貴州西北喀斯特區古茶樹葉片解剖結構及抗旱性評價

仇 杰,高 超,羅洪發

(1 貴州大學貴州省森林資源與環境研究中心/貴州省高原山地林木培育重點實驗室/林學院,貴陽 550025;2 貴州大學 農學院,貴陽 550025)

古茶樹是指分布于天然林中的野生古茶樹及其群落,以及半馴化人工栽培的野生茶樹和人工栽培百年以上古茶園(林)中的茶樹[1]。作為茶樹起源地之一,貴州境內20多個縣(市)均有古茶樹分布,歷史悠久,資源豐富[2]。貴州省西北部畢節市七星關區有著“中國古茶樹之鄉”的稱號,隸屬于七星關區的亮巖鎮擁有著全區大部分古茶樹資源,可為茶樹育種提供基礎資料[3];其地理氣候獨特,土壤環境適宜,為古茶樹持續發展提供了得天獨厚的良好條件。茶樹喜陰喜濕,適宜的水分條件和空氣濕度為良好的茶葉品質提供保障。然而近年來隨著全球氣候變暖,大氣溫度有增無減。干旱是農業生產中的主要限制因子之一,植物在形態、生理、生化、細胞和分子水平上進化出一系列機制來克服水分虧缺或干旱脅迫[4]。干旱脅迫對茶葉產量的影響在世界上許多茶葉種植區都有報道,包括南非[5]、印度[6-7]、坦桑尼亞[8]等地。而貴州省近20年來有約70%的概率會發生高溫、干旱的極端氣候條件[9],這嚴重制約著茶樹的生長,對茶葉品質產生了極大的影響,因此,關于其抗旱性的研究應予以充分重視。

植物的內外結構表現是在所處環境條件中長時間適應的結果,可將解剖結構特征作為研究植物抗旱性的1個主要評價指標。環境的變化容易導致葉片解剖結構發生變化以保證機體功能的正常運轉[10],這種變化也將植物長期適應于生態條件的特點體現得淋漓盡致,在各種選擇壓迫下呈現出對不同逆境的響應類型。研究表明,葉片是可塑性較高的器官,長時間的缺水往往會導致葉片解剖結構指標發生變化以適應干旱脅迫所帶來的傷害[11]。

近年來,隨著研究的不斷拓展和深入,關于抗旱性的研究已廣泛涉及多個層面,包括生理生化特性、激素誘導、抗旱基因組等諸多方面[12-14]。而利用貴州古茶樹葉片解剖結構指標來評價其抗旱性的研究少有報道,僅楊鳳等[15]通過野生茶樹扦插苗葉片解剖結構的4個指標來初步評價了其抗旱性。目前尚未見貴州省西北喀斯特區野生古茶樹葉片解剖結構及其抗旱性的相關研究報道。野生古茶樹品質特征和遺傳多樣性獨特,是稀缺優質的良種選育資源。本研究擬利用貴州西北喀斯特區畢節市亮巖鎮30個點古茶樹的葉片解剖結構比較分析,明確貴州西北喀斯特區古茶樹葉片解剖結構特征,并對其抗旱性進行綜合評價,旨在篩選出亮巖鎮抗旱性較強的古茶樹,為高抗旱茶樹品種選育、延續優質的古茶樹資源以及發展茶產業提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 研究區概況

試驗地位于貴州省西北地區畢節市七星關區亮巖鎮,其海拔780～1 600 m,年均氣溫13.2 ℃,1月平均氣溫4.5 ℃,7月平均氣溫21.5 ℃,年降水量1 121.6 mm,年無霜期為280 d,茶樹生長期較長。該地屬典型的喀斯特溶巖山區[3]。

1.2 試驗材料

在亮巖鎮選擇具有代表性的古茶樹分布區,于2021年4月11日上午8:00-10:00進行采樣,樣點根據采樣先后分別命名為bj-1,bj-2,…,bj-30,共計30個樣點,詳細信息見表1。每個樣點按“S”形選擇5株樹,每株古茶樹采集樹冠向陽面第5～7節位、成熟且無病蟲害葉片3片,共9片,將每個樣點45片葉片混合均勻,隨機選取3片作為試驗材料。先以葉片主脈為中心剪切成5 mm×5 mm的葉片方塊,再避開主脈剪切5 mm×5 mm的葉肉組織方塊,隨即放入卡諾液(V無水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)中固定12 h,而后抽氣并轉入70%酒精中置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 試驗方法

