玉米ZmSOD基因克隆及其在干旱脅迫下的表達

李玉華,趙振華,吳 征,白佳田,王爍瑩,王同朝

(1 鄭州師范學院 生命科學學院,鄭州 450044;2 河南農業大學 農學院,河南糧食作物協同創新中心,鄭州 450002)

SOD基因是一個多基因家族,在同一植物中存在多個不同家族的SOD基因,且不同植物SOD家族基因的數量存在較大差異[5-7]。對不同植物SOD基因的研究表明,這些基因可以作為抵御包括冷、熱、鹽和干旱等非生物脅迫的第一道防線[8-9]。個體SOD基因家族成員在不同物種和不同環境脅迫下的表達模式不同。如:對擬南芥植株進行多種處理發現,臭氧熏蒸降低了葉綠體中Fe-SOD1和Cu/Zn-SOD2的轉錄水平,而葉綠體Fe-SOD2的mRNA相對保持不變。Fe-SOD2mRNA對UV-B的響應顯著增加,Fe-SOD1和Cu/Zn-SOD2的mRNA卻保持穩定,Cu/Zn-SOD1mRNA在UV-B和臭氧處理下都明顯升高[10]。同樣,在干旱脅迫下,白三葉草中FeSOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD基因產生了更多的轉錄本[11];陸地棉中3種SOD基因的表達均顯著上調,而在低溫脅迫下,只有Cu/Zn-SOD基因的表達升高[12]。在小麥中,這個家族的成員在不同組織中表達不同,在高溫、干旱和鹽脅迫下,小麥Cu/Zn-SOD和Mn-SOD高度表達[13]。相反,在干旱脅迫下,香蕉中的Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD基因表達量卻降低[14];在玉米中鑒定出的6個Cu/Zn-SOD基因,其中Cu/Zn-SOD2在干旱脅迫下表達水平顯著上升,而Cu/Zn-SOD4在干旱脅迫下表達水平顯著下降[15]。

近年來研究報道,許多脅迫誘導的Cu/Zn-SOD異構體已在多種單子葉和雙子葉植物中被鑒定[15-16],且其在植物中的防御功能已被轉基因方法所證實。如在水稻中過表達OsCu/Zn-SOD基因增強了植株對鹽脅迫的耐受性[17],在煙草中過表達花生Cu/Zn-SOD可以緩解高鹽和干旱對植株的傷害[18],在擬南芥中過表達Cu/Zn-SOD可使擬南芥耐受多種非生物脅迫[19-21]。過表達Cu/Zn-SOD的大量研究表明,將其表達水平與植物的氧化應激耐受程度聯系起來,發現了它們在植物適應非生物和生物脅迫中的重要性。

玉米在世界范圍內被廣泛用作糧食作物和飼料作物,也是遺傳研究的主要模式植物。玉米是研究C4光合作用和非生物脅迫耐受性功能基因組學的理想材料。已知干旱、高溫、寒冷和高鹽等環境脅迫會降低農作物產量,鑒于玉米在中國農業生產和國民經濟發展中的重要性,在不利環境下提高玉米產量一直是學者研究的熱點。盡管玉米基因組的研究進展迅速,輔助基因表達模式來深入理解基因功能的要求日益增長,仍需要對SOD基因在玉米中的特性及功能進行研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和設計

依據項目組前期研究工作基礎[22],選用抗旱性有明顯差異的玉米雜交品種‘蠡玉35’(LY35,抗旱性強)和‘登海605’(DH605,干旱敏感)為試驗材料。種子在塑料缽中播種(每缽1粒種子),填充2種不同相對含水量的土壤。田間最大持水量(field capacity,FC)為每100 g土壤干重最大含水量22.67 g。播種后,土壤水分保持在75%的為對照植株,土壤水分保持在40%的為干旱脅迫植株,2個品種的土壤含水量控制相同。

供試材料于光照培養箱內培養1周(日照時間為15 h,溫度28 ℃,光照度6 000 lx;黑暗9 h,溫度25 ℃),第8天開始取樣。

采集植株幼苗上第二片葉(自下往上)立即液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱用于后續試驗。每個處理3個生物學重復。

