基于網絡藥理學探討小承氣湯治療術后腸梗阻作用機制

戚 運,陳蘇寧

0 引言

術后腸梗阻(Postoperative ileus,POI)是腹部手術后的常見并發癥[1]。常以腹脹、進食后嘔吐、無排氣排便為主要臨床表現,約占腹部手術患者的10%～30%[2]。其發生與術中麻醉用藥、神經反射抑制、炎癥反應、應激等多種因素有關[3]。術后腸梗阻不僅會延長患者的住院時間,增加圍手術期費用,而且影響患者手術后恢復,增加再次手術和術后感染的風險[3]。小承氣湯(Xiaochengqi Decoction)源自《傷寒論》,由大黃、枳實、厚樸三味藥組成,具有輕下熱結、除滿消痞之功效[4]。小承氣湯作為一種常用的中藥方劑,在國內各醫療機構得到廣泛應用,既有成方或顆粒劑可供選擇,也可根據患者具體情況調配。小承氣湯對術后腸梗阻有顯著的治療效果,但其作用機制尚不明確。網絡藥理學是一種新興的藥物分析方法,其基于系統生物學、多向藥理學和網絡分析,能夠構建“有效成分-靶點-基因-疾病”網絡,從整體角度揭示藥物與疾病的相互作用[5],這種方法對于復雜成分藥物,特別是中藥復方的作用機制分析具有明顯優勢。本文運用網絡藥理學方法,從有效成分、靶點、信號通路等方面,分析了小承氣湯治療術后腸梗阻的可能機制,并為后續的實驗和臨床研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 小承氣湯有效成分及靶點的篩選 從中藥系統藥理學數據庫(TCMSP,https：//tcmsp-e.com/)中檢索小承氣湯中大黃、枳實、厚樸三味中藥的全部化學成分,并根據藥物在體內的吸收、分布、代謝和排泄性質(Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion,ADME),篩選出口服生物利用度(Oral bioavailability,OB) ≥30%和類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18 的化學成分及其相應靶點[6]。

1.2 術后腸梗阻相關靶點的篩選 以“Postoperative ileus”為關鍵詞,分別在Genecards(https：//www.genecards.org/)、Disgent(https：//www.disgenet.org/)、OMMI(https：//www.omim.org/)和TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)[7]4個數據庫中檢索術后腸梗阻的相關靶點,并綜合各個數據庫的結果,得出術后腸梗阻的可能作用靶點。

1.3 小承氣湯與術后腸梗阻靶點的標準化及映射 將篩選出的小承氣湯和術后腸梗阻相關靶點,分別在Unipro(https：//www.uniprot.org/)中進行標準化,選擇“Human”作為種屬條件,得到統一的基因名稱。然后將這些基因名稱在Venny2.1平臺(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中進行映射,找出小承氣湯和術后腸梗阻共有的靶點,并用韋恩圖表示。

1.4 蛋白質相互作用(Protein-protein interactions,PPI)網絡的構建 將小承氣湯和術后腸梗阻的共有靶點基因輸入String數據庫(https：//cn.string-db.org/),應用多重蛋白分析功能,選擇“Homo sapiens”作為物種,設定相互作用閾值為“medium confidence(0.400)”,構建了蛋白質相互作用網絡圖。在該圖中,節點表示由單個蛋白編碼基因產生的所有蛋白質,邊表示蛋白質之間的相互作用證據。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將小承氣湯和術后腸梗阻的共有靶點基因輸入David數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/),并設置Identifier為“OFFICE_GENE_SYMBOL”,species為“Homo sapiens”,List Type為“Gene List”。然后,選擇Gene_Ontology中的“GOTERM_BP_DIRECT”“GOTERM_CC_DIRECT”“GOTERM_MF_DIRECT ”和Pathways中的“KEGG_PATHWAY”,進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并對結果進行數據可視化。

1.6 有效成分-靶點-通路網絡圖 將小承氣湯的有效成分、靶點和通路的預測結果進行整合,并用Cytoscape 3.9.0 軟件繪制了“有效成分-靶點-信號通路”的網絡圖。

2 結果

2.1 小承氣湯有效成分及靶點的篩選 本文從 TCMSP 數據庫中檢索了小承氣湯的全部化學成分,共計269種,其中大黃92種,枳實65種,厚樸139種。然后根據 ADME標準,以 OB≥30% 和 DL≥0.18 為篩選條件,剔除了沒有靶點的化學成分,最終得到了31種有效化合物和147個相關靶點。這些化合物包括大黃10種,枳實19種,厚樸2種。按照 OB 值的大小排序,31種化合物的來源、OB 值和 DL 值如表1所示。

