膿毒癥中微小RNA的功能及臨床價值研究進展

彭旸 朱鵬 覃剛

膿毒癥在臨床上十分常見,部分膿毒癥患者可并發膿毒癥休克、急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)、急性肺損傷(acute lung injury,ALI)及多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等嚴重并發癥,甚至在短時間導致患者病死[1,2]。全世界范圍內每年有超過4百萬患者因膿毒癥病死,其臨床發病率也呈升高趨勢,同時膿毒癥本身也是導致入住重癥監護室(intensive care unit,ICU)患者最常見的病死原因,導致了十分嚴重的衛生及社會負擔[3,4]。細菌、病毒等病原體感染均可導致膿毒癥發生,其具體致病機制十分復雜,目前認為,過度的免疫炎癥應答及炎癥風暴在其中處于核心地位[5,6]。微小RNA(microRNA,miRNA)是在人體內廣泛分布的不具有編碼功能的RNA,miRNA通常由19～24個核苷酸組成,其功能主要依靠直接結合到特定靶基因的3’-非編碼區(untranslated region,UTR)來抑制該基因翻譯相應的功能蛋白,從而對機體各類病理及生理過程發揮調控作用[7,8]。大量研究數據顯示,miRNA在膿毒癥致病及進展中發揮著重要的調控功能,同時特異miRNA作為膿毒癥的臨床診斷及預后的無創生物學指標也具有一定應用價值[9]。此外,由于miRNA在膿毒癥致病中的重要調控功能,也有學者嘗試使用靶向miRNA的方法來治療膿毒癥,雖然研究僅停留在基礎階段,但也顯示出了潛在的臨床價值[10]。因此,本文對膿毒癥中miRNA的調控功能及臨床應用方面的研究進展進行了簡要綜述,以求為臨床診療提供參考。

1 miRNA參與調節膿毒癥及其并發癥的致病過程

目前認為,膿毒癥致病的核心機制仍是機體過度的免疫炎癥應答及損害所致。作為具有廣泛生物學效應的調控分子,miRNA通過特定的信號通路參與了對膿毒癥及相關嚴重并發癥致病過程的調控,在這方面也積累了大量的研究數據[11]。相關的研究方面,如Wang等[12]發現,膿毒癥患者及模型小鼠的外周血漿中存在miRNA-146a-5p表達水平的顯著升高,機制分析也顯示,IRAK-1基因是miRNA-146a-5p的靶向調控基因,升高的miRNA-146-5p可以直接結合到IRAK-1基因的3’-UTR,從而抑制功能蛋白IRAK-1表達,并激活下游信號通路,增強IL-6等炎性因子表達并加重炎癥風暴及器官損傷,同時研究還發現,膿毒癥患者的血漿miRNA-146-5p水平還與乳酸及凝血功能障礙存在密切相關性,提示miRNA-146a-5p參與膿毒癥相關炎性損害的重要調控功能。Chen等[13]基于磷酸酯多糖(lipopolysaccharide phosphate,LPS)(細菌細胞壁的主要成分)誘導的膿毒癥模型細胞(THP-1細胞系)研究顯示,THP-1細胞中存在miRNA-135a表達水平顯著升高,使用生物信息學技術分析顯示,MTOM1基因是miRNA-135a的靶向調控基因。在培養細胞系中加入miRNA-135a抑制劑可以顯著降低miRNA-135a的表達并增強MTOM1表達,從而減弱細胞相關炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8的生成并緩解細胞凋亡作用。提示miRNA-135a在促進膿毒癥相關炎癥損害及細胞凋亡中具有重要的促進作用。Fitzpatrick等[14]的研究發現,在金黃色葡萄球菌感染的血管內皮細胞中miRNA-99表達存在顯著升高,機制分析顯示mTOR是miRNA-99的靶向調控基因,升高miRNA-99的表達可以顯著抑制mTOR的表達,并升高IL-6水平,減少IL-10的產生,促進炎性損害。相反的通過抑制miRNA-99的表達則可以發揮相反的作用。研究結果也提示了miRNA-99/mTOR信號通路在膿毒癥致病中的重要調控作用。He等[15]基于細胞模型的研究顯示,在膿毒癥患者或LPS處理的外周單個核細胞中存在miRNA-16-5p表達顯著升高,而去乙酰化酶3(SIRT3)表達則顯著降低,且病情更嚴重的膿毒癥患者miRNA-16-5p表達升高更明顯。機制分析顯示SIRT3是miRNA-16-5p的靶向調控基因,SIRT3本身也是控制細胞代謝及穩定線粒體的重要調控酶,大量的研究也顯示其在炎性損害時的糖酵解調控中發揮重要作用,這也提示miRNA-16-5p可通過上述途徑參與促進膿毒癥的發生及機體損害[16]。上述研究結果均提示了特異性miRNA及其調控的信號轉導通路在參與膿毒癥相關炎癥損害中的重要調控作用。

