(yǎng)實(shí)踐[5]。同時(shí)，植物提取物的多種活性成分、多種藥理作用在非酒精性脂肪肝病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭姓宫F(xiàn)潛在多靶向效應(yīng)[3]。于是，膳食管理和植物營(yíng)養(yǎng)干預(yù)非酒精性脂肪肝病應(yīng)運(yùn)而生。沙棘果、沙棘葉和沙棘籽包含多糖、多酚和氨基酸等活性物質(zhì)種類(lèi)豐富，藥理作用明顯[6-8]。沙棘葉和沙棘果的提取物抑制糖基化終產(chǎn)物的形成[9]，沙棘油富含的山柰酚可減弱細(xì)胞的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)積累[10]，沙棘汁在抑制炎癥和預(yù)防代謝性綜合征、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[8]。

隨著非酒精性脂肪肝病和沙棘相關(guān)研究的不斷深入，單靶點(diǎn)-單成分的研究模式已無(wú)法完全解釋其治療作用。本研究通過(guò)構(gòu)建多成分-多靶點(diǎn)-多信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)探究沙棘對(duì)非酒精性脂肪肝病的綜合干預(yù)方式，對(duì)非酒精性脂肪肝病的發(fā)病、進(jìn)展以及沙棘活性成分干預(yù)機(jī)制有著重要意義，為后續(xù)進(jìn)一步探索沙棘治療非酒精性脂肪肝病相關(guān)作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 沙棘成分的獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索沙棘主要成分并轉(zhuǎn)化為相關(guān)干預(yù)的蛋白質(zhì)，同時(shí)剔除未檢索到靶點(diǎn)蛋白的成分。參考Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）規(guī)范蛋白質(zhì)名稱(chēng)后將其轉(zhuǎn)化為基因名稱(chēng)（gene symbol）。考慮檢索到的沙棘成分以及成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目較少，且沙棘作為食品可直接食用，故暫不考慮使用常用參數(shù)藥物相似度（DL）、口服生物利用度（OB）等對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾篩除。

1.2 非酒精性脂肪肝差異表達(dá)基因的篩選

在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中選擇表達(dá)譜GSE126848 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集做差異表達(dá)分析。將數(shù)據(jù)矩陣中“健康人群（healthy normal weight）”和“健康肥胖（obese）”作為對(duì)照組，“單純性脂肪變性（NAFL）”和“非酒精性脂肪性肝炎”作為試驗(yàn)組。對(duì)照組與試驗(yàn)組的測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)一為基因名稱(chēng)（gene symbol）后，使用R（4.1.3）“l(fā)imma”包以P＜0.05、|LogFC|≥1 為臨界閾值篩選差異基因并繪制火山圖。其中，數(shù)據(jù)集中體重正常和肥胖受試者顯示正常的肝臟組織學(xué)。

1.3 沙棘影響非酒精性脂肪肝病的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

沙棘成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因與非酒精性脂肪肝病差異表達(dá)的基因在JVENN 在線(xiàn)網(wǎng)站（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制韋恩圖（Venn），其中交集基因即沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病的潛在靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）

將沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 網(wǎng)站（https://cn.string-db.org/）構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（medium confidence：0.4）。將PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖導(dǎo)入Cytoscapev 3.9.0 平臺(tái)可視化并借助Cytohubba 工具計(jì)算Degree 度值。

1.5 基因本體（GO）功能富集與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集

將潛在靶點(diǎn)的gene symbol 使用org.Hs.eg.db R 包轉(zhuǎn)化為Entrez ID 后，clusterprofiler、enrichplot R 包對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）做GO 功能富集和KEGG 通路富集（FDR＜0.05）。篩選BP、CC 和MF 三者富集數(shù)量排序均居前10 位的結(jié)果通過(guò)ggpubr 包繪制GO 功能富集的條形圖。借助ggplot 2 包將KEGG 信號(hào)通路的全部結(jié)果可視化繪制氣泡圖。

1.6 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

沙棘成分、靶點(diǎn)信息和信號(hào)通路的相互關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape（v 3.9.0）平臺(tái)構(gòu)建成分-基因-通路分析網(wǎng)絡(luò)。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證分析