表1 小承氣湯部分有效成分基本信息

2.2 術后腸梗阻相關靶點的篩選及藥物與疾病靶點的映射 在Genecards、Disgent、OMMI和TTD 4個數據庫中,以“postoperative ileus”為關鍵詞,檢索術后腸梗阻的相關靶點,并去除重復項,共得到286個靶點。然后,將這些靶點在Uniprot數據庫中進行標準化,得到統一的基因名稱。將這些基因名稱在Venny2.1平臺中進行映射,找出小承氣湯和術后腸梗阻共有的靶點,共計36個,并用韋恩圖表示,如圖1所示。

圖1 小承氣湯治療術后腸梗阻靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡的構建 將小承氣湯和術后腸梗阻的36個共有靶點輸入String數據庫,構建了蛋白質相互作用網絡圖,并在圖2中展示。在該圖中,節點表示蛋白質,邊表示蛋白質之間的相互作用關系。該網絡包含36個節點和306個邊,平均節點度為17。

圖2 小承氣湯治療術后腸梗阻靶點PPI網絡圖

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將小承氣湯和術后腸梗阻的共有靶點基因輸入David數據庫,進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。結果顯示,共有282個生物學過程被富集,主要包括對藥物的反應、一氧化氮生物合成過程的正向調節、平滑肌細胞增殖的正向調節、趨化因子生物合成過程的正向調節等;34個分子生物學功能被富集,主要包括細胞因子活性、酶結合、生長因子活性、蛋白質同二聚活性等;28個細胞學組分被富集,主要包括細胞外空間、細胞外區域、質膜外側等(見圖3)。此外,共有10條 KEGG 信號通路被富集,按照P值從小到大排序,主要包括腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路等(見圖4)。這些結果在圖4中用氣泡圖表示,其中氣泡的大小反映了該通路涉及的基因數量,顏色反映了富集顯著性。

圖3 小承氣湯治療術后腸梗阻靶點GO基因注釋分析圖

圖4 小承氣湯治療術后腸梗阻靶點KEGG富集分析圖

2.5 有效成分-靶點-信號通路網絡圖構建 采用Cytoscape 3.9.0 軟件繪制小承氣湯和術后腸梗阻的“有效成分-核心靶點-信號通路”網絡圖(見圖5)。圖5清晰地顯示了小承氣湯的31種有效成分、36個靶點蛋白和10條作用通路與術后腸梗阻的關聯。

圖5 小承氣湯治療術后腸梗阻“有效成分-靶點-信號通路”網絡

3 討論

術后腸梗阻是指腹部手術后腸道運動功能障礙或機械性阻塞,導致腸內容物不能正常通過的一種常見并發癥。術后腸梗阻的治療原則是及時診斷、糾正水電解質和酸堿平衡紊亂、消除感染和炎癥、解除梗阻和恢復腸道功能[8]。治療方法主要分為保守治療和手術治療。保守治療適用于部分或不完全性梗阻,無絞窄或壞死的腸段,無明顯腹膜炎體征或全身中毒癥狀的患者。保守治療包括禁食水、胃腸減壓、營養支持、維持水電解質、酸堿平衡、促進腸道蠕動、生長抑素、糖皮質激素、抗菌藥物等西醫措施,以及行氣通腑、消積化滯等中藥措施[9]。西醫保守治療可以為患者提供生命支持,糾正水電解質和酸堿平衡紊亂,消除感染和炎癥,減少并發癥。然而,其不能直接解除梗阻原因,可能延長腸道功能恢復時間,增加住院費用,部分患者可能需要再次手術。中藥保守治療可以根據患者的體質和證型進行個體化治療,通過多途徑給藥,能夠促進腸道功能恢復。然而,中藥研究顯示,小承氣湯能夠抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、降低血管通透性、保護胃腸功能等[10]。本文運用網絡藥理學方法,從有效成分、靶點、信號通路等方面分析了小承氣湯治療POI的可能機制。

從TCMSP數據庫得到的小承氣湯治療術后腸梗阻的核心化合物有大黃酸(Rhein)、大黃素(Emodin)、蘆薈大黃素(Aloe-emodin)、枸櫞苦素(Poncimarin)、異枸櫞苦素(Isoponcimarin)、新橙皮苷(Neohesperidin)等。現代藥理學研究表明,大黃中富含大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素等蒽醌類成分[11]。大黃素具有膽堿樣作用,可興奮平滑肌M膽堿受體,加快腸蠕動,同時可通過抑制巨噬細胞分泌的TNF2A,抑制過度的炎癥反應[12]。大黃酸可顯著抑制巨噬細胞內LTB4和LTC4的生物合成,同時抑制內毒素激發的巨噬細胞內鈣離子升高,并提高細胞內 cAMP 水平,從而達到減輕或阻斷炎癥介質所導致的瀑布樣效應[13]。此外,大黃酸、大黃素和蘆薈大黃素均可通過抑制細菌的核酸和蛋白質的合成達到抗菌目的[14]。厚樸的主要成分為酚類物質,酚類含量最高、起主要藥效的為厚樸酚與和厚樸酚[15]。厚樸酚是一種具有糖皮質激素樣非選擇性抗炎活性的化合物。藥理研究發現,厚樸酚能夠直接抑制iNOS、COX-2和5-LO的活性,從而阻斷NO、PGs和LTs的合成和釋放,厚樸酚還能夠抑制組胺釋放,進而發揮廣譜的抗炎效果[16]。枳實中含有新橙皮苷等黃酮類成分[17],可改善FD大鼠的胃排空和腸蠕動[18],同時顯著抑制COX-2、IL-6、TNF-α的表達,從而發揮抗炎作用[19]。

