超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定草莓中咯菌腈和異菌脲殘留量

趙圣英，高祥文，于建壘，劉同金，梁 慧，房 鋒*，李瑞娟*

（1.山東仕邦農化有限公司，濟南 250100；2.山東省農業科學院植物保護研究所，濟南 250100）

咯菌腈（Fludioxonil），化學名稱為4-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧-4-基)吡咯-3-腈，屬于觸殺性苯基吡咯類殺菌劑，其作用機理主要通過抑制分裂蛋白活化激酶/組氨酸激酶活性，影響真菌分生孢子萌發、芽管伸長及菌絲生長，可以防治小麥、玉米、蔬菜等作物的大部分真菌病害[1-2]。異菌脲（Iprodione），化學名稱為3-（3，5二氯苯基）-1-異丙基氨基甲?；覂弱ｋ?，是一種高效、廣譜的二甲酰亞胺類觸殺型殺菌劑，兼具保護和治療作用，其作用機理是抑制蛋白激酶，控制許多細胞功能的細胞內信號，抑制真菌孢子的萌發、產生和菌絲生長，主要用于防治草莓、葡萄、馬鈴薯等作物的灰霉病、早疫病、黑斑病等真菌病害[3]。

目前，咯菌腈和異菌脲殘留檢測分析方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質譜聯用法、液相色譜法、液相色譜串聯質譜法等，基質主要包括黃瓜、葡萄、番茄、桃等[4-13]，但同時分析草莓中咯菌腈和異菌脲殘留的方法尚未見報道。本研究首次建立了咯菌腈和異菌脲在草莓中同時測定的方法，該方法具有操作簡便、準確度和精密度高、線性關系良好等特點，為咯菌腈和異菌脲在草莓中的殘留降解規律研究、風險評估及安全使用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑

咯菌腈標準品（純度99.7%）、異菌脲標準品（純度99.3%），上海安譜璀世標準技術服務有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），美國TEDIA公司；硫酸鎂（分析純）、氯化鈉（分析純）、檸檬酸鈉（分析純）、檸檬酸二鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；PSA（N-丙基二胺，40～60 μm）、GCB（石墨化碳黑，120～400目），博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器

Waters Hclass/xevo TQD超高效液相色譜-三重串聯四極桿質譜聯用儀，沃特世科技（上海）有限公司；ME204萬分之一電子天平、ME802百分之一天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；Heraeus Multifuge X1R離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；UMV-2漩渦混合器，北京優晟聯合科技有限公司。

1.3 試驗材料

草莓品種為‘甜寶’，山東省農業科學院濟陽試驗示范基地。

1.4 樣品前處理

準確稱取10.0 g草莓漿液（精確至0.1 g）于50 mL塑料離心管，加入10 mL乙腈，4 g硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，加入陶瓷均質子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min后，4 200 r/min離心5 min，取5 mL上清液加入含有885 mg硫酸鎂，150 mg PSA，20 mg GCB的15 mL離心管中，渦旋混勻1 min，4 200 r/min離心5 min，吸取上清液經0.22 μm濾膜過濾，用超高效液相色譜-三重串聯四極桿質譜聯用儀測定。

1.5 儀器分析條件

（1）液相色譜條件。色譜柱為ACQUITY UPLCBEH（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫為35℃；進樣量為4 μL，流動相A、B分別為乙腈和0.1%甲酸水溶液；流速為0.4 mL/min；采用梯度洗脫模式，洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫參數

（2）質譜條件。采集類型為多重反應監測MRM；離子源為電噴霧離子源ESI；掃描方式咯菌腈為負離子，異菌脲為正離子；毛細管電壓為E＋/2.5 kV，E-/1.5 kV；離子源溫度為150℃；霧化氣體為氮氣；霧化器壓力＜0.690 MPa；撞氣體類型為氬氣?？┚婧彤惥宓馁|譜參數見表2。

表2 MRM 模式下咯菌腈和異菌脲質譜參數

1.6 標準溶液的配制

分別稱取咯菌腈標準品0.010 2 g、異菌脲標準品0.010 4 g（準確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成質量濃度為102 μg/mL咯菌腈標準母液、104 μg/mL異菌脲標準母液，于-6℃避光保存。母液用甲醇分別配制成100.0、10.0、1.0 mg/L的混合標準溶液。用草莓空白基質配制1.0、0.3、0.1、0.03、0.01mg/L的系列混合基質標準工作溶液。

1.7 添加回收率試驗

GB 2763—2021規定咯菌腈在草莓中的最大殘留限量為3 mg/kg[14]，CAC規定異菌脲在草莓中的最大殘留限量為10 mg/kg[15]，根據NY/T 788—2018《農作物中農藥殘留試驗準則》[16]的要求，在草莓空白樣品中添加0.01、0.3、3.0 mg/kg質量分數的咯菌腈，0.01、0.3、10.0 mg/kg質量分數的異菌脲，每個加標量平行測定5次，采用1.4樣品前處理方法和1.5儀器分析條件進行檢測，計算加標回收率和變異系數。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑、凈化方法的選擇

