桑樹磷脂酶MaPLA1-2D亞型4個基因的克隆與脅迫應答分析

郝博文,李瑞卿,夏 宇,尚姝婷,李文強,張敏娟*

(1 西北農林科技大學 生命科學學院,陜西楊凌 712100;2 西北農林科技大學 動物科技學院,陜西楊凌 712100)

磷脂酶(phospholipases)是一類能夠水解磷脂的酶類,根據其水解磷脂位點的不同可將其分為磷脂酶A1(phospholipases A1,PLAl)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD),它們特異地作用于磷脂分子內部的各個酯鍵,形成不同的產物[1]。

磷脂酶A2大量存在于動物胰臟和植物組織中,催化水解磷脂的sn-2位?；?磷脂酶A1廣泛分布在動物細胞的溶酶體內,此外蛇毒及某些微生物中亦有,催化水解膜磷脂sn-1酰基,二者催化磷脂水解產生游離脂肪酸和溶血磷脂[2]。大量研究表明,PLC和PLD在植物生長發育、生物脅迫及非生物脅迫中起重要的調控作用[3-4]。

截至目前,有關植物磷脂酶A1的研究較為缺乏,已有報道集中在植物PLA1基因家族的序列分析和表達分析上,如亞麻芥(Camelinasativa)[5]、玉米(Zeamays)[6]、油菜(Brassicanapus)[7]、百合(Liliumbrownii)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]等。

研究表明,植物花藥不開裂基因(DAD1,defective in anther dehiscence1)產物具有磷脂酶A1活性,對其功能的解析相對深入。擬南芥AtDAD基因通過參與JA合成調節花藥開裂[2]。辣椒(Capsicumfrutescens)CaPLA1在擬南芥中促進轉基因植株生長[10]。麻瘋樹(Jatrophacurcas)JcDAD1通過參與JA合成途徑調節花和果實的發育[11]。

因此,充分了解各磷脂酶的生化特性、時空表達關系以及脂質分子之間的轉化關系將有利于深入解析植物磷脂酶的生物學功能,并促進磷脂酶基因在植物育種中的應用。

桑樹(MorusalbaL.)屬桑科桑屬,自然類型多、分布區域廣泛、在中國栽培歷史悠久。桑樹具有抗寒、抗旱、耐水濕特性,其果實、葉片、根等部分可食用、藥用、飼用、觀賞用,兼具經濟效益和生態價值[12-14]。

近年來,桑樹作為修復植物已廣泛用于脆弱環境的生態治理[15-17]。本研究克隆桑樹磷脂酶A1-2D亞家族基因,分析其亞細胞定位、時空表達及脅迫誘導表達模式,以進一步深入解析磷脂酶的生物學功能,促進磷脂酶基因在植物育種中的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及干旱脅迫處理方法

成齡桑樹‘紅果2號’在周至桑樹種質資源圃種植;本氏煙草和桑樹幼苗在本實驗室種植。

選取生長健壯、長勢一致的40 d苗齡桑樹幼苗,進行干旱脅迫實驗,每個處理3株幼苗,干旱處理:桑樹幼苗澆透水后斷水模擬土壤自然干旱過程,對照組正常澆水。用土壤水分測量儀(TRIME-PICO 64/32 TDR,北京易科泰生態技術有限公司)測定土壤水分,從而評估土壤干旱程度。當土壤含水量為0時,即視為干旱脅迫第1天,于處理第4天取樣。脫落酸(ABA)處理:以5 mL 0.1 mmol/L ABA溶液噴施幼苗,處理24 h后取樣;高鹽脅迫:采用100 mL 300 mmol/L NaCl溶液澆灌處理盆栽幼苗,處理第3天取樣;低溫脅迫:將幼苗置于4 ℃條件下處理24 h后取樣。以上處理結束后,采集第三葉位(自上而下)葉片,經液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 目的基因RT-PCR擴增及克隆

從NCBI基因組數據庫獲得桑樹磷脂酶基因序列和氨基酸序列,并用在線軟件Conserved Domain Search Service (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析候選序列的磷脂酶結構域。

以桑樹‘紅果2號’葉片為材料,參照試劑盒說明書提取總RNA(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit,TaKaRa)并反轉錄成cDNA(PrimeScriptTMRT reagent Kit,TaKaRa)。以cDNA作為模板擴增目的基因,引物序列見表1。

表1 MaPLA1-2D基因克隆所用引物序列

PCR反應程序為94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min,35個循環;72 ℃反應10 min。

