二甲雙胍通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡對子癇前期大鼠的保護作用

寧蓓蓓,馬惠靜,鄧麗君,賈 冉,楊海瀾

0 引言

子癇前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期特發(fā)疾病,臨床表現(xiàn)以高血壓、蛋白尿為主,每年全世界有7萬多名產(chǎn)婦和50萬名胎兒因其死亡,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期發(fā)病和死亡的主要原因[1-2]。在過去的20年,PE的研究取得了重大進展,盡管其潛在的發(fā)病機制仍不明確。胎盤是妊娠期發(fā)育的獨特器官,充當母體和胎兒系統(tǒng)之間的交換界面,正常妊娠時滋養(yǎng)層細胞侵入到母體子宮螺旋動脈,在胎兒-母體界面形成血管竇,為胎兒提供營養(yǎng)[3]。滋養(yǎng)層細胞過度凋亡和侵入能力降低,螺旋動脈重塑失敗,胎盤灌注不足,導致胎盤缺血缺氧,從而引起子癇前期的一系列癥狀[4]。因此,過度的胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡與PE的發(fā)生有密切關系。

有研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)可導致PE患者胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡,這一發(fā)現(xiàn)已成為PE胎盤病理學的一個重要特征[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)可能是一種誘導凋亡的重要細胞器,這種凋亡可能不依賴線粒體或死亡受體途徑[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中存在許多伴侶蛋白和折疊酶,當ER受到缺氧等因素的刺激時,ER腔中未折疊或錯誤折疊的蛋白會聚集并破壞細胞的正常生理功能,導致ERS發(fā)生[7]。未折疊蛋白反應(Unfolded protein response,UPR)是一種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和細胞穩(wěn)態(tài)的適應性機制,目的是將細胞恢復到生理狀態(tài)[8]。然而,當UPR不能糾正蛋白質(zhì)積累時,ERS延長,并可導致細胞死亡途徑激活,進而對妊娠結(jié)局和胎盤形成不利影響[9]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein,GRP78)作為ERS的伴侶蛋白,維持蛋白質(zhì)在ER腔內(nèi)的正確折疊和轉(zhuǎn)運,靶向錯誤折疊的蛋白質(zhì),促進蛋白質(zhì)組裝,恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能,并調(diào)節(jié)URP的激活[10]。半胱天冬氨酸蛋白酶12 (Caspase-12)是ERS的特異性凋亡途徑,當ERS嚴重或持續(xù)時,某些信號通路被激活,導致其表達增加,隨后誘發(fā)凋亡[11]。

目前,治療PE的方法主要是適時終止妊娠。因此,探索安全有效的預防和治療藥物十分必要。二甲雙胍是一種雙胍類藥物,除了抗血糖作用,還可以抗衰老[12]、抗腫瘤[13]、抗炎[14]、抗凋亡[15]等。研究表明,二甲雙胍在妊娠早期是安全的,沒有先天畸形的風險[16]。在妊娠期間使用可能會導致2型糖尿病患者體重增加和胰島素劑量減少;對于胎兒,二甲雙胍可以減少低血糖和巨大兒的發(fā)生,但可能會增加小于胎齡嬰兒的發(fā)生率[17]。最近,研究者們開始關注二甲雙胍與ERS之間的關系。有報道,二甲雙胍可以通過減少ERS相關凋亡對疾病起到保護作用。ERS的研究不僅有助于進一步了解PE誘導胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡的分子機制,而且為PE的臨床防治提供了新的解釋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Sprague Dawley(SD)雌性大鼠30只,6～8周齡,體重220～260 g,由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供,動物許可證號：SCXK(晉)2019-004。

1.1.2 儀器和試劑 大鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)購自南京卡爾文生物科技有限公司;MK3酶標儀購自美國Thermo Fisher公司;鹽酸二甲雙胍腸溶片購自貴州天安藥業(yè)股份有限公司(貨號：H20073383);N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)購自美國Sigma公司(貨號：N5751);蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號：A045-2-2);TUNEL試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(貨號：MK1015);反轉(zhuǎn)錄試劑盒,購自北京全式金生物公司(貨號：AU341)。

1.2 方法

1.2.1 子癇前期大鼠模型建立及分組 雌性未育SD大鼠發(fā)情期與成年雄性大鼠過夜交配(雌性∶雄性=2∶1),交配后次日晨,用棉簽從大鼠陰道獲得分泌物,將其涂抹在載玻片上,在光學顯微鏡下觀察。陰道涂片中精子的存在表明妊娠第0天。30只成功受孕SD大鼠隨機分為對照組、PE組和二甲雙胍組。PE組和二甲雙胍組均從妊娠第14天開始皮下注射200 mg/kg L-NAME,持續(xù)5 d;對照組從妊娠第14天開始皮下注射等量生理鹽水,持續(xù)5 d;二甲雙胍組從妊娠第14天開始灌胃給予二甲雙胍200 mg/kg,持續(xù)5 d。PE組和對照組在相應的妊娠天數(shù)采用相等劑量的等滲鹽水灌胃。

