白樺脂酸調節AMPK/mTOR/ULK1信號通路對冠心病大鼠血管平滑肌細胞自噬和凋亡的影響

毛治尉,王東偉,武永新,張 濤

0 引言

冠心病是目前世界范圍內常見的心臟病之一,是我國心臟病病例中住院率和死亡率最高的疾病類型[1]。冠心病主要是由于冠狀動脈粥樣硬化導致冠脈痙攣和冠脈管腔狹窄改變,使冠狀動脈供血相對不足,最終導致心肌細胞出現缺氧、缺血[2]。血管平滑肌細胞是構成血管壁的主要細胞,血管內皮炎癥貫穿了冠狀動脈粥樣硬化的始終,能引起血管平滑肌細胞異常增殖、凋亡、血管內皮損傷等[3]。因此,研究如何調節血管平滑肌細胞的功能,對治療冠心病具有重要意義。白樺脂酸是大量存在于樺木屬植物,如白樺樹皮中的一種五環三萜類化合物。藥理學研究發現,白樺脂酸具有抗炎、抗腫瘤、抗HIV、抗潰瘍等生物活性[4-5]。但關于白樺脂酸在冠心病等心血管疾病中的作用和影響還鮮有報道。自噬是一種進化保守的分解代謝途徑,又被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡[6]。研究發現,激活腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)/Unc-51樣自噬激活激酶1(Unc-51-like kinase 1,ULK1)信號通路可以促進細胞自噬[7]。因此,白樺脂酸能否通過調控該信號通路影響冠心病患者血管平滑肌細胞的生物學過程是值得探究的。本研究將以大鼠血管平滑肌細胞為研究對象,探究白樺脂酸對冠心病大鼠血管平滑肌細胞自噬和凋亡的影響和具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只SPF級SD大鼠,雄性,7～10周齡,體重190～220 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,許可證號：SYXK(滬)2022-0012。所有大鼠實驗前在溫度22～24 ℃、相對濕度40%～55%、12 h光照環境下飼養7 d。本實驗經鄭州市中心醫院動物倫理委員會批準(倫理號：20220018)。

1.2 主要試劑與儀器 白樺脂酸購自中國科學院成都生物研究所;垂體后葉素購自南京新貝藥業有限公司;DMEM高糖培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司;PBS、胰蛋白酶購自美國Cell Signaling Technology公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所;RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;Trizol試劑、反轉錄試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;α-平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;FITC標記的IgG二抗購自北京中杉金橋公司;AMPK、mTOR、ULK1、LC3、Bax、Bcl-2、Beclin-1、GAPDH一抗和相應二抗購自Abcam公司。Western印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠冠心病模型的建立 參考文獻方法,構建大鼠冠心病模型[8]。將24只SD大鼠隨機分為對照組和模型組,每組12只。對照組大鼠采用普通飼料正常飼養,模型組大鼠每日使用高脂飼料進行喂養(含10%豬油、87.3%基礎飼料、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶)。連續喂養6周,間隔2周大鼠腹腔注射垂體后葉素(30 μg/kg),1次/d,連續注射3 d,對照組大鼠注射等量的生理鹽水。末次注射后30 min進行心電圖檢查,出現T波高聳、ST段抬高超過0.1 mV、心律不齊,說明造模成功[9]。

1.3.2 血管平滑肌細胞的分離、培養與鑒定 造模成功后處死所有大鼠,解剖,分別取兩組SD大鼠的胸主動脈血管平滑肌,按組織貼塊法進行培養。于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基,37 ℃、5% CO2無菌培養箱中培養。使用0.1%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化傳代細胞。細胞傳代3次后用于后續實驗。在顯微鏡下觀察細胞,細胞應呈梭形或長梭形,可以重疊生長,高低起伏,呈“峰與谷”樣生長狀態。用α-SM-actin單抗通過免疫熒光染色法鑒定血管平滑肌細胞的特異性肌動蛋白。具體操作：用4%多聚甲醛固定細胞后,加入山羊血清孵育,加入一抗α-SM-actin單抗(1∶100)、FITC標記的IgG二抗(1∶100)、加入DAPI工作液,最后加入抗熒光猝滅劑,在激光共聚焦顯微鏡下觀察和拍照。

