miRNA-126調控自噬減輕高糖誘導血管內皮細胞損傷的作用機制

鄭偉英 劉心雨 劉俊汝 李萌 包慧蘭 樓時先 金啟輝

糖尿病最大死因來源于高糖（HG）導致血管病變繼發的心腦腎等主要并發癥，多數糖尿病患者死于糖尿病血管并發癥，且隨病程延長和血糖控制的不理想，糖尿病患者重大血管病變的發生率逐年提高［1］。MicroRNA（miRNA）是一類小分子、非編碼RNA，通過誘導特異性RNA 表達或抑制調控細胞分化、增殖等細胞生物學變化，參與多種疾病的發生和發展［2］。研究顯示miRNA-126 是一種血管內皮特異性miRNA，被認為與心血管疾病密切相關，參與調控血管病變的多種病理生理過程，是調控血管病變的重要因子，是維持血管正常結構的重要因素［3-4］。這些研究結果提示，miRNA-126 在諸多血管病變中發揮保護作用，但其作用機制復雜，每種疾病狀態下的病理機制并不明確。本研究探討miRNA-126 的表達對HG 誘導內皮細胞損傷的保護作用及其可能機制，為進一步研究糖尿病血管病變發生機制提供實驗依據和可能的治療方案。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 原代HUVECs 細胞株購自美國Clonetics 公司。胎牛血清（FBS）和低糖DMEM 培養基（杭州吉諾生物醫藥）；葡萄糖粉（Sigma）；Beclin 1 抗體（Abacm）；Bax、Bcl-2（CST），Cleaved-caspase 3；Western blot 相關試劑（Sigma）；ERK 通路抑制劑U-0126、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），AKT、pAKT、ERK、pERK、微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）II/I（CST）；CCK-8 試劑盒、RT-qPCR 試劑盒（碧云天）。

1.2 HUVECs 培養及處理 HUVECs 用含5%的胎牛血清的DMEM 培養基在37.0℃、飽和適度、5%CO2的培養箱中常規培養。以無菌PBS 洗滌細胞后，加入0.25%的胰酶（含EDTA）消化傳代，用ECM 培養基重懸，調整細胞密度至5×104/mL，接種于培養板中，充分貼壁后，去血清預處理12 h 后，用于實驗。

1.3 細胞分組 （1）HG 模型組的建立：對數生長期的HUVECs，將終濃度為33.3 mmol/L 的葡萄糖（加入培養基后的濃度為33.3 mmol/L）加入培養基中培養24 h。構建miRNA-126 過表達腺病毒，然后轉染HUVECs使miRNA-126 在內皮細胞中的表達明顯升高。進一步RT-qPCR證實miRNA-126腺病毒成功轉染內皮細胞并提高HUVECs 中miRNA-126 的水平。采用miRNA-126 inhibitor 轉染HUVECs 使內源性miRNA-126 表達下調。（2）細胞分組：細胞分為4 組，即5.5 mmol/L 正常對照組（CR 組），33.3 mmol/L 高糖模型組（HG 組），miRNA-126-5p mimics 組（轉染miRNA-126 Mimics 組）（MM 組），miRNA-126-5p inhibitor 組（轉染miRNA-126 Inhibitor 組）（MI 組）。CR 組，培養24 h 后，再將濃度為5.5 mmol/L（終濃度）的葡萄糖加入培養基中培養24 h；HG 組，培養24 h 后，再將濃度為33.3 mmol/L（終濃度）的HG 加入培養基中培養24 h；MM 組是miRNA-126-5p mimics 轉染至HUVECs 細胞，成功后48 h 在培養基中加入33.3 mmol/L（終濃度）的葡萄糖，培養24 h；MI 組是miRNA-126-5p inhibitor 轉染至HUVECs細胞，成功后48 h 在培養基中加入33.3 mmol/L（終濃度）的葡萄糖，培養24 h。采用miRNA-126-5p mimics組模型，分別予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）5 mmol/L、ERK 通路抑制劑（U-0126）10 mmol/L 干預24 h。觀察凋亡和自噬情況。

1.4 RT-qPCR 對細胞中miRNA-126 水平的檢測 分別提取4 組細胞的總RNA，Trizol Reagent 裂解細胞后，將裂解后的細胞吸1.5 mL Ep 管中，先后加入三氯甲烷，異丙醇及75%乙醇提取RNA，棄上清液，室溫干燥5~10 min 后，采用無RNA 酶水溶解RNA；將提取的RNA 逆轉錄為cDNA，以cDNA 為模板，應用qRT-PCR檢測試劑盒進行PCR 擴增反應，PCR 反應按照說明書采用兩步法進行，最后對獲取的相應數據實施定量分析。

