丹參酮IIA保護膿毒癥誘發腸屏障功能障礙的作用及機制

王希 馮丹丹 潘思旭 邢茜 夏國蓮 江榮林

膿毒癥為臨床常見的危重病癥，是人體對感染反應失調而致危及生命的器官功能障礙，具有較高的發生率和死亡率［1］。腸屏障功能與膿毒癥密切相關［2］，腸屏障包括機械屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障，正常生理狀態下腸屏障能保護機體免受腸內微生物及外界病原體的入侵，維持機體正常運轉［3］。然而在膿毒癥的病理狀態下，腸屏障結構和功能發生變化，腸道內的細菌和毒素突破屏障進入其他器官或血液，刺激炎癥因子釋放，影響胞間緊密連接蛋白的表達，改變腸上皮細胞通透性，加重患者病情，甚至出現多器官衰竭［4-5］，因此，通過保護腸屏障功能治療膿毒癥具有重要的臨床意義。丹參酮IIA 具有抗氧化、抗炎等作用，目前用于治療心血管疾病、腎缺血再灌注損傷、肝病等［6-8］，同時丹參酮IIA 還能通過發揮抗炎作用保護膿毒癥小鼠神經損傷［9］，緩解膿毒癥小鼠急性肺損傷［10］。本研究采用LPS 誘導人腸上皮細胞株Caco2 構建膿毒癥細胞模型，檢測丹參酮IIA 對腸上皮細胞緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1 及炎癥因子IL-17A、IL-17C 的影響，同時檢測細胞外信號調節激酶（ERK）蛋白的表達水平及磷酸化程度，闡明丹參酮IIA 對膿毒癥模型緊密連接蛋白的作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人結直腸腺癌細胞株Caco2，購于武漢普諾賽。Caco2 細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養液中，培養箱條件為37℃、5% CO2，待其生長密度為80%~90%時進行傳代。

1.2 主要試劑 丹參酮IIA（Solarbio，北京，ST8020），脂多糖（LPS）（SIGMA，美國，L2880），DMEM 培養基（GIBCO，美國，11995065），胎牛血清（FBS）（GIBCO，美 國，10270106），Trizol（Invitrogen， 美 國，1596-026），FITC-右旋糖酐（SIGMA，美國，53379），逆轉錄試劑盒（Fermentas，加拿大，K1622），SYBR Green PCR 試劑盒（Thermo，美國，K0223），引物均由上海生工生物工程有限公司合成。ZO-1 抗體、Occludin 抗體、Claudin-3 抗體、ERK 抗體、p-ERK 抗體、JAM 抗體均購自Affinity Biosciences（親科，江蘇），GAPDH 抗體（Abcam，英國，ab37168），辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（碧云天，江蘇，A0208）。

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養箱（SANYO，MCO-15AC），酶標儀（Thermo，MULTISKAN MK3），熒光定量PCR 儀（ABI 公司，ABI-7300），垂直電泳儀（Bio-Rad，014BR），倒置顯微鏡（Carl Zeiss，Axio Vert.A1），臺式冷凍高速離心機（Eppendorf，5430R），凝膠成像儀（Bio-Rad，ChemiDoc XRS+System）。

1.4 通透性檢測 在Transwell 上室加入80 μL Matrigel（4 μg/uL），37 ℃ 放置30 min 使其聚合成凝膠。調整細胞濃度至5×104個/mL，取200 μL 細胞懸液加入Transwell 上室，待細胞長滿后，在上室中加入FITC 標記的葡聚糖和不同濃度LPS，下室加入500 μL含10% FBS 的DMEM 培養液。于LPS 處理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h 后，吸取下室100 μL 液體到96 孔板中，測量FITC 的OD 值，計算各組細胞的通透率。