1.3.3 細胞分組與處理 細胞經鑒定為血管平滑肌細胞后,取對數生長期血管平滑肌細胞,以1×104個/孔的密度接種于96孔板中,待細胞貼壁后,將從對照組大鼠中分離培養的血管平滑肌細胞記為正常組(Control組),將從模型組大鼠中分離培養的血管平滑肌細胞隨機分為模型組(Model組)、低濃度(20 μmol/L)白樺脂酸組(BA-L組)、高濃度(40 μmol/L)白樺脂酸組(BA-H組)[10]和高濃度(40 μmol/L)白樺脂酸+AMPK抑制劑(10 μmol/L)Compound C組(BA-H+CC組)[11]。繼續培養24 h后加入相應藥物進行處理。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期血管平滑肌細胞,以1×104個/孔的密度,將細胞接種于96孔板中,繼續培養24 h后,對各組細胞進行分組,并加入相應藥物進行處理,每組設置6個復孔。實驗共設置3個檢測時間點：24 h、48 h和72 h。加入相應藥物處理24、48、72 h后,每孔加入10 μl的CCK-8試劑,繼續培養2 h。使用酶標儀檢測450 nm波長下每孔的光密度(OD)值,OD值在一定程度上反映了細胞活力。

1.3.5 細胞流式術檢測細胞凋亡 取處理過的各組細胞加入胰酶消化,離心棄去上清液收集細胞。調整細胞懸液的密度為1×106個/ml,加入PBS洗滌2次,加入400 μl Binding Buffer重懸,加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI試劑,混勻后室溫避光孵育15 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.6 雙熒光體系觀察血管平滑肌細胞自噬小體 取對數生長期的血管平滑肌細胞,以1×105個/ml的密度接種在6孔板中,當細胞匯合至80%后,將mRFP-eGFP-LC3質粒轉染至細胞中,繼續培養6 h后,更換為完全培養基繼續培養24 h[12]。將細胞按“1.3.3”中進行分組和處理后,繼續培養6 h。棄去培養基,加入4%多聚甲醛固定細胞10 min,加入DAPI染色劑對細胞核進行染色。在熒光顯微鏡下觀察細胞內綠色和紅色LC3的亮點(自噬體)的數量。

1.3.7 RT-qPCR實驗檢測大鼠血管平滑肌細胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表達 取對數生長期的血管平滑肌細胞進行相應分組與處理。加入Trizol試劑提取細胞RNA。將提取的RNA按逆轉錄試劑盒說明書操作,反轉錄為cDNA,并以此為模板,進行PCR擴增。反應體系為20 μl,反應條件：95 ℃預變性5 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火40 s,一共循環40次。使用2-ΔΔCt方法計算各組細胞AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表達量。引物序列設計如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.8 Western blot檢測大鼠血管平滑肌細胞中AMPK/mTOR/ULK1信號通路和自噬相關蛋白表達 取對數生長期的血管平滑肌細胞進行相應分組與處理。加入RIPA裂解液提取血管平滑肌細胞總蛋白,使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。蛋白質樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后被轉移到PVDF膜上。在室溫下將膜在脫脂奶粉中封閉2 h,隨后在4 ℃下與一抗AMPK(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、ULK1(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Beclin-1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)孵育過夜。次日,室溫下將膜與相應二抗(1∶5 000)孵育2 h,再用TBST洗滌膜3次,加入ECL顯色劑進行顯色。以GAPDH為內參,使用凝膠圖像處理系統分析目標蛋白的灰度值。

2 結果

2.1 血管平滑肌細胞的鑒定 當培養至第4～6天時,光鏡下觀察到細胞大部分呈長梭形,小部分呈多角形或不規則形;當培養至第10～14天時,細胞呈典型的“峰-谷”樣結構(圖1)。血管平滑肌細胞經免疫熒光染色后,激光共聚焦顯微鏡觀察到標志性分子α-SM-actin在細胞質中沿縱軸呈絲狀排列。α-SM-actin在細胞質發出綠色熒光,細胞核被染為藍色,表明所培養的細胞為血管平滑肌細胞(圖2)。

