補骨脂素治療骨關節炎網絡藥理學預測及實驗驗證

王蔚陸 陳建新 朱 姜 梁丁龍 馬彥旭

(1 北京中醫藥大學中醫學院,北京,100029; 2 北京中醫藥大學廈門醫院,廈門,361009; 3 首都醫科大學附屬北京中醫學院,北京,100010)

骨關節炎(Osteoarthritis,OA)是一種不由衰老引起,多受關節軟骨生化改變與生物力學應力影響的退行性關節疾病。中醫有“骨痹、膝痹、膝眼風”的相關記載。“骨痹”最早源于《黃帝內經·素問·長刺節論篇》[1],現代中醫對其病因病機有了更全面的認識,認為素體年邁、骨節虧虛、筋骨失養,外加風寒濕邪侵襲,終致氣血不通,脈絡痹阻[2]。補骨脂又名破故紙、胡韭子[3]。薔薇目,豆科植物成熟果實,出自《雷公炮炙論》。補骨脂素是補骨脂的主要成分,屬于香豆素類化合物,能有效調控細胞因子,尤其是白細胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)通路所介導的滑膜-軟骨交互作用。由于PSO在紫外線燈的照射下可產生光毒反應,有光致敏史的患者、兒童及孕婦應慎用。本文結合李梢教授提出的藥理學的研究方法和評價標準[4-5],以受體或靶點為藥物活性的治療關鍵,探討化合物作用受體機制及特性表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人原代OA滑膜成纖維細胞(貨號:JY-J884,培養體系:1×原代細胞基礎培養基500 mL,4 ℃避光保存;100×原代細胞培養添加劑5 mL,-20 ℃避光保存;終濃度10%胎牛血清50 mL,-20 ℃避光保存;100×青霉素-鏈霉素雙抗混合液(Penicillin-streptomycin Solution,P/S)5 mL,-20 ℃避光保存),人原代OA軟骨細胞(貨號:JY-J905,培養體系:1×原代細胞基礎培養基500 mL,4 ℃避光保存;100×原代細胞培養添加劑5 mL,-20 ℃避光保存;終濃度10%胎牛血清50 mL,-20 ℃避光保存;100×P/S 5 mL,-20 ℃避光保存),以上細胞購自上海瑾原生物科技有限公司,25 mL培養瓶放置在孵育箱中,細胞培養基于碳酸氫鹽的緩沖體系,設置5% CO2氣體環境,維持pH=7.2,溫度37 ℃。

1.1.2 藥物 藥物:補骨脂素(成都瑞芬思德丹生物科技有限公司,批號:RFS-B06502005013)。

1.1.3 試劑與儀器 TransZol Up Plus RNA Kit(TRANS,批號:ER501-01-V2);TransScript? Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TRANS,批號:AU341-02-V2);實時熒光定量PCR試劑盒(康為世紀,批號:CW0659)。凝膠電泳儀(Tanon,型號:EPS600);凝膠成像儀(Peiqing Science and Technology,型號:JS-2012);熒光定量PCR儀(ROCGENE,型號:Archimed-X4);Transwell小室(北京索萊寶生物科技,批號:Corning 3422)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 當原代培養細胞達到85%以上融合時進行消化傳代,將傳至第3代的滑膜細胞(1×104個/mL)和軟骨細胞(8×104個/mL),分別種于Transwell小室的上室和下室,制備滑膜細胞和軟骨細胞共培養體系,共培養4 d。

1.2.2 分組與干預方法 將軟骨細胞-滑膜細胞體系隨機分為補骨脂素低濃度組(1 μmol/L)、補骨脂素中濃度組(8 μmol/L)、補骨脂素高濃度組(50 μmol/L)以及空白對照組(0 μmol/L),共4組,干預48 h,每組留取Transwell小室下室軟骨細胞的3個樣本進行指標檢測。

1.2.3 檢測指標與方法 依據網絡藥理學預測結果,選取IL-17、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和核因子κB作為藥物干預細胞共培養體系的觀測對象,采用實時熒光定量PCR觀察不同濃度補骨脂素對模型細胞中網絡藥理學預測相關信號通路關鍵分子mRNA水平表達量的影響。

