浙貝母花不同化學成分提取物體內抗氧化作用

郭燕娜 胡華杰 周國兒 張雷芳

浙貝母植株是以鱗莖入藥，其花和地上部分常被作為廢物丟棄［1］，造成資源浪費。因此，深入開發浙貝母花等遺棄物生物資源，是浙貝母產業一個發展方向。陳文君等［2］研究后初步斷定浙貝母中的地上莖和花同樣具有一定的藥用價值。馬文華等［3］研究發現浙貝母多糖具有較好的體外抗氧化活性。近年來，研究發現浙貝母花除含有與其鱗莖中相似的生物活性物質如生物堿和皂苷外，還含有黃酮類、脂肪酸、氨基酸等成分［4-5］。但浙貝母花的相關基礎研究較為缺乏，也鮮有研究其不同提取物體內抗氧化能力。因此，本研究探討浙貝母花不同化學成分在小鼠體內的抗氧化活性，以期為進一步開發與臨床應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 酶標儀AMR-100（南京菲奇工貿有限公司），超聲波清洗儀WF-150EH（寧波海曙五方超聲設備有限公司），旋轉蒸發儀N-1100、冷卻水循環裝置CA-1111（上海愛朗儀器有限公司），離心機CF16RN（HITACHI 公司），超低溫冰箱FORMA991（賽默飛世爾上海儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9140A（上海精宏實驗設備有限公司），冷凍干燥機ALPHA 1-4/LDPlus（CHRIST 公司）。

1.2 主要藥品與試劑 浙貝母花采自浙江省舟山市金塘鎮，經舟山市中醫院周國兒主任中藥師鑒定為百合科貝母屬植物浙貝母Fritillariae thunbergii Miq.的花。維生素C（批號ST1434）、D-半乳糖（批號ST1218）均購自碧云天生物技術有限公司。乙醇（批號20211115）、石油醚（批號20201110）、乙酸乙酯（批號20210629）、正丁醇（20200831）均購自國藥集團化學試劑有限公司，總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（批號S0101S）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（批號BC0200）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號S0131S）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（批號S0056）均購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗動物 健康ICR 品系小鼠。雄性，體質量25~30 g，購自杭州子源實驗動物有限公司，采用SPF級飼喂。

1.4 浙貝母花不同成分提取 將烘干后的浙貝母花打碎成粉末。稱取4 kg 的浙貝母花粉加5 倍量的80%乙醇超聲重復浸提3 h，抽濾得到浙貝母花乙醇提取液。經過石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分別得到浙貝母花的石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液，濃縮、冷凍干燥，存放于-80℃冰箱中保存。

1.5 動物分組、造模及給藥 小鼠適應性飼養1 周，將42 只雄鼠隨機分成空白組、模型組、陽性對照組、浙貝母花乙醇提取物組、浙貝母花石油醚萃取物組、浙貝母花乙酸乙酯萃取物組、浙貝母花正丁醇萃取物組，每組6 只。對照組每天皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液，其余各組每天皮下注射D-半乳糖（300 mg/kg）。給藥組和模型組經皮下注射D-半乳糖30 min 后，對照組和模型組小鼠采用蒸餾水灌胃，給藥組分別給予浙貝母花乙醇提取物（500 mg/kg）、浙貝母花石油醚萃取物（500 mg/kg）、浙貝母花乙酸乙酯萃取物（125 mg/kg）、浙貝母花正丁醇萃取物（62.5 mg/kg），陽性對照組給予維生素C 溶液（100 mg/kg），使用前以少量0.5% CMC-Na 配制成懸液，冷藏備用。空白組給予等體積的0.5%CMC-Na 水溶液。連續皮下注射和灌胃相應藥物四周。

1.6 動物處理和采集樣本 實驗小鼠在給藥結束后，24 h 內禁食，解剖前記錄小鼠體質量。采用眼球取血法采集小鼠血液，3,000 r/min 離心10 min，取其上清液即為血清樣品，放置于-80℃超低溫冰箱中儲存。取血完畢后處死小鼠，并立即對其肝臟、腦組織、脾臟和胸腺組織進行解剖。肝臟、脾臟和胸腺組織于解剖后0.9%氯化鈉溶液清洗殘留血液和脂肪組織，吸干表面多余水分后進行稱重，記錄數據用于測定其臟器指數。肝臟和腦組織分別置于EP 管內，-80℃超低溫冰箱中保存。