1.5 Western Blot 檢測 收集各處理組細胞，經PBS洗滌后加入RIPA 裂解液，充分裂解后收集裂解液，12,000 r/min 離心15 min，取上清液即為細胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。配制10%濃度的分離膠和5%濃度的濃縮膠，以蛋白上樣量為20μg/孔進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后采用PVDF 膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，孵育一抗ZO-1，Occludin，Claudin-3，ERK，p-ERK，JAM，4℃搖床震蕩孵育過夜。TBST 洗膜3 次，10 min/次，隨后室溫孵育二抗1 h，經TBST洗膜3 次后，ECL 發光液顯影，凝膠成像儀進行曝光。

1.6 RT-PCR 檢測 采用Trizol 法提取細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄成cDNA，隨后用SYBR Green PCR 試劑盒進行擴增，IL-17A 上游引物（5’-TGTGATCTGGGAGGCAAAGT-3’），IL-17A 下游引物（5’-CCCACGGACACCAGTATCTT-3’），IL-17C上游引物（5’-GACCGCTATCCACAGAAGCT-3’），IL-17C 下游引物（5’-GACGTGGATGAACTCGGTGT-3’），反應條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，40 個循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.7 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件。所有實驗均重復3 次，計量資料用t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS 誘導腸上皮細胞構建膿毒癥腸屏障損傷模型 腸上皮細胞Caco 2 經100 μg/mL LPS 處理后，分別在不同時間段檢測細胞通透性，結果顯示，經LPS 處理3 h 后Caco2 細胞通透率較對照組顯著上升（P<0.01），見圖1。其在3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 及72 h 的通透率分別為208.58%、280.99%、393.15%、535.63%、817.27%、1062.63%。不同濃度0、0.1、1、10、50、100 及200μg/mL 的LPS 處理Caco2 細胞3 h 后，檢測緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 及Claudin-1 表達水平，結果顯示0、0.1、1、10、50 μg/mL 的LPS 對ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表達水平無影響（P>0.05），而100、200 μg/mL 的LPS 能顯著抑制ZO-1、Occludin及Claudin-1 的表達（P<0.05）。見圖2。Caco2 細胞經100 μg/mL LPS 處理不同時間后，其緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表達水平在1 h 內無顯著變化（P>0.05），在3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h均顯著下降，且隨著時間的延長呈依賴性下降。因此，本研究采用100μg/mL LPS 處理3 h 構建膿毒癥腸屏障功能障礙細胞模型。

圖1 LPS在不同時間點對Caco2細胞緊密連接蛋白的影響

圖2 不同濃度LPS影響Caco2細胞緊密連接蛋白的表達

2.2 丹參酮IIA 對腸黏膜緊密連接蛋白的影響 與正常對照組相比，模型組中LPS 能顯著抑制Caco2 細胞緊密連接蛋白的表達（P<0.05），經0.14、0.68、3.4 μmol/L 的丹參酮IIA 處理后，ZO-1、Occludin 及Claudin-1 蛋白表達水平較LPS 組均上升（P<0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度TAN IIA對LPS處理后的Caco2細胞緊密連接蛋白表達的影響

2.3 丹參酮IIA對Caco2炎癥因子的影響 與正常對照組相比，LPS 能顯著升高Caco2 細胞炎癥因子IL-17A 及IL-17C mRNA的水平（P<0.01），而經丹參酮IIA處理后，IL-17A 及IL-17C mRNA 表達水平顯著下降（P<0.05）。見圖4。

圖4 LPS及丹參酮IIA處理對Caco-2細胞中IL-17A和IL-17C表達的影響

2.4 丹參酮IIA 通過p-ERK 調節緊密連接蛋白的表達 與正常對照組相比，LPS 組、丹參酮IIA組、LPS+SLIGRL-NH2 組、LPS+TBHQ 組、 丹 參 酮IIA+SLIGRL-NH2 組及丹參酮IIA+TBHQ 組ERK 蛋白表達水平無顯著變化，而p-ERK 即ERK 的磷酸化水平有變化。LPS 處理后，Caco2 細胞的ERK 磷酸化水平顯著上升（P<0.01），丹參酮IIA 能顯著抑制該過程，加入ERK 激動劑TBHQ 或PAR2 激動劑SLIGRL-NH2 可以抑制丹參酮IIA對Caco2細胞ERK磷酸化水平的下調作用，見圖5。LPS 可下調Caco2 中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 及JAM 蛋白表達水平，而丹參酮IIA 處理可使緊密連接蛋白的表達水平恢復，ERK 激動劑TBHQ 或PAR2 激動劑SLIGRL-NH2 則可抑制丹參酮IIA 對LPS誘導下Caco2 細胞中ZO-1、Occludin 及JAM 蛋白表達的恢復作用，見圖6。