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳(130 V,200 mA)檢測,回收目的DNA片段并克隆至pMD18-T載體(TaKaRa,Dalian),轉化大腸桿菌DH5α后進行測序驗證。

1.3 生物信息學分析

蛋白分子量、等電點(pI)等蛋白質理化性質預測采用ExPasy數據庫(https://web.expasy.org/protparam/);氨基酸序列比對分析使用在線軟件PRALINE(https://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/);保守結構域分析使用Conserved Domain Search Service數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi);基因結構分析使用Gene Structure Display Server 2.0軟件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/);系統進化樹構建利用軟件MEGA 7.0,采用鄰接法(Neighbor-Joining);啟動子分析用Plantcare數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/);蛋白信號肽和跨膜區預測利用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)和TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。

1.4 蛋白亞細胞定位

回收4個MaPLA1-2D基因序列的雙酶切目的基因片段和表達載體p35S-GFP(pCAMIBA1301骨架)進行連接后獲得p35S∷MaPLA1-2Ds-GFP融合表達載體,電擊法轉化重組質粒至農桿菌GV3101后作為蛋白亞細胞定位載體;分別將含有空載p35S-GFP和p35S∷MaPLA1-2Ds-GFP重組質粒的農桿菌在YEP培養基中培養至D600為1.0,然后注射本氏煙草葉片(20 d苗齡),每株注射2～3片,3個重復。

暗培養1 d后正常光照培養2 d,然后取葉片下表皮在激光共聚焦顯微鏡(ST8,Lecia)下觀察GFP熒光信號。

1.5 qRT-PCR基因表達

根據桑樹4個MaPLA1-2D基因序列設計qRT-PCR引物(表2),利用實時熒光定量RT-PCR檢測4個MaPLA1-2D基因在桑樹不同組織或各種非生物脅迫下的基因表達量。

表2 qRT-PCR引物序列

熒光定量PCR使用Bio-Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀,qRT-PCR反應體系和擴增程序按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara)試劑盒說明書操作,每個基因設置3個生物學重復和3個技術重復,以桑樹Actin基因為內參,采用2-ΔΔCT法分析基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 MaPLA1-2D基因克隆與序列分析

以植物PLA1典型結構域序列搜索桑樹基因組數據庫(NCBI:txid981085)獲得MaPLA1-2D基因序列,設計引物(表1)進行PCR擴增,得到4個MaPLA1-2D基因(圖1,A),命名為MaPLA1-2D.1～MaPLA1-2D.4,其編碼蛋白介于399～443個氨基酸,蛋白質分子量介于45～50 kD。MaPLA1-2D.1蛋白等電點為8.81,MaPLA1-2D.2～4等電點分別為5.62、5.95和5.38,均為不穩定蛋白和親水蛋白(表3),且4個MaPLA1-2D蛋白序列中均不含有信號肽和跨膜區。

A. 桑樹MaPLA1-2D.1/2/3/4基因的PCR克隆, M. DL2000;泳道1～4分別為MaPLA1-2D.1/2/3/4基因PCR產物;B. 桑樹MaPLA1-2D.1/2/3/4基因結構分析;C. MaPLA1-2D.1/2/3/4基因與擬南芥AtDAD1、水稻OsDAD1氨基酸序列比對,以方框標示酯酶盒基序GHSLG;D. MaPLA1-2D.1/2/3/4基因進化分析。圖1 MaPLA1-2D.1/2/3/4基因克隆及序列分析A. PCR cloning of MaPLA1-2D.1/2/3/4. M. DL2000; Lanes 1-4 are the PCR products of MaPLA1-2D.1/2/3/4, respectively; B. Gene structure analysis of MaPLA1-2D.1/2/3/4 genes; C. Alignment of amino acid sequences of MaPLA1-2D.1/2/3/4 and AtDAD1 and OsDAD1, box indicate motif GHSLG; D. Phylogenetic analysis of MaPLA1-2D.1/2/3/4.Fig.1 MaPLA1-2D.1/2/3/4 gene cloning and sequence analysis

表3 桑樹MaPLA1-2D蛋白理化性質

基因結構分析顯示,MaPLA1-2D.3基因序列有2個內含子,其余3個成員基因序列中均沒有內含子序列(圖1,B)。蛋白保守結構域分析表明MaPLA1-2D 4個成員蛋白質序列都含有三酰甘油脂酶結構域(PLN02454)。蛋白質多序列比對結果表明,MaPLA1-2D 4個成員與擬南芥AtDAD1和水稻OsDAD1具有相似性,且均含有酯酶盒GHSLG結構域(圖1,C)。