1.5 CCK-8 檢測細胞增殖能力 將HUVECs 細胞按照每孔1×104的密度接種于96 孔板，按照細胞分組進行干預后，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，培養箱繼續孵育2 h，酶標儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光度（A）值，按公式換算為細胞相對活力。

1.6 細胞劃痕實驗 對數生長期的HUVECs 細胞，接種培養板，細胞生長至匯合度達到>95%時準備劃痕。用10 μL 槍頭垂直沿著無菌直尺劃痕。按規范操作，用PBS 洗滌處理孔3 次，洗去劃下來的細胞，并拍照記錄（0 h）。各組置于CO2體積分數為5%、溫度為37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h 后拍照。應用ImageJ 軟件計算細胞愈合率=［1-（S24 h/S0 h）］×100%。（S 表示劃痕面積）。

1.7 Western blot 檢測蛋白表達 收集各組細胞，分別加入120 μL 細胞裂解液，置于冰上裂解10 min，收集細胞懸液于4 ℃、12,000 r/min 離心30 min，取上清液。BCA 工作法進行蛋白定量，以40 μg 總蛋白上樣然后進行SDS-PAGE，后將蛋白轉移至PVDF 膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST 封閉90 min。分別將各種不同抗體用I 抗稀釋液，按照說明書上的比例稀釋后與PVDF 膜置于4 ℃搖床孵育過夜，次日用TBST 洗膜3 遍后再與II抗（1 ∶4,000）室溫孵育60 min，TBST 洗膜3 遍，ECL發光成像，β-actin 作為內參照，用Image Lab 圖像分析軟件對樣本每一個條帶的灰度值進行半定量分析。

1.8 統計學方法 采用Graphpad Prism 8 軟件。符合正態分布計量資料以（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并行Bonferroni 事后檢驗對檢驗水平進行調整，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同條件下HUVECs 表達對miRNA-126 的影響 RT-qPcR 檢測結果顯示，與CR 組比較，HG 組miRNA-126 表達下降（P<0.05）；與HG 組比較，MM組miRNA-126 表達升高（P<0.01），MI 組miRNA-126表達下降（P<0.05），見圖1。

圖1 miRNA-126在不同組HUVECs表達水平

2.2 miRNA-126 促進高糖誘導下HUVECs 細胞增殖作用 CCK-8 實驗結果提示，HG 組與CR 組比較，細胞存活率分別是0.51±0.07 和0.71±0.08，MM 組是0.81±0.09，MI 組是0.52±0.06，與CR 組比較，HG 組和MI 組細胞存活率明顯下降（P<0.05），與HG 組比較，MM 組細胞存活率明顯提高（P<0.01）。見圖2。

圖2 miRNA-126促進高糖誘導下HUVECs細胞增殖的作用

2.3 miRNA-126 對高糖誘導下HUVECs 自噬、凋亡蛋白的影響 WB 實驗結果表明，與CR 組比較，HG 組自噬相關蛋白Beclin-1，LC3 Ⅱ/Ⅰ明顯下降（P<0.05），凋亡相關蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2 明顯升高（P<0.05）；與HG 組比較，自噬相關蛋白Beclin-1、LC3 Ⅱ/Ⅰ明顯升高（P<0.01），促凋亡相關蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2明顯下降（P<0.01）。表明miRNA-126 有促進自噬，抑制凋亡的作用，見圖3。在MM 組中加入自噬抑制劑3-MA（MM+3-MA 組），發現自噬被抑制后促凋亡相關蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2 明顯升高（P<0.01）。見圖4。

圖3 miRNA-126對高糖誘導下HUVECs自噬、凋亡的影響

圖4 抑制自噬后miRNA-126對高糖誘導下HUVECs凋亡的影響

2.4 miRNA-126 對內皮細胞遷移及VEGF、HGF 的影響 與CR 組比較，HG 組細胞愈合能力明顯下降（P<0.05），與HG 組比較，MM 組細胞愈合能力明顯提高（P<0.01）。表明miRNA-126 有促進細胞遷移，愈合能力提高，見圖5。WB 實驗測定細胞生長因子VEGF、HGF，與HG 組比較，MM 組VEGF 明顯提高（P<0.05），而HGF 無明顯改變，見圖6。