圖1 原代培養血管平滑肌細胞形態(100×)

圖2 免疫熒光檢測α-SM-actin在血管平滑肌細胞中的表達(400×)

2.2 白樺脂酸對各組血管平滑肌細胞細胞活力的影響 與Control組相比,Model組細胞活力(48 h、72 h)顯著升高(P<0.05);與Model組相比,BA-H組細胞活力(48 h、72 h)顯著降低(P<0.05),BA-L組差異無統計學意義(P>0.05);與BA-L組相比,BA-H組細胞活力(48 h、72 h)顯著降低(P<0.05);與BA-H組相比,BA-H+CC組細胞活力(48 h、72 h)顯著升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組血管平滑肌細胞細胞活力的比較

2.3 白樺脂酸對各組血管平滑肌細胞細胞凋亡率的影響 與Control組細胞凋亡率(12.58%±0.93%)相比,Model組細胞凋亡率(2.24%±0.16%)顯著降低(P<0.05);與Model組相比,BA-H組細胞凋亡率(10.86%±0.89%)顯著增加(P<0.05),BA-L組(2.36%±0.20%)差異無統計學意義(P>0.05);與BA-L組相比,BA-H組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與BA-H組相比,BA-H+CC組細胞凋亡率(2.87%±0.33%)顯著降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 流式術檢測血管平滑肌細胞凋亡

2.4 白樺脂酸對各組血管平滑肌細胞自噬的影響 使用雙熒光體系觀察血管平滑肌細胞中綠色和紅色LC-3Ⅱ顆粒(自噬體),結果顯示,Control組、Model組血管平滑肌細胞中無明顯的自噬小體出現。BA-H組血管平滑肌細胞中出現了明顯的自噬小體。BA-L組血管平滑肌細胞中的自噬小體較少。與BA-H組相比,BA-H+CC組血管平滑肌細胞中的自噬小體減少(圖5)。

圖5 雙熒光體系觀察血管平滑肌細胞中的自噬小體

2.5 白樺脂酸對血管平滑肌細胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA表達的影響 與Control組相比,Model組細胞中AMPK、ULK1 mRNA表達顯著降低(P<0.05),mTOR mRNA表達顯著升高(P<0.05);與Model組相比,BA-H組細胞中AMPK、ULK1 mRNA表達顯著升高(P<0.05),mTOR mRNA表達顯著降低(P<0.05),BA-L組差異無統計學意義(P>0.05);與BA-L組相比,BA-H組細胞中AMPK、ULK1 mRNA表達顯著升高(P<0.05),mTOR mRNA表達顯著降低(P<0.05);與BA-H組相比,BA-H+CC組細胞中AMPK、ULK1 mRNA表達顯著降低(P<0.05),mTOR mRNA表達顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組血管平滑肌細胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA表達比較(n=6)

2.6 白樺脂酸對血管平滑肌細胞中AMPK/mTOR/ULK1信號通路和自噬相關蛋白表達的影響 與Control組相比,Model組血管平滑肌細胞中AMPK、ULK1、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著降低(P<0.05),mTOR、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05);與Model組相比,BA-H組血管平滑肌細胞中AMPK、ULK1、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著升高(P<0.05),mTOR、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05),BA-L組差異無統計學意義(P>0.05);與BA-L組相比,BA-H組血管平滑肌細胞中AMPK、ULK1、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著升高(P<0.05),mTOR、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05);與BA-H組相比,BA-H+CC組血管平滑肌細胞中AMPK、ULK1、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著降低(P<0.05),mTOR、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05),見表3及圖6。

圖6 Western blot檢測血管平滑肌細胞中AMPK/mTOR/ULK1信號通路和自噬相關蛋白表達

表3 各組血管平滑肌細胞中AMPK/mTOR/ULK1信號通路和自噬相關蛋白表達的比較(n=6)