1.2 方 法

1.2.1ZmSOD基因克隆利用Plant RNeasy試劑盒(凱杰,德國)從2個品種玉米葉片中提取總RNA,RNA濃度和純度用微量分光光度計Nanodrop2000(熱電,美國)測定。根據primeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa,No.RR047A)說明書合成第一鏈 cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增,擴增程序為:95 ℃預變性4 min;95 ℃變性30 s,58 ℃復性30 s,72 ℃延伸50 s,35個循環;72 ℃終延伸10 min。PCR產物電泳檢測后,使用膠回收試劑盒(TaKaRa,No.9762)純化回收,連接pMDTM18-T載體(TaKaRa,No.6011),轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,挑取陽性克隆菌液,送華大基因公司測序。用于克隆ZmSOD基因全長和qRT-PCR引物序列如表1所示。

表1 試驗所用引物

1.2.2 基因序列及預測蛋白分析利用Blast軟件從GenBank中挑選甘藍型油菜(登錄號為AAY40317.1)、大白菜(登錄號為Aac25568.1)、蘿卜(登錄號為AAD05576.1)、擬南芥(登錄號為ABN50366.1)、琴葉擬南芥(登錄號為XP002889716.1)和芥菜(登錄號為AAN60796.1)6個十字花科植物的Cu/Zn-SOD基因編碼的氨基酸序列,利用DNAMAN軟件將其與甘藍型油菜Cu/Zn-SOD的氨基酸序列進行多序列比對,并通過MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。

利用ProtParam在線軟件進行理化性質分析(http://web.expasy.org/protparam/);TMHMM軟件進行蛋白質跨膜區段分析(TMHMM:http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);SignalP軟件進行N-末端信號肽序列預測分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);NCBI在線CDS進行結構域預測分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/);利用ExPASy工具SOPMA軟件進行蛋白質二級結構預測。

1.2.3 qRT-PCR分析qRT-PCR用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa,No. RR820A)在32孔實時熒光定量PCR儀Lightcycler?Nano(羅氏,瑞士)上進行。qRT-PCR程序條件是:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環,18S作為內參基因。20 μL反應體系包括:正/反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL,模板2 μL,ddH2O 6.4 μL和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ為10 μL。每個樣品進行2個技術重復和3個生物學重復,采用2-ΔΔCT方法計算ZmSOD的相對表達量。

1.2.4 2-DE和質譜鑒定分析ZmSOD 蛋白參照Li等[23]的方法提取玉米葉片中總的蛋白質進行雙向電泳,分離鑒定ZmSOD蛋白,每個樣品3個生物學重復。將葉片組織(1 g)在液氮中磨成細粉,加入適量含有10%(m/V)三氯乙酸的冷丙酮進行提取。晾干的蛋白沉淀溶于水化緩沖液中[9.5 mol/L尿素,4%(m/V)CHAPS,60 mmol/L DTT,2%(V/V)兩性電解質]進行2-DE電泳,每500 μL緩沖液中加入10 μL蛋白抑制劑Cocktail Set I(Merck)。

用超聲波(80 W,超聲10 s,間歇15 s,10次)粉碎蛋白樣品,14 000g離心20 min。以牛血清白蛋白為標準,采用Bio-Rad蛋白試劑盒測定總蛋白含量。

第一向等電聚焦用13 cm IPG膠條(pH 3～10,非線性)在Ettan IPG phor IEF System(GE Amersham,美國)上進行,聚焦程序設置為:30 V 12 h,500 V 1 h,1 000 V 1 h,8 000 V 8 h。第一向聚焦完成后,膠條放在平衡液Ⅰ[50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.8,2% SDS,6 mol/L尿素,30%甘油,1%(m/V) DTT]中平衡15 min,然后再將膠條在緩沖液Ⅱ中平衡15 min[其成分與I液相同,但用4%(m/V)碘乙酰胺替代DTT]。第二項 SDS-PAGE用12.5%聚丙烯酰胺凝膠在Hofer SE 600(GE Amersham,美國)垂直板上以每膠條15 mA運行30 min,然后以每膠條30 mA運行30 min,直至溴酚藍達到凝膠末端取出凝膠。用Image Master 2D Platinum分析軟件對2-DE凝膠圖片進行分析處理,選取3次重復中豐度差異大于1.2倍的蛋白質點做進一步分析。