1.3 網絡藥理學分析

1.3.1 補骨脂素靶點獲取 通過SymMap2.0(http://www.symmap.org/)平臺檢索化合物靶點[6],中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)以及文獻補充化合物靶點信息,利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)規范靶點名稱。

1.3.2 OA的基因獲取 分別向GeneCards(http://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)等數據庫輸入Osteoarthritis,獲得疾病基因,參考《網絡藥理學評價方法指南》可靠性、規范性和合理性的定義,以相關性大小為依據篩選關鍵基因[4]。

1.3.3 補骨脂素治療疾病核心靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡、生物富集分析和通路分析 將PSO與OA靶點取交集,得到化合物治療疾病的位點。將關鍵靶點導入String(https://string-db.org/)數據庫,獲取蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡,使用Cytoscape繪制模型,節點表示蛋白,線表示相互關系。節點越大,顏色越深越重要。線越粗,顏色越深,聯系越緊密。

使用Metascape(http://metascape.org/)平臺,導入16個靶點,設置種屬為人類,進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析,包含生物過程(Biological Process,BP)、細胞組分(Cell Component,CC)及分子功能(Molecular Function,MF),根據富集系數(Enrichment)大小進行排序,保留排名靠前的結果;使用Cytoscape插件ClueGO進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,Kappa系數選中等,繪制yFiles Tree Layout圖。

1.3.4 病癥結合研究補骨脂素治療作用 首先下載補骨脂素化合物(Ingredients)相關的草藥(Herb)、疾病(Disease)、中醫證候(Traditional Chinese Medicine Syndrome,TCM Syndrome)、現代醫學癥狀(Modern Medicine Symptom,MM Symptom)和綜合征(Syndrome)板塊;其中Disease內容較多,使用“炎、痛、骨、關節、脊、椎”為關鍵詞篩選OA相關疾病。

然后下載OA疾病相關的TCM Syndrome、MM Symptom和Syndrome板塊。

最后將PSO和OA二者對應的TCM Syndrome、MM Symptom和Syndrome板塊條目取交集,建構PSO和OA之間的聯系。確定核心Syndrome和TCM Syndrome后,下載其對應的草藥Herb,用Cytoscape軟件繪制化合物-草藥-癥狀體征圖(Ingredients-herb-syndrome/TCM Syndrome)。黃色圓形節點表示PSO,粉色菱形節點表示OA患者的Syndrome,橘黃菱形節點表示OA患者TCM Syndrome,中草藥用藍方形節點表示,其中深藍方形節點代表核心中藥。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism5.0統計軟件進行數據統計,采用單因素方差分析進行組間差異比較,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補骨脂素治療OA的靶點選取 藥物方面,涉及26個PSO靶點,結合TCMSP及文獻報道補充靶點,共計27個。疾病方面,獲得靶點741個,最后將27個PSO靶點與741個OA靶點取交集,得到16個PSO精準治療OA的靶點。

2.2 共有靶點PPI網絡建構 PSO治療OA靶點的PPI網絡共涉及15個節點,46條邊,獨立節點EFEMP1未納入網絡,剩余15個節點按節點間聯系次數由高到低排序,依次為TNF、FOS、ESR1、MMP9、TGFB1和NFKB1,其中TNF和NFKB1與炎癥相關,且關系緊密。見圖1。

圖1 補骨脂素治療骨關節炎PPI網絡

2.3 共有靶點生物富集與通路分析 PSO治療OA靶點生物過程顯示細胞生物過程于骨和軟骨的分化發育(Osteoblast Differentiation and Development)有關,細胞成分主要作用于介導免疫炎癥發生發展的髓系白細胞(Myeloid Leukocyte),通過調控類固醇激素合成(Steroid Biosynthetic)的分子功能發揮抗炎作用。見圖2。Cytoscape插件ClueGO富集出6個通路,主要包括破骨細胞分化通路(軟骨下骨組織的異常改變),IL-17通路,TNF信號通路以及催乳素通路。見圖3。