序列進化分析表明,MaPLA1-2D 4個成員明顯聚類在一起(圖1D),表明其進化關系非常密切;MaPLA1-2D與擬南芥AtpPLA1-2D和AtDAD1以及水稻OsDAD1位于不同分支(圖1,D),表明木本植物桑樹和擬南芥、水稻的磷脂酶A1在序列上有明顯的分化。

2.2 MaPLA1-2D基因啟動子區功能元件分析

以MaPLA1-2D基因4個成員的核酸序列搜索桑樹基因組數據庫,找到每個基因編碼區所在的川?；蚪M序列疊連群contig,獲取起始密碼子上游2 500 bp的核酸序列用于下一步元件分析。經Plantcare數據庫分析MaPLA1-2D基因上游2 500 bp DNA序列,結果表明MaPLA1-2D基因4個成員的啟動子區含有多種生物脅迫和非生物脅迫響應相關順式作用元件,如低溫響應元件LTR、防御及脅迫響應元件(TC-rich repeats)、厭氧誘導元件ARE等(表4)。

表4 MaPLA1-2D基因啟動子區序列順式作用元件分布

如表4所示,除MaPLA1-2D.3外,另外幾個成員的基因啟動子區均含有干旱誘導響應元件(MBS);各成員的啟動子區均含有激素響應元件,如脫落酸響應元件(ABA responsive element)、水楊酸應答元件(SA responsive element)、茉莉酸響應元件(MeJA responsive element);MaPLA1-2D.2和MaPLA1-2D.4基因啟動子還含有赤霉素應答元件(GA responsive element),MaPLA1-2D.1/3基因啟動子還含有乙烯應答元件(Ethylene responsive element, ERE),MaPLA1-2D.1基因啟動子含有生長素應答元件TGA-element。

2.3 MaPLA1-2D蛋白的亞細胞定位

為了分析MaPLA1-2D.1～ MaPLA1-2D.4蛋白亞細胞定位,構建了p35S∷MaPLA1-2Ds-GFP融合表達載體,農桿菌侵染法轉化煙草后觀察綠色熒光信號。

結果表明,在轉化p35S-GFP空載的煙草葉表皮細胞中,GFP熒光分布于細胞核、細胞質和細胞膜中(圖2)。

綠色是GFP蛋白激發的熒光;紅色是葉綠體自發熒光。圖2 桑樹PLA1-2D.1/2/3/4亞細胞定位結果Green indicates the fluorescence excited by GFP protein; red is the chloroplast autofluorescence.Fig.2 Subcellular localization of mulberry PLA1-2D.1/2/3/4

在分別注射含4個p35S∷MaPLA1-2Ds-GFP重組質粒的農桿菌后,煙草葉表皮細胞中綠色熒光信號明顯與葉綠體自發紅色熒光信號相重疊(圖2),說明MaPLA1-2D.1～ MaPLA1-2D.4蛋白均定位于葉綠體。

2.4 MaPLA1-2D基因的組織表達模式和脅迫應答分析

qRT-PCR結果表明4個MaPLA1-2D基因在桑樹冬芽、葉、根、雄花(staminate flower)和雌花(pistillate flower)中均有表達,但在葉和根中表達水平較高,其中MaPLA1-2D.1在根中表達水平最高(圖3,A)。進一步利用qRT-PCR分析MaPLA1-2D基因4個成員在干旱、脫落酸(ABA)、高鹽和低溫脅迫處理后基因表達情況(圖3,B)。結果顯示,4個MaPLA1-2D基因的表達均受干旱、ABA、高鹽和低溫脅迫誘導,其中干旱和ABA處理導致4個MaPLA1-2D基因的表達均劇烈上調,鹽脅迫處理對MaPLA1-2D.2基因表達的誘導作用相對明顯。

圖中誤差線表示標準誤,不同字母表示P<0.05水平具有顯著性差異。圖3 桑樹PLA1-2D基因在5個不同組織中的表達模式和非生物脅迫表達模式Data is mean±standard error (SE) and different letters in a column indicate significant difference at P< 0.05 level.Fig.3 Expression model of MaPLA1-2D genes in 5 tissues and under abiotic stresses