國內對咯菌腈和異菌脲殘留檢測的樣品前處理，多采用乙腈、二氯甲烷等提取，固相萃取法（SPE）和QuEChERS法凈化，固相萃取法凈化多采用Florisil小柱，QuEChERS法凈化多采用PSA和無水硫酸鎂。本試驗過程中，采用乙腈作為提取溶劑，咯菌腈和異菌脲回收率為83%～105%，乙腈相對二氯甲烷后續凈化簡便，故采用乙腈作為草莓中咯菌腈和異菌脲的提取溶劑。

以草莓空白樣品為基質，添加0.3 mg/kg的咯菌腈和異菌脲標準溶液，采用乙腈提取。當不添加凈化劑時，咯菌腈回收率為106%～111%，相對標準偏差（RSD）為1.9%；異菌脲回收率為97%～108%，RSD為3.1%。從表3可知，不同用量的PSA對咯菌腈和異菌脲的回收率差異不大，但當添加量為150 mg時，咯菌腈和異菌脲的RSD最小。隨著GCB用量的增加，凈化液顏色逐漸變淺，當其用量為20 mg時，凈化效果較好，減少了草莓基質對咯菌腈和異菌脲定性和定量的影響，咯菌腈和異菌脲回收率分別為99%～108%和93%～104%，回收率符合農作物中農藥殘留試驗準則的要求。綜合考慮，試驗選擇乙腈提取，150 mg PSA，20 mg GCB對樣品進行凈化。

表3 不同量PSA 和GCB 對咯菌腈和異菌脲回收率的影響

2.2 質譜和色譜條件優化

分別在電噴霧正離子模式和負離子模式下，對1 mg/L的咯菌腈標準溶液和1 mg/L異菌脲標準溶液進行全掃描，確定待測物的母離子和電離方式，調節毛細管電壓和錐孔電壓，使母離子信號最強，使用Waters TQD MS手動調諧分析，優化各子離子的碰撞能量等質譜參數，選擇2個信號強度較強的子離子作為定性離子，離子豐度最強的子離子作為定量離子。結果表明，在負離子模式下，咯菌腈的［M-H］-信號強度比正離子模式下的［M＋H］＋強，在正離子模式下，異菌脲的［M＋H］＋信號強度比負離子模式下［M-H］-的強。綜合考慮，試驗選擇負離子模式下測定咯菌腈，正離子模式下測定異菌脲，質譜參數見表2。

試驗比較了流動相分別為甲醇/水、乙腈/水和乙腈/0.1%甲酸水對咯菌腈和異菌脲的色譜峰形及離子化效率的影響。結果表明，乙腈為有機相時，待測物峰形尖銳對稱，無拖尾，且離子化效率高，優于甲醇，以0.1%甲酸水為無機相時，進一步改善峰形，異菌脲的離子化效率提高，咯菌腈的離子化效率有所降低，綜合考慮，最終確定優化后的流動相梯度條件見表1。

2.3 標準曲線

在1.5所述的液相色譜質譜條件下，對0.01、0.03、0.1、0.3、1.0 mg/L系列濃度的咯菌腈和異菌脲基質標準溶液分別進樣，得到相應的響應值。以溶液質量濃度為橫坐標，以其相應的峰面積為縱坐標作圖，在0.01～1 mg/L范圍內，咯菌腈的標準曲線為y=15 002.5x＋38.39，相關系數為0.99 52，異菌脲的標準曲線為y=64 025.2x＋181.65，相關系數為0.998 8，說明咯菌腈和異菌脲在上述濃度范圍內質量濃度與峰面積具有良好的線性關系。

2.4 方法的準確度、精密度和定量限

結果表明（表4）：添加水平為0.01、0.3 mg/kg和3 mg/kg時，咯菌腈在草莓中的平均回收率為83%～105%，相對標準偏差為2.0%～12.1%；添加水平為0.01、0.3 mg/kg和10 mg/kg時，異菌脲在草莓中的平均回收率為93%～101%，相對標準偏差為4.9%～9.4%。其準確度及精密度均滿足農藥殘留分析與檢測標準要求。通過添加試驗可知，咯菌腈和異菌脲在草莓中殘留分析方法的定量限（LOQ）為0.01 mg/kg，符合《農作物中農藥殘留試驗準則》的要求。

2.5 實際樣品分析

50%咯菌腈·異菌脲懸浮劑在草莓上的殘留試驗樣品56份，利用本方法進行檢測。結果表明，處理區草莓樣品中咯菌腈殘留量為0.021～0.18 mg/kg，異菌脲殘留量為0.22～1.87 mg/kg，對照區樣品咯菌腈、異菌脲殘留均未檢出。因此，咯菌腈殘留量低于GB 2763—2021規定的MRL值3 mg/kg[14]，異菌脲殘留量低于CAC規定的MRL值10 mg/kg[15]。

3 結論

本研究以乙腈為提取溶劑，通過對樣品前處理凈化方法、色譜和質譜條件進行優化，首次建立了草莓中同時檢測咯菌腈和異菌脲殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法?？┚嬖诓葺械钠骄厥章蕿?3%～105%，相對標準偏差為2.0%～12.1%，異菌脲在草莓中的平均回收率為93%～101%，相對標準偏差為4.9%～9.4%。該方法操作簡便，靈敏度、準確度、精密度均符合《農作物中農藥殘留試驗準則》的要求，為咯菌腈和異菌脲在草莓中殘留量的同時測定提供理論參考和技術支持。