膿毒癥通常表現為全身炎性反應,嚴重患者常合并重要臟器及系統的損害,最常見的損害臟器包括腎臟、肺、心臟等,常表現為AKI、ALI及急性心肌損傷等[17]。膿毒癥患者一旦合并上述重要臟器及系統的損害,可能在短時間內進展為多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),患者短期內病死率通常會顯著升高[3,18]。在miRNA調控ALI相關的研究方面,如Liu等[19]基于動物模型的研究顯示,注射LPS誘導的膿毒癥相關ALI小鼠存在肺黏膜細胞中miRNA-1224-5p表達的顯著升高,通過升高miRNA-1224-5p的表達能夠顯著增強模型動物的炎性反應、ROS生成及肺功能損耗。熒光素酶分析顯示,miRNA-1224-5p能夠直接結合到PPAR-γ的3-UTR,從而抑制PPAR-γ/AMPLα信號通路的激活,并在體內外實驗中加重LPS誘導的ALI。研究結果也提示了內源性miRNA-1224-5p是調控膿毒癥所致ALI的重要分子。Li等[20]基于動物模型(LPS誘導的膿毒癥相關心肌損傷小鼠)也發現,模型動物的心肌細胞中miRNA-361-5p表達存在顯著的升高,同時G蛋白耦聯受體4(Lgr4)的表達則顯著降低,使用熒光素酶實驗分析顯示,LGR4基因是miRNA-361-5p的靶向調控基因。LGR4翻譯的Lgr4蛋白本身Wnt信號通路的上游抑制蛋白,miRNA-361-5p主要是通過調控Lgr4的表達來影響Wnt信號通路激活,從而調控膿毒癥時心肌細胞的壞死和凋亡,從而參與疾病的致病。Ding等[21]的也發現,在LPS誘導的膿毒癥相關AKI動物及細胞模型(HK2細胞)中均觀察在miRNA-103a-3p表達的顯著降低,且miRNA-103a-3p能夠靶向抑制CXCL12基因的轉錄,從而降低CXCL12蛋白的表達。CXCL12本身屬于促炎癥趨化因子,是膿毒癥相關腎小球及腎小管炎癥損害的重要調控因子,miRNA-103a-3p則通過對CXCL12表達的影響來發揮對膿毒癥相關AKI的調控。與上述研究相似的結果還有許多,均顯示了特異性miRNA在膿毒癥相關嚴重并發癥中的表達異常及發揮著重要的調控機制,這也為闡述膿毒癥所致多器官損害提供了重要參考[22,23]。