3 討 論

磷脂酶是催化磷脂水解釋放游離脂肪酸的一類復雜而重要的酶,在植物體內分布廣泛。磷脂酶幾乎參與植物體所有的生命階段,尤其在響應外界環境刺激中起著重要的作用[1,4]。植物磷脂酶A分為3個家族,PLA1、PLA2和patatin-related PLA(pPLA),它們分別催化膜甘油磷脂在sn-1、sn-2以及sn-1和sn-2位上的?；狻Ｃ總€家族都由結構、催化和生理特性不同的多種磷脂酶亞型組成。與磷脂酶PLC和PLD相比,有關植物PLA基因功能的研究極為缺乏。

本研究克隆了桑樹磷脂酶PLA1其中1個亞型PLA1-2D,該亞型包括4個基因,分別命名為MaPLA1-2D.1～MaPLA1-2D.4。蛋白序列分析發現,MaPLA1-2D亞型4個蛋白的分子量介于45～50 kD之間,4個蛋白均為親水蛋白且不穩定。MaPLA1-2D與擬南芥花藥不開裂基因(DAD1,defective in anther dehiscence1)的序列具有相似性。同擬南芥DAD1類似,MaPLA1-2D各成員均具有酯酶盒GHSLG和PLA1保守結構域(PLN02408),且蛋白定位在葉綠體,推測MaPLA1-2D與DAD1可能在功能上具有一些相似性[18]。本研究表明,桑樹MaPLA1-2D成員在冬芽、葉片、根、雌雄花中都有表達,其中葉片和根的表達量顯著高于其他組織,暗示MaPLA1-2D可能在桑樹營養生長發育中發揮功能。

研究表明,植物PLA1基因啟動子區含有多種脅迫應答順式元件且受生物或非生物脅迫誘導,如油菜(Brassicanapus)[2,7,19]、亞麻芥(Camelinasativa)[5]、玉米(Zeamays)[6]、百合(Liliumbrownii)[8]、水稻(Oryzasativa)[9,20]、大豆(Glycinemax)[21]和茄子(Solanummelongena)[22]等。對MaPLA1-2D各成員的啟動子區序列進行分析發現,各成員啟動子區含有干旱響應元件、低溫響應元件及ABA、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)或乙烯(Ethylene)、赤霉素(GA)的響應元件等與脅迫應答相關的順式元件,表明MaPLA1-2D基因可能在桑樹應答非生物脅迫中發揮廣泛作用。本研究表明,桑樹MaPLA1-2D各成員基因表達均在干旱和ABA處理后劇烈上調,MaPLA1-2D.2還受高鹽處理顯著誘導,表明MaPLA1-2D基因在這些非生物脅迫中發揮功能。

磷脂酶A1參與的α-亞麻酸合成過程是茉莉酸和茉莉酸甲酯合成途徑中的第一步[19,23-25]。擬南芥AtDAD基因通過參與JA合成調節花藥開裂。AtDAD基因編碼1個磷脂酶A1,主要在葉片、根和花藥中表達,AtDAD1的T-DNA插入突變植株表現為雄性不育,其花藥不能正常開裂[18]。dad1突變體花蕾內茉莉酸(JA)及其甲酯(MeJA)含量只有野生型的22%,外源施用適量JA或JA合成前體亞麻酸可使突變體花粉發育恢復正常水平[18]。辣椒(Capsicumfrutescens)CaPLA1基因在擬南芥中過表達后,轉基因植株比野生型植物生長得更快,表現出較長的根、葉、葉柄和花序[10]。麻瘋樹(Jatrophacurcas)JcDAD1基因通過參與JA合成途徑調節花和果實的發育[11]。有關植物PLA1或DAD基因在應答干旱和其他脅迫中的功能鮮見報道。由于桑樹的遺傳轉化非常困難,下一步構建MaPLA1-2D異源表達轉基因植株將有助于進一步明確MaPLA1-2D在脅迫應答中的功能。此外,ABA、Ethylene、SA和JA被視為脅迫響應激素,植物通過靈活調節激素水平和信號來適應多種生物或非生物脅迫[19,25-26]。植物已經進化出多種策略來整合外源脅迫信號和內源發育信號,從而優化生長和脅迫反應之間的平衡,除了在正常條件下調控植物生長發育,還介導了各種環境脅迫反應的應答,從而調節植物的生長適應性。桑樹MaPLA1-2D基因啟動子區有多個ABA響應元件、JA響應元件和SA響應元件,其在激素介導的非生物脅迫適應性中的功能還需要進一步研究闡明。