葉片解剖結構采用常規石蠟切片法來觀測,將材料用酒精逐級脫水處理,再用酒精和二甲苯處理后在不同溫度條件下使材料充分浸蠟后包埋[16]。用掃描電鏡觀察葉片氣孔,石蠟切片機 (Leica RM2235) 切片,后經固綠染色等步驟,于顯微鏡(Leica DM2500)下觀察拍照保存。將采集回來的新鮮葉片剪小粘放在樣品臺上后放置在離子濺射儀(MSP-mini)中噴金鍍膜,在掃描電子顯微鏡(Hitachi TM4000 plus)200倍和2 000倍下觀察拍照。利用Image J軟件測量葉片厚度(LT)、上表皮厚度(TU)、下表皮厚度(TL)、柵欄組織厚度(TP)、海綿組織厚度(TS)、葉脈厚度(VT)、上角質層厚度(TUS)、下角質層厚度 (TLS)、氣孔長(SL)、氣孔寬(SW)。

依據以上測定結果計算柵海比(PS)、組織結構緊密度(CTR)、組織結構疏松度(SR)、葉脈突起度(VPD)、氣孔密度(SD)。計算公式如下:

kPS=δTP/δTS

(1)

kCTR=δTP/δLT

(2)

kSR=δTS/δLT

(3)

kVPD=δVT/δLT

(4)

DSD=n/A

(5)

cv=σ/μ

(6)

式中:n為氣孔個數;A為視野面積;cv為變異系數;σ為標準差;μ為平均值。

1.4 數據處理

利用Excel 2013統計并計算相關數據,用SPSS 20.0對數據進行描述性及方差分析、鄧肯多重比較,利用Origin進行相關性分析和聚類分析,Photoshop 2019處理圖片。

聚類分析后各類中典型指標的篩選依據相關指數的大小來進行選擇,相關指數與代表性呈正相關[17]。其計算公式為:

(7)

采用隸屬函數法綜合評價30株古茶優良單株的抗旱性,計算公式為:

f(xi)=(Xi-Xi,min)/(Xi,max-Xi,min)

(8)

式中:f(xi) 為抗旱隸屬函數值;Xi為某項指標的測定值;Xi,min和Xi,max分別為某一測定指標中的最小值和最大值。如果某一項指標與其對應優株抗旱性呈負相關,則利用反隸屬函數進行轉換,計算公式為:

f(xi)=1-(Xi-Xi,min)/(Xi,max-Xi,min)

(9)

根據式(7)～(9)計算各優良單株抗旱性解剖結構指標的平均隸屬度,用平均隸屬度來評價抗旱性,平均隸屬度越大,抗旱性越強。

2 結果與分析

2.1 古茶樹葉片解剖結構特征

通過對茶樹葉片石蠟切片觀察發現,其由上角質層、上表皮、柵欄組織、海綿組織、下表皮、下角質層、氣孔(圖1,A、B)以及葉脈(圖1,C)組成。

上下表皮均由一層近似矩形的細胞排列而成,柵欄組織附著于上表皮下方,大多由2層不規則的長柱形細胞排列而成(圖1,A),極少數葉片排列有3層柵欄組織(圖1,B),細胞間排列緊湊。海綿組織相對柵欄組織排列較為疏松,由近似橢圓的細胞組成,大小不一,細胞間隙大。

葉片主脈由厚角組織、木質部、韌皮部、薄壁組織等組成(圖1,C)。氣孔由2個腎形保衛細胞包圍(圖1,D)。30個點茶樹葉片、葉脈、氣孔顯微結構如圖1,E-G所示。

2.2 古茶樹葉片解剖結構指標的比較分析

葉片的解剖結構特征與植物的抗旱性密切相關。表2～4顯示,亮巖古茶樹葉片、葉脈、氣孔等解剖結構特征參數在樣點間均存在著顯著差異。各指標參數的變異系數以柵欄組織厚度、柵海比、組織結構緊密度較大,分別為41.21%、35.45%和30.55%,以葉脈厚度、葉脈突起度和上表皮厚度較小,分別為7.31%、14.39%和16.23%,在樣點間表現比較穩定。