圖2 補骨脂素治療OA靶點生物過程、細胞成分與分子功能結果圖

圖3 補骨脂素治療OA靶點的通路富集分析

2.4 病癥結合分析 SymMap共有21種含PSO的藥物。見表1。14條PSO相關的骨傷科疾病。見表2。PSO對應101條TCM symptom,20條MM symptom,常見詞匯Sputum和Pain,7條syndrome。OA(按部位分為髖、膝、脊柱)對應174條TCM symptom,18條MM symptom,常見詞匯Pain,46條syndrome。二者取交集后得到6條TCM Syndrome和1條syndrome。見表3。

表1 常見含有補骨脂素化合物的中草藥

表2 補骨脂素有關的骨傷科疾病

表3 補骨脂素對癥治療綜合征和中醫證候

化合物-草藥-癥狀體征圖包含71個節點,78條邊。結果顯示“風”“寒”挾“濕”雜合而為痹(骨關節炎),其中核心藥物有骨碎補、蛇床子、獨活和補骨脂。見圖4。

圖4 補骨脂素治療OA化合物-草藥-癥狀體征圖

2.5 細胞實驗結果 與空白對照組比較,補骨脂素低濃度組IL-17和核因子κB的擴增倍數有所升高(均P<0.01);補骨脂素中濃度組IL-17和TNF-α有所下降(均P<0.01);補骨脂素高濃度組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 補骨脂素干預共培養體系mRNA擴增倍數(n=3)

3 討論

3.1 病癥與中草藥化合物 補骨脂素又叫補骨脂內酯、制斑素,屬呋喃香豆素類,近年研究顯示其在骨傷科疾病方面有潛在應用價值。病癥結合領域,中醫認為補骨脂素主治的OA屬于風寒挾濕的痹癥。首先,針對疼痛走注不定為特征的行痹,中醫認為與“風”有關。風為百病之長,寒濕等常依附風侵犯人體,其中以風寒、風濕最為常見。內因為衛陽不固,腠理空虛。而以肢體骨節疼痛酸困、痛處不移的著痹,中醫多認為與“濕”有關。外濕內濕,同氣相求,常相互引動,病位主要在肢體、經絡、關節。病久不愈,內侵筋骨血脈,復感于邪,累及心腎。針對疼痛較甚,痛有定處,筋骨攣痛的寒痹,中醫認為寒則凝塞,不通則痛,主張溫經散寒,由于風寒濕痹與炎癥疼痛密切相關,現代理論研究提出了津液不歸正化,痰濕內蘊的學說,借助西醫免疫炎癥的具體機制,闡述中醫痰濕致病的理論,使“無形之痰”更為直觀,中醫治法強調溫化以去除水濕痰飲。證候學研究更是印證了二者的緊密聯系,理法方藥環環相扣,渾然天成。另外中醫藥有著鮮明的辨證論治色彩,東西方文化在證候改觀和病因祛除的認知上存在差異,從祛除致病因素的角度,做好鑒別診斷至關重要,而從緩解癥狀角度出發,不同疾病有時可以存在相似的表征,所以中醫又有異病同治的原則[7]。

3.2 疾病與基因 本節我們重點介紹上游的IL-17通路相關基因。

首先,IL-17屬于一種重要的炎癥介質[8],參與多種炎癥反應及自身免疫性疾病的病理過程,下游介導核因子κB等通路,與炎癥關系明確。其次,IL-17可誘導滑膜細胞、巨噬細胞、軟骨和骨細胞分泌TNF-α等因子,TNF可能與受體結合,由巨噬細胞分泌,通過去磷酸化損害關節炎患者的調節性T細胞(Regulatory T Cells,Treg Cells)能力。上述因子導致關節炎的驟然發作,通過IL-17維持Th17細胞(Helper T Cell 17,Th17 Cell)的數量,形成正反饋,維持慢性炎癥狀態,刺激多種趨化因子(Chemokines)產生,其中包括CXCL家族和CC家族,CXCL 1、CXCL2、CXCL8和CCL20、CCL2與CCL7。