1.2.5 SOD活性測定參照?elik[24]的方法測定玉米幼苗葉片中的SOD活性。通過檢測在560 nm處氮藍四唑的光化學還原抑制率來測定總的SOD活性,1個單位的酶活性被定義為引起氮藍四唑還原50%抑制所需的酶量。

1.3 統計分析

數據以平均值±標準差表示,至少3個生物學重復。所有統計分析均用SPSS 20.0進行,采用 Duncan進行多重差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 ZmSOD 基因的克隆和序列分析

分別提取2個玉米品種DH605和LY35幼苗葉片的總RNA,經分光光度計檢測,D260/280均為1.8～2.1,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量和完整性,都表明提取的RNA質量很好。以cDNA為模板PCR擴增產物均在近500 bp處有一特異性條帶,凝膠電泳檢測結果如圖1所示。測序結果分析顯示:DH605中ZmSOD1的ORF全長456 bp,編碼151個氨基酸;LY35中ZmSOD2的ORF全長459 bp,編碼152個氨基酸。

M. DL2000; 1-2.ZmSOD圖1 ZmSOD 基因擴增Fig.1 Amplification of ZmSOD

用DNAMAN對ZmSOD1和ZmSOD2與GenBank中的SOD核苷酸序列進行比對發現:ZmSOD1與谷子(XM_012842967)、水稻(NM_001402155)和擬南芥(NM_100757)等植物SOD的cDNA 序列一致性高于72.77%(圖2),ZmSOD2和以上幾種植物SOD的cDNA序列一致性高于74.07%,表明克隆得到的ZmSOD1和ZmSOD2屬于SOD基因家族成員。

圖2 玉米ZmSOD和其他植物的SOD核苷酸序列多重比對Fig.2 Multiple sequence alignment of ZmSOD nucleotide sequences with SODs from other plants

2.2 ZmSOD編碼的蛋白質理化性質和系統進化分析

用ProtParam軟件對ZmSOD1和ZmSOD2編碼的蛋白質進行推算,ZmSOD1編碼151個氨基酸,蛋白等電點5.76,分子量15.05 kD;ZmSOD2編碼152個氨基酸,蛋白等電點5.65,分子量15.11 kD。預測ZmSOD1和ZmSOD2蛋白不穩定系數分別為18.51和22.27,脂肪系數分別為73.58和76.32,總平均親水指數分別為-0.245和-0.198,均屬穩定親水性蛋白。

用TMHMM和SignalP 3.0分析顯示ZmSOD1和ZmSOD2序列N端無信號肽及無跨膜結構域,包含1個保守的Cu/Zn-SOD功能結構域,屬于Cu/Zn-SOD家族成員。亞細胞定位分析ZmSOD1和ZmSOD2是位于細胞基質中的非分泌蛋白,為細胞質型定位。

二級結構分析顯示,ZmSOD1和ZmSOD2蛋白分別包含53.64%和53.29%無規則卷曲,32.45%和36.18%延伸鏈,7.28%和6.58% β-轉角,以及6.62%和3.95% α-螺旋。

同源性和系統進化分析發現,玉米ZmSOD1和ZmSOD2蛋白和單子葉植物谷子Cu/Zn-SOD蛋白(登錄號XP_012698421)的親緣關系最近,相似性分別高達93.42%和96.05%,并且ZmSOD在氨基酸水平與其他植物的SODs也有很高的相似性,與水稻OsSOD(XP_001389084)的相似性分別為90.13%和92.76%;與高粱SbSOD (XP_021309598)的相似性分別為87.50%和90.13%,與擬南芥(NP_172360)的相似性也較高,分別是81.58%和84.21%(圖3)。