2.2.1 葉片解剖結構葉片厚度通常可作為抗旱性研究的指標之一[18],所有供試材料中葉片厚度處于177.00(bj-5)～369.40(bj-13)μm之間,平均值為247.24 μm,變異系數為17.98%,表現相對穩定;葉片上表皮、下表皮厚度分別處于14.16(bj-26)～ 24.55 μm(bj-13)和13.26(bj-25)～21.97 μm(bi-19)之間,平均厚度分別為19.02 μm和17.74 μm,總體表現為下表皮略薄于上表皮;多層的柵欄組織是植物抗旱性強的表現之一,本研究中bj-13葉片柵欄組織為3層,厚度最大(187.86 μm),而整體平均厚度為89.29 μm,變異系數為41.21%,波動較大,穩定性較差。海綿組織厚度平均值為117.87 μm,在83.46(bj-8)～170.54 μm (bi-1)之間,變異系數為19.06%,表現較為穩定。

葉片上下表皮均覆蓋有厚度不一的角質層,可減小葉表面除氣孔外的水分散失[19],上、下角質層平均厚度分別為3.41 μm和2.58 μm。柵海比、組織結構緊密度和組織結構疏松度反映了柵欄組織、海綿組織與葉片厚度之間的關系,其平均值分別為0.76、0.35和0.48。柵海比的變異系數相對較大(35.45%),穩定性較差。

2.2.2 葉脈和氣孔解剖結構葉脈平均厚度為808.62 μm,其變異系數在所有指標中最小(7.31%),表現穩定。葉脈突起度反映了葉脈與葉片間的相互關系,具有一定的遺傳穩定性。

古茶樹葉脈突起度平均值為3.35,在2.39(bj-13)～4.23(bj-24)范圍內變化,變異系數為14.39%,表現相對穩定。氣孔長、寬平均值分別為15.04 μm和6.38 μm,變異系數分別為15.04%和6.38%。氣孔密度平均為141.32個/mm2,最小的是bj-2(87.43個/mm2),最大的是bj-14(260.86個/mm2),變異系數為23.66%。

2.3 古茶樹抗旱性綜合評價

2.3.1 古茶樹抗旱性解剖結構指標篩選評價抗旱性的最優方案首先要篩選出彼此獨立且具有代表性的指標[20]。據此,對亮巖鎮30個點古茶樹葉片解剖結構的15項指標進行聚類分析(圖2),當閾值在0.8～0.9之間時,15項指標可劃分為4類。第Ⅰ類指標包括葉片厚度、柵欄組織厚度、緊密度、柵海比、上表皮厚度、海綿組織厚度、葉脈厚度、上角質層厚度、氣孔寬以及氣孔密度;第Ⅱ類指標是下表皮厚度;第Ⅲ類指標為下角質層厚度;第Ⅳ類指標分別是氣孔長、疏松度和葉脈突起度。

同時,對亮巖鎮30個點古茶樹葉片解剖結構的15項指標進行相關性分析,其結果表明各指標間存在一定程度的相關性(表5)。其中,葉片厚度與其他大部分指標間都存在顯著的相關性;與組織結構疏松度和葉脈突起度為極顯著負相關,相關系數分別為-0.43和-0.87;與除下角質層厚度和氣孔長度外的其余指標均為顯著正相關關系。葉片上表皮厚度與下表皮、柵欄組織、海綿組織和葉脈厚度之間均為極顯著正相關,與葉脈突起度之間呈顯著負相關。葉片下表皮厚度與海綿組織厚度和葉脈厚間呈極顯著正相關關系。柵欄組織厚度與海綿組織厚度、葉脈厚度、柵海比以及組織結構緊密度間存在極顯著正相關關系,與組織結構疏松度和葉脈突起度存在極顯著負相關關系。海綿組織厚度與除氣孔寬度、柵海比以及氣孔密度外的其他指標間均存在顯著相關關系。葉脈厚度與除氣孔長和疏松度外的其他指標間均存在顯著相關關系。上角質層厚度與氣孔寬和緊密度存在極顯著正相關關系,下角質層厚度與葉脈突起度間呈顯著正相關關系。柵海比、緊密度、疏松度、葉脈突起度以及氣孔密度與其他大部分指標間均有較強的正或負相關,而氣孔長和氣孔寬與其他大部分指標間相關關系不明顯。