使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鯠egree 算法篩選出前10 個(gè)基因作為核心靶點(diǎn)，并利用RCSB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）、AlphaFold 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://alphafold.ebi.ac.uk/）和TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）獲取10 個(gè)活性分子的三維結(jié)構(gòu)信息。有效成分和經(jīng)PyMOL 2.2.5 去除多余配體的靶點(diǎn)蛋白在AutoDock Tools 1.5.7 軟件分別去除水分子、補(bǔ)全氫分子，選定受體、配體后輸出為PDBQT 文件。調(diào)整靶點(diǎn)蛋白Grid Box 參數(shù)使其對(duì)接范圍包含全部的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。在AutoDock Vina 軟件中完成核心成分與靶點(diǎn)之間的對(duì)接，記錄其親和性并用pheatmap R 包繪制對(duì)接結(jié)果熱圖進(jìn)行分析。沙棘的10 種活性成分與其親和性最高的非酒精性脂肪肝病核心靶點(diǎn)在PyMol 中進(jìn)行分子對(duì)接的可視化。

2 結(jié)果

2.1 沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病潛在靶點(diǎn)的獲取

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到沙棘有效成分223 種，剔除未檢索到靶點(diǎn)的成分和刪除重復(fù)選項(xiàng)后，得到138 種活性成分與574 個(gè)靶點(diǎn)蛋白的關(guān)系信息。GSE126848 測(cè)序數(shù)據(jù)包含健康群體（14 例）、健康肥胖（12 例）、單純非酒精性脂肪變性（15 例）和非酒精性脂肪肝炎（16 例）4 組信息。將對(duì)照組（健康群體和健康肥胖）26 例樣本與試驗(yàn)組（脂肪變形和脂肪肝炎）31例樣本的表達(dá)譜信息轉(zhuǎn)化為13 569 個(gè)基因矩陣信息后，以P＜0.05、|LogFC|≥1 為過(guò)濾條件篩選非酒精性脂肪肝病的差異表達(dá)基因。非酒精性脂肪肝病差異表達(dá)基因共1 188 個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)627 個(gè)，下調(diào)表達(dá)561 個(gè)，采用limma R 包對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行差異分析，代表上調(diào)基因的紅色圓點(diǎn)共627 個(gè)，代表下調(diào)基因的藍(lán)色圓點(diǎn)共561 個(gè)，灰色部分代表的基因被認(rèn)為差異表達(dá)不顯著。詳見(jiàn)圖1。574 個(gè)沙棘靶點(diǎn)與1 188 個(gè)非酒精性脂肪肝病靶點(diǎn)的交集，共61 個(gè)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)。詳見(jiàn)圖2。

圖1 沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病潛在靶點(diǎn)火山圖

圖2 沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病潛在靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

61 個(gè)影響非酒精性脂肪肝病的潛在基因在STRING 網(wǎng)站檢索后蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖見(jiàn)圖3。將網(wǎng)絡(luò)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 平臺(tái)，其中TCF7L1、PCDH12、PDXP、B3GAT1、MAPK8IP2、HS3ST3A1、NT5M、SLC16A6 和CBS 這9 個(gè)靶點(diǎn)基因由于獨(dú)立于主要網(wǎng)絡(luò)關(guān)系暫不納入分析。按照網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲇?jì)算Degree 值排序，選取Degree 值居前10 位的基因（JUN、MMP9、FGF2、VCAM1、CDKN1A、ACE、SERPINE1、SPP1、NOS3、CCNA2）作為核心靶點(diǎn)做深入研究分析，詳見(jiàn)圖4，圖中顏色深淺反映網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鯠egree 關(guān)系強(qiáng)弱。

圖3 沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病潛在靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖（基于STRING 網(wǎng)站）

圖4 沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病潛在靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖（基于Cytoscape 平臺(tái)）

2.3 GO 功能富集與KEGG 通路富集

利用clusterprofiler 包富集61 個(gè)潛在靶點(diǎn)主要的細(xì)胞功能與信號(hào)通路并將其可視化，GO 功能富集主要富集到對(duì)異源刺激反應(yīng)、活性氧反應(yīng)、鎘離子的反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管形成、脈管系統(tǒng)發(fā)展相關(guān)生物過(guò)程，詳見(jiàn)圖5；KEGG 信號(hào)通路主要富集到細(xì)胞周期、p53 信號(hào)通路、動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE 信號(hào)通路、細(xì)胞衰老、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路等信號(hào)通路。詳細(xì)見(jiàn)圖6。