使用MEGA 5.0軟件系統發育分析發現,ZmSOD首先與禾本科谷子FmSOD和水稻OsSOD聚合在一起,再與禾本科高粱SbSOD聚合在一起,最后與其他科植物的SOD 聚合(圖4)。表明已知的Cu/Zn-SOD氨基酸序列中,玉米和禾本科植物的親緣關系最近,這與blastp結果基本一致。

分支點上的數字為自展值百分比。圖4 玉米ZmSOD蛋白與其他植物SODs的系統發育樹分析The numbers shown at the branches are bootstrap values.Fig.4 The phylogenetic analysis of ZmSOD and other SODs from various plants

2.3 ZmSOD響應干旱脅迫分析

從圖5可以看出,和對照相比,干旱處理導致ZmSOD轉錄水平在DH605和LY35葉片中都發生顯著變化。但干旱脅迫條件下DH605幼苗葉片中ZmSOD1的表達量為對照的62.5%,顯著下降;而LY35幼苗葉片中ZmSOD2的表達量為對照的2.68倍。這些結果表明ZmSOD基因響應了干旱處理,且其在不同的玉米品種幼苗葉片中的響應模式存在差異。

*和**表示該處理與對照組表達量比較差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同。圖5 干旱處理下2個玉米品種ZmSOD的表達* and ** represent significant difference at 0.05 and 0.01, respectively, as compared to the control. The same as below.Fig.5 The expression patterns of ZmSOD in DH605 and LY35 under drought stress condition

進一步結合2-DE耦聯的MALDI-TOF法分析2個玉米品種響應干旱脅迫時的蛋白表達模式,質譜分析與NCBI數據庫中的玉米蛋白序列庫進行比對,只有高得分、較多肽段數和蛋白可信度不低于95%的蛋白才被認定為ZmSODs。圖6顯示,2個玉米品種幼苗在干旱脅迫條件下,DH605中的點1(圖6,A、B)和LY35中的點2(圖6,C、D)蛋白表達量和對照比均有顯著變化。其中,DH605幼苗葉片中的ZmSOD1在干旱條件下表達量下調,且對照植株葉片中的表達量為干旱條件下的1.25倍;在LY35幼苗葉片中鑒定到的SOD蛋白屬于Mn-SOD,在干旱條件下表達量上調,為對照的1.79倍。從DH605和LY35中鑒定出的ZmSOD,其蛋白名稱、登錄號、可信度及匹配的肽序列等詳細信息都列在表2中。

A-B.在對照(A)和干旱脅迫(B)下‘登海605’的2-DE圖像;C-D.在對照(C)和干旱脅迫(D)下‘蠡玉35’的2-DE圖像。圖6 2個玉米品種干旱脅迫下ZmSOD蛋白的表達A and B represent the control and the drought stressed plants of DH605, respectively; C and D represent the control and the drought stressed plants of LY35, respectively.Fig.6 2-DE maps of ZmSOD in DH605 and LY35 under control and drought stress conditions

表2 對照和干旱條件下2個玉米品種中鑒定出的SODs

2.4 干旱脅迫下SOD活性

由圖7可知,干旱處理后DH605幼苗葉片中的SOD活性顯著下降,比對照下降了29.45%;而LY35幼苗葉片中的SOD活性顯著上升,比對照升高了25.59%。

圖7 干旱處理條件下‘登海605’和‘蠡玉35’葉片中的SOD活性Fig.7 The activity of SOD in leaves of DH605 and LY35 under drought stress condition

相關性分析表明,2個品種葉片中SOD活性總體變化趨勢和ZmSOD的基因表達水平和蛋白豐度較為一致,ZmSOD1和ZmSOD2基因表達量、ZmSOD1和ZmSOD2蛋白豐度與SOD活性分別呈極顯著正相關和顯著正相關(表3)。