3 討論

冠心病多發病于40歲以上的人群,是臨床常見的心血管疾病之一,且致死率在心血管疾病中最高,嚴重威脅著人類的生命健康[13]。目前,臨床治療冠心病主要依靠腔內介入和旁路血管移植術,這兩種治療手段在提高患者近期療效中效果較好,但長期預后較差,容易受到冠脈再狹窄的制約[14]。因此,尋找治療冠心病安全有效的藥物,在提高療效的同時提高患者預后是亟待解決的重要課題之一。研究顯示,血管平滑肌細胞是構成冠狀動脈血管壁的肌層部分,在冠心病的病理狀態下,平滑肌細胞異常增殖,合成并分泌膠原纖維蛋白,進一步促進管腔狹窄和管壁硬化[15]。血管平滑肌細胞主要有2種表型：收縮型和分泌型。正常生理狀態下,血管平滑肌細胞為收縮型,能夠維持血管的張力;在病理狀態下血管平滑肌細胞轉化為分泌型,具有強大的增殖能力和遷移活性[16]。因此,深入研究血管平滑肌細胞的生物學功能對治療冠心病具有重要作用。細胞自噬是一種溶酶體的降解途徑,對細胞生存、分化和機體發育、穩態具有重要作用[17]。研究發現,自噬在感染、神經退行性疾病、心血管疾病、癌癥等疾病中起到保護作用,當自噬水平減弱,可能會導致阿爾茨海默病、心血管疾病的發生[18]。Beclin1、LC3是自噬發生過程中的重要蛋白,其蛋白表達量可以作為自噬發生的標志。本研究采用高脂飲食構建冠心病大鼠模型,從冠心病大鼠的胸主動脈血管平滑肌中分離培養原代血管平滑肌細胞,經鑒定所培養的細胞為血管平滑肌細胞。結果顯示,與Control組相比,Model組血管平滑肌細胞的細胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表達顯著上升,細胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著下降,表明模型建立成功。

白樺脂酸是一種天然的五環羽扇烷結構的三萜化合物,主要從樺木科的樹皮中提取而來[19]。相關研究表明,白樺脂酸能夠增強細胞自噬而發揮治療相關疾病的作用,如白樺脂酸能通過AMPK-mTOR-TFEB信號通路增強自噬,抑制脊髓細胞焦亡,促進脊髓損傷的恢復[20]。Zhang等[21]研究表明,白樺脂酸通過Bmi-1/ROS/AMPK-mTOR-ULK1信號通路誘導人膀胱癌細胞自噬依賴性凋亡。本研究結果顯示,與Model組相比,BA-H組血管平滑肌細胞的細胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表達顯著下降,細胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達顯著上升,表明白樺脂酸能促進冠心病大鼠血管平滑肌細胞的自噬和凋亡。

AMPK/mTOR/ULK1信號通路是調控細胞自噬的重要信號通路[22]。當細胞受到饑餓、缺氧、氧化應激等刺激后,AMPK通過磷酸化被激活,并降低mTOR的磷酸化水平,增加Ser317位點磷酸化ULK1的表達,最終激活自噬[23-24]。Lin等[25]研究發現,雙酚A通過誘導AMPK/mTOR/ULK1信號通路,促進卵巢顆粒細胞的自噬,導致卵巢功能異常。Gui等[26]研究發現,紅景天苷通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路上調細胞自噬,減輕缺氧誘導的肺動脈平滑肌細胞的異常增殖。本研究結果顯示,與Control組相比,Model組細胞AMPK、ULK1 mRNA和蛋白表達顯著降低,mTOR mRNA和蛋白表達顯著升高。與Model組相比,BA-H組細胞AMPK、ULK1 mRNA和蛋白表達顯著升高,mTOR mRNA和蛋白表達顯著降低。結果表明,白樺脂酸可能通過激活AMPK/mTOR/ULK1信號通路,促進冠心病大鼠血管平滑肌細胞的自噬和凋亡。為了驗證此猜想,我們用AMPK抑制劑Compound C來干預高濃度的白樺脂酸組,結果表明,Compound C減弱了白樺脂酸對血管平滑肌細胞自噬和凋亡的促進作用。

綜上所述,白樺脂酸可能通過激活AMPK/mTOR/ULK1信號通路,促進冠心病大鼠血管平滑肌細胞的自噬和凋亡。本研究的不足之處是僅在細胞水平進行了初步探究,后續還需深入到體內實驗中進行驗證。