從PPI網絡分析結果發現,小承氣湯通過PPARG、IL-10、IL1B、NOS2、PTGS2、TNF等靶點共同發揮治療作用。白介素10(Interleukin-10,IL-10) 是一種重要的抗炎細胞因子,可抑制過度的免疫反應以及炎癥細胞因子的釋放[20]。研究表明[21],IL-10在術后腸功能恢復中起著不可替代的作用,外源性IL-10可阻止其發生。預防性應用外源性重組人白細胞介素10可作為預防臨床術后腸梗阻的一種治療方法。腫瘤壞死因子(Tumour Necrosis Factor,TNF)是炎癥反應的關鍵調節因子,可通過NF-κB和AP-1等通路,促進IL-1、IL-2、IL-6等炎性因子的激活[22]。研究表明,電針足三里(ST36)或足三里(ST36)聯合天舒(ST25)可改善POI小鼠腸道運動,其機制可能與抑制TNF表達有關[23]。基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloprotein,MMP9)是一類蛋白酶,負責調控細胞外基質蛋白(ECMs)的降解和重構。在炎癥過程中介導白細胞的遷移[24]。研究發現,MMP-9介導POI小鼠和大鼠腸肌內細胞炎癥反應[25]。抑制MMP-9活性,可減少免疫細胞向腸肌的聚集,防止平滑肌收縮功能的喪失。

GO功能富集分析結果顯示,小承氣湯對術后腸梗阻的作用主要體現在以下方面：①生物學過程,包括趨化因子生物合成過程的正向調節、一氧化氮生物合成過程的正向調節、缺乏配體時的外源性凋亡信號通路、平滑肌細胞增殖的正向調節等;②分子功能,包括細胞因子活性、酶結合、生長因子活性等;③細胞組分,包括細胞外空間、細胞外區域、質膜外側等。

KEGG通路富集分析結果顯示,小承氣湯對術后腸梗阻的作用主要涉及以下信號通路：①腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)是急性和慢性系統炎癥反應的關鍵環節,能夠通過激活下游的IKK/NF-κB和MAPK,誘導免疫和炎癥反應[26]。研究表明,加味小承氣湯能夠顯著降低硫代乙酰胺(TAA)所致肝損傷小鼠TNF-α水平,發揮細胞保護作用[27]。②T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)是免疫系統有效應答的關鍵事件,能夠在T細胞受體特異性識別抗原提呈細胞表面MHC提呈的抗原肽后,通過蛋白激酶、銜接蛋白等多種分子相互作用,形成一系列級聯反應,激活并誘導T細胞增殖和分化,參與免疫反應[28]。③HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)由缺氧誘導因子HIF-1調節。HIF-1是細胞代謝和缺氧所致細胞應激反應的重要轉錄調節因子,在炎癥反應、生理應激等過程中發揮重要作用[29]。HIF與天然免疫的中樞調節因子NF-κB之間具有密切協同關系,HIF能夠介導缺氧中性粒細胞NF-κB的活化,并以TLR-4依賴的方式促進LPS刺激巨噬細胞中NF-κB調節細胞因子的表達[30]。

本研究采用網絡藥理學方法,初步探討了小承氣湯治療術后腸梗阻的可能機制。通過數據整合分析,發現小承氣湯的多個成分作用于PPARG、IL-10、IL1B、NOS2、PTGS2、TNF等靶點,從而調節腫瘤壞死因子信號通路、T細胞受體信號通路等與免疫和炎癥相關的信號通路。這一結果與以往的臨床觀察相符,支持了小承氣湯治療術后腸梗阻的有效性。此外,本研究還發現,小承氣湯的部分靶點涉及細胞氧化應激和凋亡等過程,這為進一步揭示小承氣湯的作用機制提供了新的線索。然而,網絡藥理學方法也存在一些不足。首先,該方法依賴于數據庫和算法的質量,可能存在數據缺失、錯誤或過時的問題;其次,該方法只能進行定性分析,無法反映成分和靶點之間的定量關系;最后,該方法只能進行預測和推斷,并不能取代實驗驗證和臨床試驗。因此,在后續的工作中,我們將對篩選出的關鍵靶點和通路進行實驗驗證,并進行更大規模和更長期的臨床試驗,以提高預測的精確度和可信度。