圖5 miRNA-126對內皮細胞遷移的影響

圖6 miRNA-126對內皮細胞VEGF、HGF的影響

2.5 miRNA-126 對高糖誘導下HUVECs 的ERK、AKT信號通路蛋白影響 與CR 組比較，HG 組p-ERK/ERK活性明顯下降（P<0.05），而p-AKT/AKT 活性無明顯改變（P>0.05），與HG 組比較，MM 組p-ERK/ERK活性明顯提高（P<0.05），而p-AKT/AKT 無明顯改變（P>0.05）。表明miRNA-126 具有促進ERK 磷酸化作用。見圖7。在MM 組中加入ERK 抑制劑U-0126，自噬蛋白Beclin-1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表達明顯下降（P<0.05），見圖8。

圖7 miRNA-126對高糖誘導下HUVECs的ERK、AKT信號通路蛋白的影響

圖8 抑制ERK后miRNA-126對高糖誘導下HUVECs自噬的影響

3 討論

近年來，大量研究發現，miRNA 在糖尿病的發生發展中起重要作用［5］。多種miRNA 穩定存在血液中，其對細胞病變和組織器官疾病的發生和發展有重要作用。血管病變最重要的病理機制是血管內皮損傷，在糖尿病患者中，高糖、氧化應激、高脂血癥等多種因素可直接或間接引起血管內皮細胞功能障礙。miR-126 是內皮細胞中miRNA 之一，在調節內皮細胞增殖、黏附、管腔形成等功能方面起著至關重要的作用［6］。

本研究發現，高糖環境下，HUVECs 活力下降，增殖能力減弱，促凋亡蛋白Bax/Bcl-2 水平明顯升高，并最終導致Caspase-3 升高，表明高糖誘導促進內皮細胞凋亡。自噬作為細胞的保護性機制，調節內皮細胞的增殖和凋亡，在動脈硬化病變中具有重要作用［7］。本研究發現HG 組血糖高，HUVECs 自噬蛋白Beclin-1 和LC3 Ⅱ/Ⅰ下降明顯，表明高糖抑制內皮細胞自噬。與以往研究結果相似［8］。

miRNA-126 作為一種內皮特異性miRNA，具有調控動脈粥樣硬化的重要作用，是維持血管穩態的重要組成部分［9］。相關研究表明，miRNA-126 能通過調節各種血管生成相關的細胞因子表達，保護局部微環境的穩定，促進血管的生成，在保持血管的完整性中發揮重要作用［10］。miRNA-126 還可通過促進內皮細胞釋放內皮型一氧化氮合酶（eNOS），和抑制D1k1 的表達，減輕內皮細胞的損傷，從而抑制動脈粥樣硬化的發生［11-12］。表明miRNA-126在血管病變的發展進程中起重要的調控作用。本研究顯示，MM 組與HG 組比較，有明顯促進內皮細胞增殖的作用，可以降低Bax/Bcl-2/，抑制caspase-3 表達，減少凋亡。進一步發現miRNA-126 具有促進LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達的作用。予3-MA抑制劑后，miRNA-126 促進自噬蛋白表達作用明顯被削弱，凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2/、caspase-3 表達升高，表明miRNA-126 具有促進自噬抑制凋亡的作用機制。

AKT 和ERK 信號通路參與內皮細胞的多種生物功能，被認為是內皮細胞受損相關的關鍵信號通路之一［13］。本研究顯示，HG 組p-ERK/ERK 抑制明顯，而p-AKT/AKT 活性改變差異無統計學意義，表明高糖抑制ERK 的磷酸化，功能活性明顯下降。miRNA-126 過表達的MM 組，其p-ERK/ERK 活性與HG 組比較，升高明顯（P>0.05）。在MI 組，miRNA-126 被抑制后p-ERK/ERK 活性明顯下降，其與HG 組比較，差異無統計學意義，表明高糖組miRNA-126 抑制明顯，也證實轉染細胞抑制miRNA-126 表達成功。比較AKT 的活性，發現其在四組間差異均無統計學意義，表明miRNA-126與AKT 的活性無關，與其具有促ERK 磷酸化的作用相關。進一步驗證發現miRNA-126 過表達是否是通過激活ERK 通路促進自噬，予ERK 抑制劑U-0126 后，ERK活性被抑制后自噬蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 表達明顯下降，表明miRNA-126 促進自噬是通過激活與ERK 相關的信號通路發生起作用。

綜上所述，高糖可以抑制miRNA-126 的表達。miRNA-126 可以保護高糖條件下的內皮細胞存活，促進內皮細胞增殖和遷移，其機制可能與ERK 信號通路活性提高，促進自噬的發生，從而減少內皮細胞凋亡相關。今后能否通過調控miRNA-126 表達，為預防糖尿病血管病變的發生提供實驗依據和思路。