1.2.2 收縮壓測量 用大鼠無創(chuàng)血壓系統(tǒng)測量孕鼠妊娠第0天、妊娠第12天、妊娠第15天、妊娠第19天的收縮壓,測量3次取平均值。

1.2.3 24 h尿蛋白測定 于妊娠第12天、妊娠第19天將大鼠轉(zhuǎn)移到代謝籠中收集24 h尿液,記錄尿量,使用考馬斯亮藍法測定24 h尿蛋白。

1.2.4 標本采集 妊娠第20天剖宮取胎,記錄胎鼠頂臀長、體重及胎盤直徑、重量,并將每組胎盤組織隨機分為兩部分,一部分放于多聚甲醛溶液中,另一部分存放于-80 ℃冰箱中進行下一步分析。

1.2.5 RT-qPCR法 取出-80 ℃冰箱中胎盤組織,用 TRIZOL試劑提取總RNA。測定總RNA濃度及純度。將RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用熒光定量試劑盒、PCR儀進行測定,檢測胎盤組織中GRP78、caspase-12 mRNA的表達,使用β-atcin作為參考基因,用 2-ΔΔCT分析方法計算樣本目的mRNA相對表達量。引物序列：GRP78上游引物：CGGAGGAGGAGGACAAGAAGGAG,下游引物：ATACGACGGTGTGATGCGGTTG。caspase-12上游引物：TGCCAATTCCGACAAACAGC,下游引物：TTTCCCCTGGATTCTGATGC。β-actin上游引物：CGCTTCGGCAGCACATATAC,下游引物：TTCACGAATTTGCGTGTCATC。

1.2.6 Western blot法 用蛋白裂解液從胎盤組織中分離總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,取50 μg蛋白,加蛋白上樣緩沖液煮沸10 min,通過SDS-PAGE電泳分離,隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h,加入GRP78(1∶1 000)、caspase-12(1∶500)、β-actin(1∶10 000)抗體,4 ℃搖床過夜孵育,次日TBST洗膜共3次,每次10 min,加入熒光標記的山羊抗兔二抗,室溫孵育2 h,再次洗膜,化學發(fā)光試劑盒進行條帶觀察。采用ImageJ圖像分析軟件進行蛋白灰度值分析,獲得相對于β-atcin的蛋白表達水平。

1.2.7 TUNEL染色 將多聚甲醛中胎盤組織取出,進行脫水包埋制成切片,將切片脫蠟。按照TUNEL試劑盒說明書進行染色,顯微鏡下觀察結(jié)果,細胞核中有黃色或棕黃色顆粒的細胞即為發(fā)生凋亡的細胞。

2 結(jié)果

2.1 收縮壓和24 h尿蛋白情況 三組在妊娠第0天和妊娠第12天血壓水平差異無統(tǒng)計學意義。與對照組相比,PE組在妊娠第15天與第19天收縮壓升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),應用二甲雙胍可降低子癇前期大鼠收縮壓水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。此外,三組24 h尿蛋白在妊娠第12天差異無統(tǒng)計學意義,妊娠第19天,24 h尿蛋白PE組明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),但應用二甲雙胍后,降低了24 h尿蛋白的升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 三組大鼠收縮壓水平比較(mmHg)

表2 三組大鼠24 h尿蛋白水平比較(mg/24 h)

2.2 妊娠結(jié)局 與對照組相比,PE組的胎鼠體重下降(P<0.05),頂臀長較短(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義,但應用二甲雙胍后,胎鼠體重與頂臀長接近正常水平。此外,各組間胎盤重量與直徑無統(tǒng)計學差異。見圖1。

圖1 三組胎鼠頂臀長、重量及胎盤生長情況

2.3 大鼠胎盤組織中GRP78和caspase-12 mRNA表達水平 RT-qPCR結(jié)果顯示,與對照組比較,PE組大鼠胎盤中GRP78和caspase-12的mRNA含量均升高(P<0.01)。二甲雙胍組GRP78、caspase-12的mRNA表達與PE組比較顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

2.4 大鼠胎盤組織中GRP78和caspase-12蛋白表達水平 Western blot的結(jié)果顯示,與對照組大鼠相比,PE組大鼠胎盤組織中GRP78和caspase-12蛋白水平均過表達(P<0.01)。與PE組大鼠相比,二甲雙胍處理后,大鼠胎盤組織中GRP78和caspase-12蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 三組大鼠胎盤組織中GRP78和caspase-12蛋白表達情況