根據統計學相關知識、相關矩陣及聚類分析結果,按照公式(7)計算各類中各指標的相關指數,排序整理得到表6,典型指標為同類中相關指數最大的指標,如出現相關指數相同的情況,則再比較變異系數,選擇變異系數較大的指標作為典型指標[21]。如表6所示,第Ⅰ類指標中柵欄組織厚度的相關指數最大(0.327),選擇該指標為第Ⅰ類的典型指標;第Ⅱ類和第Ⅲ類指標由于都只有1個指標,故下表皮厚度和下角質層厚度為第Ⅱ類和第Ⅲ類的典型指標;第Ⅳ類中葉脈突起度相關指數(0.165)在同類中排序第一,選擇它為第Ⅳ類的典型指標。綜合以上分析,最終選擇柵欄組織厚度、下表皮厚度、下角質層厚度以及葉脈突起度作為評價亮巖古茶樹抗旱性的典型指標。

2.3.2 古茶樹抗旱性綜合評價根據篩選出的4個典型指標,依據公式(8)和公式(9),應用隸屬函數法對亮巖鎮30個點的古茶樹進行抗旱性綜合評價。根據平均隸屬度大小排序,平均隸屬度大,抗旱性強,平均隸屬度小,抗旱性弱。結果(表7)表明:30個點的古茶樹的抗旱性排序前5位依次為bj-15、bj-16、bj-29、bj-10和bj-24,抗旱性較強;抗旱性排序靠后的有bj-22、bj-20、bj-2、bj-11以及bj-6,抗旱性較弱;其他20個點的抗旱性居中。

表7 古茶樹抗旱性綜合性評價

3 討 論

近年來,隨著茶產業興起,貴州各地需要大量優質的茶樹資源,貴州西北喀斯特區野生古茶樹作為茶樹種質資源的一部分,研究其抗旱性有助于為茶園建設提供優良的育種材料、豐富貴州喀斯特區茶樹種質資源庫[22-23]。在非生物因素約束下,植物會發生一系列的形態、生理、生化和分子變化,并表現出各種不利癥狀,如褪綠、壞死、生長緩慢等,最終對植物的生長和產量產生不利影響[24]。在干旱脅迫條件下,植物光合作用、相對含水量、膜完整性、色素含量、滲透勢、碳水化合物狀態、抗氧化代謝、植物激素和調節基因都受到影響。葉片作為植物光合作用等生命代謝活動的重要器官,對于逆境脅迫的反應最為敏感[25-26],因此,葉片常常被作為主要研究對象。