圖5 TAN IIA 處理對LPS誘導下ERK信號通路的影響

圖6 丹參酮IIA 對LPS誘導下Caco2細胞中緊密連接蛋白表達影響

3 討論

膿毒癥與腸屏障功能障礙密切相關，膿毒癥不僅引起細胞凋亡、壞死，同時感染促進機體釋放大量炎癥因子，損傷黏膜上皮，增加腸屏障通透性［11］，從而加速膿毒癥進展，最終導致多器官衰竭。目前關于膿毒癥的治療方法不斷發展，但嚴重膿毒癥患者的死亡率仍然居高不下。丹參酮IIA 具有抗氧化、抗炎、抗凝血、擴張血管、調節免疫等功能［12］，在緩解膿毒癥腸屏障功能障礙方面具有巨大潛力。

腸上皮細胞和胞間緊密連接蛋白形成機械屏障，腸上皮細胞主要進行營養物質代謝，維持腸道內環境平衡［13］，胞間緊密連接蛋白包括ZOs、Occludin、Claudin-1和JAMs［14］，連接填充腸上皮細胞間的縫隙，因此緊密連接蛋白表達異常將影響腸黏膜通透性。

大量文獻報道，在膿毒癥腸屏障功能障礙動物模型中，緊密連接蛋白ZO-1 及Occludin 的表達水平下降，細胞間隙擴大，導致腸屏障通透性增大，而改善緊密連接蛋白表達則能有效緩解腸屏障功能障礙［15-16］，研究者在結腸炎小鼠模型中發現增加ZO-1 和Occludin 的表達，能調節腸屏障通透性，修復腸屏障功能［17］，同時，任何感染或嚴重創傷等引起腸道屏障穩態改變，進而破壞腸道緊密連接蛋白，增加上皮細胞通透性［18-19］，均提示緊密連接蛋白的表達與腸屏障功能密切相關。本研究結果顯示，Caco2 細胞經100 μg/mL LPS 處理3 h 后，細胞通透性上升，同時緊密連接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1 表達下降，成功構建膿毒癥腸屏障功能障礙細胞模型。經丹參酮IIA 治療后，ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表達水平較模型組上升，IL-17A 及IL-17C mRNA 的表達水平下降，表明丹參酮IIA 能修復LPS 導致的緊密連接蛋白下調，降低炎癥反應，緩解膿毒癥腸屏障功能障礙。

細胞外信號調節激酶（ERK）在細胞內分布廣泛，參與炎癥、細胞凋亡等過程，是維持胃腸道穩態和調節腸屏障功能的重要途徑之一。研究表明，在內臟高敏大鼠模型中，激活PAR2/ERK 信號通路，引起ZO-1、Occludin 表達下降，導致腸屏障功能受損［20］。在結腸炎大鼠模型中，激活ERK 信號通路升高炎癥水平，緊密連接蛋白表達下降，抑制ERK 蛋白磷酸化則能降低結腸組織中的炎癥水平［21］。本研究發現LPS 能誘導Caco2 細胞中p-ERK 水平升高，丹參酮IIA 治療則能降低p-ERK 水平。在丹參酮IIA 治療組加入ERK 激動劑TBHQ，結果顯示與丹參酮IIA 治療組相比，TBHQ 能升高p-ERK 水平，并降低緊密連接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1 的表達。

綜上所述，丹參酮IIA 可能通過抑制ERK 蛋白磷酸化水平，上調緊密連接蛋白的表達，抑制炎癥反應，緩解腸屏障功能障礙，具體機制仍需進一步探索。