圖5 沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病潛在靶點(diǎn)GO 富集分析柱狀圖

圖6 沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病潛在靶點(diǎn)KEGG 富集分析氣泡圖

2.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

沙棘中62 種活性成分顯示，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子JUN 等61 個(gè)靶點(diǎn)影響干預(yù)非酒精性脂肪肝病的發(fā)展。將基因與信號(hào)通路的關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 平臺(tái)進(jìn)行可視化處理，62 種沙棘成分、61 個(gè)靶點(diǎn)基因、10 條GO 功能富集（生物過(guò)程）和26 條KEGG 信號(hào)通路，共159 個(gè)節(jié)點(diǎn)和表示其相互關(guān)系的387 條邊共同構(gòu)成成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。詳見(jiàn)圖7。

圖7 沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證分析

篩選到的核心基因與主要成分進(jìn)行進(jìn)一步分子學(xué)驗(yàn)證，以研究成分靶點(diǎn)之間具體的結(jié)合分子機(jī)制。核心靶點(diǎn)（JUN、MMP9、FGF2、VCAM1、CDKN1A、ACE、SERPINE1、SPP1、NOS3、CCNA2）與各核心成分[槲皮素（quercetin）、黃酮（flavone）、山柰酚（kaempferol）、亞麻酸（linolenic acid）、異鼠李素（isorhamnetin）、楊梅黃酮（myricetin）、香豆素（coumarin）、熊果酸（ursolic acid）、蘆丁（rhein）、豆甾醇（stigmasterol）]一一進(jìn)行分子對(duì)接，利用pheatmap 包繪制對(duì)接親和性熱圖，詳見(jiàn)圖8。其中，結(jié)合能（Vina 評(píng)分）越低則表示靶點(diǎn)與活性成分對(duì)接后越穩(wěn)定。在Autodock Vina 分子對(duì)接中，配體和受體之間對(duì)接結(jié)果若結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol，則被認(rèn)為是對(duì)接的良好標(biāo)準(zhǔn)品[11-12]。同時(shí)也有經(jīng)驗(yàn)法則（rule of thumb）認(rèn)為，結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol 為結(jié)合力強(qiáng)的體現(xiàn)。沙棘活性成分蘆丁與核心靶點(diǎn)NOS3親和性結(jié)合能=-8.8 kcal/mol 為100 次對(duì)接結(jié)果中親和性最高的組合。分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、黃酮、山柰酚、亞麻酸、異鼠李素、楊梅黃酮、香豆素、熊果酸、蘆丁和豆甾醇共10 種活性物質(zhì)與JUN、MMP9、FGF2、VCAM1、CDKN1A、ACE、SERPINE1、SPP1、NOS3 和CCNA2 10 個(gè)核心靶點(diǎn)有較高親和性。詳見(jiàn)圖9。

圖8 10 個(gè)核心靶點(diǎn)與10 個(gè)核心成分之間的Autodcok vina 對(duì)接親和性熱圖

圖9 沙棘主要活性物質(zhì)與親和性最高的靶點(diǎn)的分子對(duì)接可視化圖

3 討論

在全球流行肥胖的背景下，非酒精性脂肪肝病患病率不斷上升[13]。目前，“多重打擊”解釋非酒精性脂肪肝病發(fā)病過(guò)程中多種可能的平行作用，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是肝損傷和疾病發(fā)展的主要因素[14]。脂類(lèi)代謝紊亂導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累，影響線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和NADPH 氧化酶等活性氧的發(fā)生器，從而影響胰島素敏感性和脂類(lèi)代謝關(guān)鍵酶的活性與表達(dá)[15]。盡管肥胖是非酒精性脂肪肝病公認(rèn)的風(fēng)險(xiǎn)因素，但也有瘦弱個(gè)體的患病報(bào)道[16]。所以在本研究中，GSE126848 數(shù)據(jù)集中14 例正常健康樣本與12 例健康肥胖（肝臟樣本正常）樣本一同納入本研究的對(duì)照組，有效排除單純肥胖對(duì)非酒精性脂肪肝病研究的影響。