2.5 大鼠胎盤組織凋亡情況 TUNEL結(jié)果顯示,PE組胎盤組織中可見大量凋亡細胞,而對照組與二甲雙胍組中僅有少量凋亡細胞。見圖4。

圖4 各組大鼠胎盤組織凋亡情況(200×)

3 討論

PE作為妊娠期高血壓疾病的一種典型類型,是多種病因共同作用的綜合征。PE與胎盤滋養(yǎng)細胞關系密切,滋養(yǎng)細胞過度凋亡可導致螺旋動脈重塑過程失敗,導致胎盤功能失調(diào),從而發(fā)生高血壓、蛋白尿等臨床癥狀[18]。L-NAME用于構(gòu)建PE大鼠模型,經(jīng)L-NAME處理的大鼠與PE女性的高血壓和高蛋白尿癥狀相同[19]。研究表明,二甲雙胍可能在治療或預防PE中發(fā)揮作用。二甲雙胍具有促進血管生成[20]、抗炎[21]、抑制氧化應激[22]等作用,在治療和抑制PE相關并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明,L-NAME誘導的大鼠血壓和尿蛋白均升高,而二甲雙胍干預可以有效降低L-NAME誘導的PE大鼠的高血壓和高尿蛋白,改善PE大鼠不良妊娠結(jié)局,改善ERS誘導的細胞凋亡,保護胎盤組織。

GRP78作為ERS的標志性分子,參與細胞的ERS反應,維持蛋白質(zhì)在ER中的正確折疊和轉(zhuǎn)運,其表達水平與PE的發(fā)生有一定的關系[23]。當ERS持續(xù)時間過長,未折疊蛋白大量積累,調(diào)節(jié)能力失衡,導致胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡[24]。然而,滋養(yǎng)層ERS并不直接引起滋養(yǎng)層細胞凋亡,而是通過下游caspases的激活,其中caspase-12途徑是ERS凋亡途徑中比較特異的途徑[25]。正常生理情況下,caspase-12與其他的caspases一樣,以無活性的酶原形式存在,當缺氧等條件觸發(fā)ERS時,Ca2+平衡紊亂,激活caspase-12,進而激活其下游的分子,導致胎盤滋養(yǎng)層細胞發(fā)生凋亡[26-27]。本研究采用RT-qPCR和Western blot法對胎盤ERS標志物GRP78及caspase-12在基因及蛋白水平的表達進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PE組大鼠胎盤中GRP78、caspase-12在基因及蛋白水平的表達較正常組大鼠顯著增加。這些結(jié)果提示在L-NAME誘導的PE大鼠胎盤中的確存在ERS反應。

先前的研究已經(jīng)注意到二甲雙胍在抑制子癇前期相關凋亡中的作用,且驗證了二甲雙胍藥理學濃度對滋養(yǎng)層細胞的安全性,對滋養(yǎng)層細胞活力無不良影響。Zhang等[28]研究表明,二甲雙胍一部分通過抑制NLRP3炎癥小體誘導細胞凋亡,一部分通過抑制TLR4/NF-κB信號通路和阻斷轉(zhuǎn)錄因子NF-κB1與啟動子PFKFB3的結(jié)合來糾正糖代謝重編程和氧化應激,從而起到對滋養(yǎng)層細胞的保護作用。Ding等[29]研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可以通過調(diào)節(jié)UCA1/miR-204/MMP-9信號通路抑制滋養(yǎng)層細胞的遷移,從而預防PE。本研究中,我們推測二甲雙胍可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡對PE大鼠具有保護作用。結(jié)果顯示,與PE組相比,經(jīng)二甲雙胍處理后,ERS相關標志物GRP78和caspase-12的基因和蛋白表達水平下降。TUNEL結(jié)果也顯示,二甲雙胍改善了PE大鼠的胎盤組織細胞凋亡情況。PE出現(xiàn)過度的ERS時,二甲雙胍可以降低過度的ERS,從而抑制胎盤滋養(yǎng)層細胞發(fā)生凋亡。

總之,本研究顯示了二甲雙胍在PE大鼠中的保護作用,在減輕ERS誘導的細胞凋亡方面有明顯的益處。鑒于這些發(fā)現(xiàn),預防ERS誘導的相關凋亡可能是減輕PE癥狀的新靶點。然而,我們沒有對胎兒的短期和長期風險和益處進行進一步研究,并且應用二甲雙胍的時間和劑量也沒有準確的定義,這些問題可能為二甲雙胍應用于PE開辟新的研究方向,為二甲雙胍使用提供證據(jù)。