1.7 抗氧化指標的測定 按照相應的試劑盒說明書測定小鼠血清、腦組織、肝組織勻漿中SOD、MDA、CAT、GSH-Px 的含量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件。多組間比較用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 浙貝母花不同化學成分提取物對衰老小鼠器官指數的影響 與空白組相比，模型組小鼠肝臟指數、脾臟指數、胸腺指數均降低（P<0.05 或P<0.01）。與模型組比較，不同給藥組小鼠肝臟指數、脾臟指數、胸腺指數均有所提高，其中石油醚給藥組器官指數提高明顯（P<0.05）。表明D-半乳糖對小鼠的臟器指數有明顯的抑制作用，而浙貝母花提取物尤其是石油醚提取物能較好的緩解D-半乳糖所致臟器指數的下降。見圖1。

圖1 小鼠肝臟指數、脾臟指數、胸腺指數變化

2.2 血清、肝臟和腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）水平的測定 D-半乳糖誘導的衰老小鼠SOD 含量明顯下降（P<0.01），而浙貝母花浸提物不同成分對D-半乳糖致SOD 的影響則不同程度的改善，其中石油醚萃取物，在血清、肝臟及腦組織中均能提高SOD（P<0.01），見圖2。

圖2 小鼠血清、肝臟、腦組織中SOD水平變化

2.3 肝臟和腦組織CAT 水平測定 與空白組相比，模型組腦組織中CAT 水平降低（P<0.01），肝臟中CAT 水平極降低（P<0.001）。與模型組相比，給藥組小鼠CAT水平均有所提高，石油醚萃取物組肝臟和腦組織中CAT水平均提高（P<0.01）。表明模型組小鼠CAT 水平降低，浙貝母花不同部位提取物均能不同程度減輕D-半乳糖引起的肝臟及腦組織CAT 水平降低，其中石油醚萃取物給藥組維持CAT 水平最佳，見圖3。

圖3 小鼠肝臟、腦組織中CAT水平變化

2.4 血清、肝臟和腦組織中MDA 水平測定 與空白組相比，模型組血清、肝臟和腦組織中MDA 水平提高（P<0.01 或P<0.001）。與模型組相比，各給藥組MDA水平均降低，而在肝臟及腦組織中石油醚和正丁醇萃取物能降低MDA 水平（P<0.01），見圖4。

圖4 小鼠血清、肝臟、腦組織中MDA水平變化

2.5 肝臟和腦組織GSH-Px 水平測定 與空白組相比，模型組肝臟中GSH-Px 水平降低（P<0.01）、腦組織中GSH-Px 水平降低（P<0.001）。與模型組相比，給藥各組小鼠GSH-Px 水平均有所提高，乙酸乙酯萃取物組和石油醚萃取物組在肝臟及腦組織中GSH-Px 水平提高（P<0.05），見圖5。

圖5 小鼠肝臟、腦組織中GSH-Px水平變化

3 討論

我國擁有豐富的中藥資源，其功效與安全性也得到較為清晰的認識。中藥中的天然抗氧化劑由于其具有價格便宜、毒副作用小等優點，因此越來越受到專家和學者的重視［6］。近年來，通過對中藥化學成分的研究發現，多糖、黃酮類化合物等有顯著的抗氧化活性［7-8］。彭偉等［5］從貝母花乙酸乙酯和正丁醇提取物分離、鑒定并通過化學成分研究，基本明確浙貝母花中的主要成分為黃酮、甾體類和脂肪族化合物。本實驗結果表明，石油醚及乙酸乙酯提取物的抗氧化效果較佳，推測其可能存在較好的抗氧化活性物質，此類物質為脂溶性較好的物質。彭偉等［5］已經明確從乙酸乙酯提取物中分離得到13 個化合物，包括正十七醇、十七烷酸單甘油酯、異鼠李素等在內的5 種新成分。而這些成分中，可能存在很好的抗氧化活性。本次實驗中，存在MDA數據不穩定現象，劉玉貞等認為在測定MDA 時標本最好不溶血，實驗結果中出現MDA 結果與前期抗氧化能力的出入，原因可能與血清中存在溶血有關，可以進一步改善試驗方法

本研究中，通過檢測小鼠血清、肝臟和腦組織中SOD、MDA 水平，肝臟和腦組織中CAT、GSH-Px 水平，結合臟器指數的觀察發現，浙貝母花不同化學成分提取物均可升高因D-半乳糖導致的低SOD、CAT、GSH-Px 水平，降低因D-半乳糖導致的血清和組織中MDA 水平，具有一定的抗氧化作用。其中石油醚提取物及乙酸乙酯提取物的抗氧化效果最佳，推測其有效的抗氧化活性物質可能為脂溶性物質。