由于非酒精性脂肪肝病的多種危險(xiǎn)因素的相互作用，來(lái)自草藥或飲食的天然活性物質(zhì)由于對(duì)應(yīng)的眾多靶點(diǎn)而成為非酒精性脂肪肝病潛在的治療方法[17]。從構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)，不同化合物對(duì)應(yīng)的多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)信號(hào)通路重合，預(yù)測(cè)對(duì)非酒精性脂肪肝病可發(fā)揮協(xié)同干預(yù)作用。槲皮素誘導(dǎo)超氧化物歧化酶（SOD）催化分解反應(yīng)中供氫體谷胱氨肽的合成，從而發(fā)揮清除自由基和活性氧的作用[18]。除此之外，槲皮素還可以通過(guò)激活FXR1/TGR5 信號(hào)通路改善脂質(zhì)代謝[19]，或通過(guò)抑制脂肪酸的從頭合成途徑減少脂質(zhì)積累[20]。山柰酚緩解細(xì)胞中脂質(zhì)儲(chǔ)存和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[21]，介導(dǎo)磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/西羅莫司靶蛋白（mTOR）的磷酸化誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而發(fā)揮對(duì)脂毒細(xì)胞的保護(hù)作用[22]。作為過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）天然配體，異鼠李素通過(guò)抑制受體信號(hào)傳遞改善胰島素抵抗、抑制脂肪細(xì)胞的分化并減輕肝臟的脂肪變性以及纖維化程度[23-24]。

61 個(gè)沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病潛在靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)確定了其中10 個(gè)核心基因參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。轉(zhuǎn)錄因子JUN（transcription factor JUN）在61 個(gè)潛在干預(yù)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋蠨egree度值最高。JUN 識(shí)別激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）特定序列并與之結(jié)合成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，可增強(qiáng)其結(jié)合活性與轉(zhuǎn)錄活性[25-26]。構(gòu)成AP-1 的系列蛋白特別是c-Jun 已被證明在肝臟生物學(xué)和疾病的許多方面起著至關(guān)重要的作用[27]。與對(duì)照組小鼠相比，飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病小鼠在組織陣列和免疫組化分析中JUN 信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)水平及磷酸化水平升高[28]。與正常肝組織相比，非酒精性脂肪肝病病人mRNA 的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，且c-JUN 的表達(dá)與炎性評(píng)分、脂肪變性分級(jí)顯示顯著相關(guān)性[28]。在與JUN靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的多個(gè)沙棘活性成分中，楊梅黃酮與熊果酸通過(guò)抑制可磷酸化激活c-jun 的酶類(lèi)（jun N-terminal kinase，JNK）表現(xiàn)抑制JUN 作用[29-30]。與其他核心基因相比，內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,endothelial NOS3）與沙棘多個(gè)活性成分展現(xiàn)高親和性。內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）介導(dǎo)血管張力并在心血管系統(tǒng)中提供抗炎信號(hào)，而缺乏eNOS 的小鼠線(xiàn)粒體周轉(zhuǎn)和自噬的相關(guān)標(biāo)志物減少，更容易受到西方飲食誘導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化的影響[31]。在篩選的沙棘活性成分中，蘆丁可通過(guò)NOS 介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激和抗炎效應(yīng)[32]，同時(shí)對(duì)卡非佐米（carfilzomib，CFZ）誘導(dǎo)的腎毒性表現(xiàn)出保護(hù)作用[32]，在肝臟相關(guān)研究中也可能有類(lèi)似功效潛力。有統(tǒng)計(jì)學(xué)研究顯示，重塑金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）在內(nèi)臟脂肪組織中表達(dá)增加，且促炎糖蛋白TNC 與MMP9 的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯正相關(guān)[33]。而在本研究中MMP9 受沙棘中槲皮素的調(diào)控表達(dá)同樣在相關(guān)研究中得到驗(yàn)證。槲皮素可降低MMP9、MMP2 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（VEGF-A）的表達(dá)阻止癌細(xì)胞的侵襲和血管形成[34]。MMP9 對(duì)非酒精性脂肪肝病的直接影響相對(duì)較少，仍處于研究更新?tīng)顟B(tài)，但是MMP9 在肥胖癥中的表達(dá)異常或活性改變強(qiáng)調(diào)其在肥胖及相關(guān)肥胖并發(fā)癥的病理生理的參與[33]。