關于葉片解剖結構與抗旱性間關系的研究已有諸多報道,前人研究認為抗旱性強的茶樹品種葉片形態結構表現為角質層、柵欄組織和海綿組織厚度較大,其排列更加緊密,厚度越大,抗旱性越強[27-28]。在干旱脅迫下,越厚的角質層越有助于減少水分蒸發、增強邊界阻力以保水及支撐葉片形態,上下表皮對于保護植物組織具有積極意義,它在復雜的外部環境與植物葉片組織間筑起一道屏障,可減輕高溫帶來的傷害[16,29]。本研究結果表明,30個點的古茶樹抗旱性與其葉片下角質層厚度、氣孔長等大小順序較為一致,而與氣孔密度等排列順序有較大差異。說明用單個指標來評價古茶樹抗旱性的結果誤差較大,應結合多項指標綜合評價。王煙霞等將葉片角質層厚度、葉片厚度、組織結構緊密度作為評價不同楊樹(Populusspp.)抗旱性的主要指標;曾雯珺認為葉片厚度、氣孔開度以及柵海比可以作為評價油茶(Camelliaoleifera)抗旱性的主要指標[30-31]。本研究通過對畢節市亮巖鎮30個點古茶樹葉片解剖結構的指標分析、相關性分析、聚類分析等,從15項指標中篩選出柵欄組織厚度、下表皮厚度、下角質層厚度以及葉脈突起度作為評價亮巖鎮古茶樹抗旱性的典型指標。將柵欄組織厚度作為典型指標與郭燕等對板栗(CastaneamollissimaBl.)的相關研究結果相同;將下表皮厚度作為典型指標與宋彬等的相關研究結果[32-33]相同。徐揚等將上角質層厚度列為4種蘋果屬抗旱性研究比較分析的典型指標之一,認為下角質層厚度與其他指標間差異不顯著。張義等將上表皮厚度和葉脈厚度作為評價11種植物抗旱性的典型指標[34-35]。本研究將古茶樹葉片下角質層厚度和葉脈突起度作為典型指標與前人研究結果不完全一致,植物抗逆性中典型指標的選擇可能會因植物種類、生長環境、發育時期等的不同而不同[36]。筆者研究發現,亮巖鎮古茶樹葉片上下角質層厚度之間存在顯著的正相關關系,而葉脈突起度是葉脈厚與葉片厚之間的比值,組成葉脈之一的木質部中含大量的木質素,木質素又是植物細胞壁的主要組成成分,保護植物細胞和組織免受不利影響。相關研究表明,木質素含量與植物抗逆性呈正相關[37-38]。因此,選擇下角質層厚度和葉脈突起度這兩個指標來評價亮巖鎮古茶樹抗旱性也可能具有積極意義。

隸屬函數法是一種基于測定多項指標、可較為準確地對植物某一特性進行綜合評價的方法,其操作更加方便快捷,其結果更為真實可靠。本研究利用隸屬函數法從15項解剖結構指標篩選出4項指標來評價貴州省西北地區古茶樹的抗旱性,篩選出的抗旱性表現較強的古茶樹bj-15、bj-16、bj-29、bj-10、bj-24立地平均海拔1 357.04 m,而抗旱性表現較弱的古茶樹bj-22、bj-20、bj-2、bj-11、bj-6立地平均海拔1 138.38 m。海拔梯度可以反映溫濕度、光照、土壤等植物生長環境的諸多因子,因而可以作為研究植物適應性的重要參考指標[39]。前人研究發現,不同物種隨海拔高度的升高,其葉片上下表皮及厚度會呈現不同的變化趨勢[40-41]。本研究中古茶樹葉片上下表皮及厚度對海拔的適應并不明顯,而篩選出的抗旱性較強的5株茶樹下角質層平均厚度排在供試材料前列,說明此區域古茶樹下角質層厚度有隨海拔升高而增加的趨勢,進而增強古茶樹對環境條件的適應能力。葉片柵欄組織內含葉綠體,葉綠體數量隨柵欄組織層數的增加而增加。柵欄組織厚度的增加還可加快水分從維管束到表皮的運輸速度,從而保證光合作用原料的供應[42]。本研究發現,亮巖鎮不同海拔的古茶樹葉片柵欄組織與海綿組織分化明顯,為典型的異面葉。抗旱性強的古茶樹海拔相對較高,其柵欄組織也相對較厚,說明海拔高的古茶樹長期受低溫和強光的影響,更趨向于分化更多的柵欄組織以增強光合作用從而保護植物免受傷害,這與前人研究[43]基本一致。此外,從葉脈厚度來看,抗旱性較強的古茶樹顯著高于抗旱性較弱的古茶樹,這也可能與其所處的海拔高度有關。隨著海拔的不斷升高,古茶樹葉片可能會伴隨生理性缺水的現象發生,為適應這一現象,葉脈增厚以使植物體內水分及營養運輸能力和支撐葉片能力提高,這也是植物適應環境變化的體現[44-45]。植物抗旱性是多方面交互作用的結果,進一步研究貴州西北喀斯特區古茶樹的抗旱性,還需結合生理生化指標及氣候因子綜合分析,并從抗旱基因等層面來深入探究。