以上因子將淋巴細胞、巨噬細胞與粒細胞招募到滑膜加重其炎癥,骨與軟骨大量損傷會導致關節內難逆性變形,IL-17通過誘導可降解胞外基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)參與此過程。破骨細胞通過碳酸酐酶酸化,幫助骨基質溶解成為水、鈣離子和其他物質。質子泵以高濃度梯度泵送氫離子,特化的液泡ATP酶能夠釋放多種水解酶,比如MMP和組織蛋白酶,以消解基質,尤其是軟骨下骨基質的有機成分。其中MMP9由破骨細胞表達,與骨微環境有關,是破骨細胞遷移所必需的一種強大明膠酶。破骨細胞分化受到其護骨因子(Osteoprotegerin,OPG)抑制,它由成骨細胞產生并與核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator for NF-κB Ligand,RANKL)結合,阻止與RANK的作用。基于以上機制,IL-17既可增強炎癥,又能刺激破骨細胞分化導致骨與軟骨的異常改變,如破骨細胞數量減少、骨硬化及其吸收減少[30]。

此外IL-17與TNF-α等協同放大其炎癥效應,其中與TNF-α配合形成正反饋環路,加重局部反應,關節炎患者血清和關節液中IL-17顯著升高,IL-17是炎癥反應和免疫偏移的重要調節因子,可促進TNF-α等炎癥介質的分泌,破壞軟骨穩態,促進滑膜浸潤,與關節炎嚴重程度成正比[10]。IL-17不僅反映全身炎癥狀態,同時調控關節內局部炎性微環境。二者間的交互傳遞極有可能刺激下游靶向核因子κB通路,而作為促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPKs)信號級聯,其過度激活可加劇關節軟骨結構及功能障礙與軟骨下骨重塑異常[12]。最后IL-17可通過環氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)誘導前列腺素擴血管作用,促進炎癥細胞進入病變部位,吞噬免疫復合物,釋放溶酶體,包括膠原酶和中性蛋白酶,破壞膠原彈力纖維,使滑膜表面及關節軟骨損傷[9]。IL-17還可以誘導RANKL表達,促使破骨細胞分化,RANKL是TNF家族成員,基因敲除小鼠可表現出骨硬化以及破骨細胞缺失的表型,RANKL通過RANK激活核因子κB,近年開發的RANKL抑制劑(地舒單抗)在預防骨質疏松,抑制關節炎性病變上也顯示出了良好前景[11]。

另外部分基因從不同角度干預病程,乙酰膽堿酯酶(Acetylcholine Esterase,ACE)通過快速水解釋放到突觸間隙中的乙酰膽堿終止神經肌肉接頭處的信號轉導,從而調節免疫炎癥反應[13]。單胺氧化酶A(Monoamine Oxidase A,MAOA)優先氧化生物胺,其代謝(合成、儲存、釋放和滅活)異常是導致疼痛的主要原因。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)可使組織免受活性氧中間體毒害,OA中氧化應激可致滑膜炎癥和局部關節內病變[14]。

最后我們嘗試解釋男女性別分布差異原因,高雌激素水平所致疾病的女性,及肥胖、藥物等因素所致男性雌化的患者,OA臨床癥狀更嚴重。通過對OA患者臨床特點及中醫證型分布流行病學調查研究發現,無論何種中醫證型,一般女性多于男性,提示雌激素在OA病理進程中發揮作用[15-16,29]。不同性別患者在疼痛、滑膜炎癥、骨贅形成、軟骨退變以及軟骨下骨硬化方面存在差異。澳大利亞一項研究顯示女性患者軟骨損失率更高,差異在40歲時顯現,并隨年齡增長越發明顯[17]。動物研究表明雌性大鼠比雄性滑膜炎癥、軟骨破壞和軟骨下骨質退化表現更嚴重,對刺激更敏感,滑膜周圍巨噬細胞浸潤更廣泛,這是女性疼痛程度更高的原因[18-19]。與男性OA軟骨細胞相比,女性OA細胞雌激素受體表達較高,相關白細胞介素mRNA水平更高[20]。研究顯示PSO與雌激素受體結合,具有植物類雌激素樣作用,發揮抗炎作用,該效應可被雌激素受體抑制劑逆轉[21-22]。但是考慮疾病在性別分布上的差異,參考類固醇激素代謝及負反饋調節,我們提出了PSO可能存在類雌激素樣的作用,而非雌激素本身的假設,同時我們猜想PSO的類雌激素樣作用,與雌激素本身存在明顯不同,它可與雌激素競爭受體,同時加速了雌激素向糖皮質激素方向轉化,發揮抗炎作用。實驗研究也顯示中等濃度補骨脂素的確有效降低OA患者軟骨-滑膜細胞共培養體系IL-17和TNF-α的水平。