61 個(gè)沙棘干預(yù)非酒精性脂肪肝病的靶點(diǎn)在GO 功能富集中收集到多種生物學(xué)相關(guān)過(guò)程，其中活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等促氧化劑與抗氧化劑之間的平衡維持著細(xì)胞正常生理狀態(tài)下的增殖、分化、遷移和收縮[35]。正常生理狀態(tài)下，基礎(chǔ)水平的ROS 參與氧化還原反應(yīng)信號(hào)的傳導(dǎo)[36]。細(xì)胞通過(guò)分解脂滴回收受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體，抑制氧化應(yīng)激和有害ROS 的生成[37]，維持肝臟功能代謝和能量需求，預(yù)防非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎[38-39]。高脂飲食和脂質(zhì)代謝失調(diào)導(dǎo)致肝游離脂肪酸和三酰甘油的積累[40]。線(xiàn)粒體β 氧化水平降低和脂肪生成增加導(dǎo)致肝細(xì)胞中的脂質(zhì)積累，生成過(guò)多的ROS[39]。除線(xiàn)粒體外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中細(xì)胞色素P450 活性反應(yīng)、微粒體代謝、CHOP 表達(dá)也是ROS 的來(lái)源[41]。ROS 異常生成時(shí)，通過(guò)抑制線(xiàn)粒體呼吸鏈酶、誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化、促進(jìn)促纖維化細(xì)胞遷移，造成肝細(xì)胞的損傷和纖維化[42]。同時(shí)ROS 不利于線(xiàn)粒體自噬對(duì)肝臟的保護(hù)。ROS 誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電位增加不利于線(xiàn)粒體自噬的發(fā)生[43]，不利于凋亡降解維持線(xiàn)粒體功能結(jié)構(gòu)[39]。可見(jiàn)，ROS 參與細(xì)胞多種反應(yīng)過(guò)程，對(duì)維持肝細(xì)胞微環(huán)境非常重要。

除此之外，在KEGG 富集通路中也有豐富的生物信號(hào)通路體現(xiàn)。P53 調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激、代謝和周期，已成為肝臟穩(wěn)態(tài)和功能障礙的重要調(diào)節(jié)劑[44]。P53 參與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)分解，或抑制脂質(zhì)合成蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)控脂質(zhì)積累。但是也有相關(guān)報(bào)道稱(chēng)表示抑制P53 的轉(zhuǎn)錄活性可以降低肝臟脂肪變性相關(guān)的氧化應(yīng)激[45]。其中，P53 與非酒精性脂肪肝病的雙重關(guān)系可能與激活狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)分布和突變相關(guān)[46]。

10個(gè)核心靶點(diǎn)與10個(gè)核心成分之間的Autodcok Vina對(duì)接親和性熱圖顯示，沙棘活性成分與非酒精性脂肪肝病核心靶點(diǎn)親和性幾乎全部結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol，且部分對(duì)接組合結(jié)果結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol 展示高親和性。

沙棘主要的活性物質(zhì)與親和性最高的靶點(diǎn)的分子對(duì)接可視化圖顯示，受體與配體間接觸面積較大，活性分子基本被蛋白分子接觸包繞。除去NOS3 與豆甾醇之間的結(jié)合為疏水作用力，其余核心靶點(diǎn)與活性成分展現(xiàn)高親和性則以親水氫鍵連接。通過(guò)分子對(duì)接親和力熱圖層次聚類(lèi)分析，NOS3、MMMP9、ACE、SERPINE1 和CCNA2 與沙棘活性成分親和力明顯高于其余核心基因而被分為不同模塊。其中NOS3 與眾多沙棘核心成分親和性最高，沙棘成分可能主要通過(guò)與NOS3 的相互作用發(fā)揮抗炎抗非酒精性脂肪肝病功效。與其他沙棘成分相比，熊果酸與多個(gè)核心基因也顯示較高親和性。除熊果酸以外，沙棘中其他種類(lèi)及含量豐富的有機(jī)酸也可能在非酒精性脂肪肝病干預(yù)過(guò)程中發(fā)揮潛在作用。

總而言之，本項(xiàng)目研究GEO 公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)收集非酒精性脂肪肝病的特征基因，并篩選與之對(duì)應(yīng)匹配的沙棘活性成分。研究結(jié)果表明沙棘可通過(guò)多靶點(diǎn)和多通路影響干預(yù)非酒精性脂肪肝病，為以后非酒精性脂肪肝病的相關(guān)病理或藥理研究提供參考。