表3 干旱脅迫下玉米幼苗ZmSOD基因相對表達量、蛋白豐度和SOD活性的Pearson相關性分析

3 討 論

SODs是一種廣泛存在的蛋白質,在植物生長發育和代謝過程中起著重要作用,也參與脅迫反應。然而,SODs響應植物抗逆性的機制仍不清楚。從DH605和LY35玉米品種葉片中各克隆到1個Cu/Zn-SOD基因,該基因與其他植物的SOD成員有很高的同源性,進一步證實了這些基因在植物物種中是高度保守的。

環境脅迫會誘發植物細胞中ROS的產生,抗氧化酶活性的增加是細胞對抗氧化脅迫的防御機制,通常,抗氧化酶的活性被用來衡量ROS介導的氧化脅迫程度[25]。有研究報道從30個小黑麥基因型中選擇遺傳距離最大的2個基因型,對地上部和根部中Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD這3種同工酶的差異表達譜分析發現,耐旱性強基因型小黑麥的根和莖中Cu/Zn-SOD的表達水平高于干旱敏感基因型[26]。在限制土壤水分條件下,耐旱的甘蔗品種葉片中鑒定到1個Cu/Zn-SOD,而商業品種葉片中卻沒有,表明Cu/Zn-SOD在耐旱性中起著關鍵作用[27]。有研究稱,在玉米中共鑒定出13個SOD基因(6個ZmCu/Zn-SOD,5個ZmFeSOD,2個ZmMnSOD),這些基因在干旱和鹽脅迫下的表達水平存在顯著差異,部分成員在不同的脅迫條件下表現出相似的表達模式[15]。本研究發現ZmSOD是玉米中積極響應干旱脅迫的參與者,在缺水條件下,ZmSOD1在DH605幼苗葉片中顯著下降,而LY35幼苗葉片中ZmSOD2卻明顯上升,這與Li等對鎘脅迫下耐鎘玉米品種葉和根中Cu/Zn-SOD轉錄水平高于敏感品種的研究結果[28]一致。以上研究結果都表明不同植物中,不同SOD成員響應非生物脅迫的調節機制不同。

有研究發現在小麥抗旱基因型中的SOD活性隨著滲透勢能的降低而增加。此外,Mn-SOD轉錄本顯著上調,與SOD活性變化趨勢一致,說明Mn-SOD可能在植物的抗旱性中起重要作用[29]。在干旱脅迫下,2個普通大豆葉片中的Cu/Zn-SOD基因表達量上調,且耐旱基因型中Cu/Zn-SOD的上調幅度高于干旱敏感品種[30]。類似的報道稱,蘿卜葉片中SOD活性在高溫脅迫條件下和對照比均有不同程度增加,但耐熱材料比熱敏感材料中增幅更大[31]。對23個基因型棉花幼苗葉片測定SOD活性發現,有些基因型在干旱脅迫下SOD活性增加不顯著,有些基因型在干旱脅迫下SOD活性降低顯著。有趣的是,耐旱性基因型在對照條件下SOD活性最高,但其在干旱脅迫下SOD活性卻最低[32]。

總的來說,抗氧化酶水平隨著環境脅迫而發生差異性變化,這取決于脅迫的程度、種類和植物對脅迫的種屬特異性及敏感性。由此可以推測,植物在受到生物或非生物等逆境脅迫時,植株受到損害,ROS增多,ROS可作為一種信號誘導Cu/Zn-SOD的表達,而由于各個信號傳導途徑的調控機制不同或多種途徑間的相互作用,導致Cu/Zn-SOD對脅迫的響應又各不相同。本研究雖取得一定成果,但較多研究表明,轉不同SOD基因的植株在不同逆境脅迫下其SOD活性和抗氧化能力存在較大區別。后續研究將在耐旱玉米品種LY35中繼續挖掘Cu/Zn-SOD成員,并探究不同基因成員在各種逆境脅迫下的表達模式和功能,為進一步揭示耐旱基因型玉米抗氧化能力與其抗逆性的關系提供新的線索,并為將來通過基因工程手段調控玉米Cu/Zn-SOD基因的表達進而提高玉米的抗逆能力提供目的基因資源。