3.3 疾病與通路 骨細胞和破骨細胞的綜合作用在維持OA患者軟骨下骨量方面發揮重要作用。從骨軟骨交界處形成“骨-軟骨-鈣化軟骨”的三明治結構可以發現骨質硬化、纖維化與疏松并存,提示骨代謝異常,雙向軟骨病理性鈣化始于軟骨表面纖維化區域,有研究發現補骨脂素可以增加骨密度,用于治療骨質疏松和OA軟骨下骨組織流失,同時抑制軟骨病理性鈣化,以維持正常骨組織生理結構,體現了藥物干預后機體的自我調節能力增強。通路富集還顯示催乳素途徑和利什曼病較顯著,二者分別對應類風濕性關節炎和原蟲性關節炎;脾腎陽虛的潰瘍性結腸炎患者,常出現五更泄瀉,四神丸是治療本病的經典方劑,但是與OA關系不緊密,并非研究重點。本節著重將其和IL-17炎癥通路關聯進行分析。

再吸收的骨表面可發現破骨細胞,它是一種大的多核細胞,可有幾十個細胞核,特點為粗面內質網稀疏,高爾基體廣泛,主要表達破骨細胞蛋白[23]。骨骼中的破骨細胞位于骨表面凹坑的豪息潑氏陷窩(Howship Lacuna)。破骨細胞胞質具有均勻泡沫樣外觀,這利于液泡填充酸性磷酸酶溶酶體。骨吸收活躍部位,破骨細胞形成廣泛折疊或起皺的專有邊界,通過增加細胞膜表面積來分泌和吸收區室內容物,促進骨的去除。另外分泌酸和膠原酶,在分子水平上消解吸收水合蛋白與礦物質,破骨細胞影響骨基質再吸收、無機成分溶解及骨基質有機成分消化,能夠將氫離子泵入亞破骨細胞室制造酸性微環境,增加礦物質溶解度,致使礦物質釋放入破骨細胞胞質,最終轉運至鄰近毛細血管。礦物質去除后,膠原酶和明膠酶被分泌到亞破骨細胞隔室中,消化、降解、脫鈣基質膠原蛋白與有機成分,其產物在褶皺邊緣被破骨細胞吞噬。具有吞噬特性可以認定其屬于單核吞噬細胞系統的一部分,激素與細胞因子可調控其活性。

IL-17屬于前炎癥介質,調節炎癥反應和免疫偏倚,含6個家族成員與5種受體[24]。IL-17來源于活化的肥大細胞和Th17細胞,通過血管浸潤關節滑膜。軟骨細胞及成纖維細胞樣滑膜細胞表面均存在IL-17受體[25]。研究表明OA進程中T細胞直接對軟骨和成纖維細胞膜抗原產生細胞免疫反應。關節炎患者的血清和滑液中IL-17水平較對照組顯著升高,其能夠抑制軟骨細胞合成蛋白多糖,促進MMPs產生,與影像學呈現正相關,不僅如此,部分人群中基因IL-17多態性與關節炎發展的易感性相關[26-27]。作為前體,IL-17可通過核因子κB通路引發炎癥反應,IL-17通過與細胞表面的IL-17受體特異性結合,激活激酶引起磷酸化[28]。與空白對照組比較,中等濃度補骨脂素可以使OA患者軟骨-滑膜細胞共培養體系中的IL-17、TNF-α顯著下降,對于抑制OA癥進展具有重要意義,另外核因子κB無顯著變化,仍需擴大樣本做進一步驗證。

總之,上述細胞實驗結果和分析符合中等劑量補骨脂素治療OA的網絡藥理學預測結果,為進一步研究提供了有力依據。

利益沖突聲明:本研究不涉及利益沖突。