2 miRNA用于膿毒癥診斷及預后的臨床價值

目前針對膿毒癥的診斷方法主要是基于患者的臨床表現,并使用如序貫性器官衰竭評分(sequential organ failure assessment,SOFA)等模型工具來確定,臨床上并無十分準確的特異性生物指標來實現早期快速對膿毒癥進行識別及評估[24]。作為無創性生物學指標,miRNA的檢測較為簡便快捷,尤其是可以在病情演變過程中進行動態重復檢測,其用于膿毒癥及其相關并發癥的臨床診斷及預后價值也逐漸得到學者的重視,相關的研究也積累了大量證據[25,26]。相關的研究方面,如Xu等[27]的研究納入了40名膿毒癥患者,檢測了患者外周循環中的miRNA及炎性因子表達情況。研究結果顯示,膿毒癥患者外周循環中的miRNA-3663-3p表達呈存在顯著升高,且miRNA-3663-3p與IL-6、IL-21、CXCL8及MCP-1的水平存在顯著正相關。機制分析提示miRNA-3663-3p主要是通過靶向調節TDAG8基因的表達來參與對膿毒癥時炎性因子的調控,從而參與膿毒癥相關炎性因子風暴。同時研究還發現,miRNA-3663-3p單獨用于診斷膿毒癥的曲線下面積(area under curve,AUC)可達0.908,將miRNA-3663-3p的Cut-off值設定為0.02時,其診斷膿毒癥的靈敏度及特異度均可達到100%。Zhang等[28]基于微陣列芯片篩選出膿毒癥患者存在miRNA-7d-3p表達的顯著升高,基于多元logistic回歸分析顯著miRNA-7d-3p是住院患者發生膿毒癥的獨立預測因子,單獨使用miRNA-7d-3p診斷膿毒癥的AUC可達0.696(95%CI:0.615～0.778)。同時研究者還在獨立的患者隊列中對上述結果進行了驗證,獲得了相似的臨床診斷效能。Mao等[29]開展的臨床研究顯示,與健康對照相比,新生兒膿毒癥患者血清miRNA-455-5p表達程度顯著升高,且miRNA-455-5p與WBC計數、降鈣素原(procalcitonin,PCT)及SOFA評分存在正相關。ROC分析顯示,血清miRNA-455-5p水平單獨用于診斷新生兒膿毒癥的AUC可達0.895,且高表達miRNA-455-5p的患者臨床預后更差,短期病死率更高(HR=3.454,95%CI:1.165～10.234)。Sankar等[30]開展的橫斷面研究顯示,與健康對照相比,新生兒膿毒癥患者存在外周循環中的miRNA-31、miRNA-21及miRNA-155表達程度顯著升高,而miRNA-29a及miRNA-146a的表達程度則顯著降低。其中血清miRNA-21和miRNA-29a分別單獨用于診斷新生兒膿毒癥的AUC分別為0.829和0.787,提示了上述指標用于膿毒癥診斷的優良臨床價值。此外,對膿毒癥相關嚴重并發癥的早期診斷也有助于臨床開展針對性治療,從而降低患者總體病死率。特異性miRNA在上述方面也體現了較好的臨床價值,相關的研究如Ma等[31]納入了184名膿毒癥患者,結果顯示,并發AKI的膿毒癥患者尿液中miRNA-370-3p及miRNA-495-3p的表達顯著降低,miRNA-370-3p及miRNA-495-3p分別單獨診斷膿毒癥相關AKI的AUC可達0.896及0.814,同時研究還發現,尿液中高表達miRNA-370-3p和miRNA-495-3p的患者住院28 d的生存率更高,提示了這兩項miRNA也是膿毒癥患者短期預后的獨立影響因素。上述研究結果均提示了特異性miRNA用于膿毒癥及其相關并發癥的診斷具有較高的價值。

膿毒癥具有較高的臨床病死率,而miRNA作為評估膿毒癥預后的無創指標,也具有較為優良的應用價值,得到了大量的研究數據支持。Geng等[32]的研究發現,與健康對照相比,膿毒癥患者外周單個核細胞中miRNA-451a的表達存在顯著升高,同時Th1細胞計數、Th1/Th2比值顯著升高,而Th2細胞計數則顯著降低。同時膿毒癥患者的miRNA-451a與Th1細胞計數(P=0.002)、Th1/Th2比值(P=0.001)存在正相關,與Th2細胞計數呈負相關(P=0.005),而且miRNA-451a還與反映炎性水平的TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP等具有相關性,與SOFA及APACHE Ⅱ評分也存在相關性。多元Logistic回歸分析顯著,miRNA-451a(OR=1.86,95%CI:1.59～2.23)、Th1/Th2比值(OR=2.05,95%CI:1.72～2.45)是影響膿毒癥患者28 d病死率的獨立風險因素。Yang等[33]基于大樣本膿毒癥患者的臨床研究顯示,膿毒癥患者外周循環中的miRNA-150表達存在顯著升高,且住院28 d內發生病死的膿毒癥患者miRNA-150升高更為顯著。校正多個臨床因素(年齡、PCT、血肌酐、尿素氮、糖尿病、總膽紅素等)后的多因素回歸分析顯示,miRNA-150、SOFA評分是影響膿毒癥患者28 d病死率的獨立危險因素,miRNA-150及SOFA評分單獨預測病死的AUC分別為0.762(95%CI:0.717～0.808)及0.735(95%CI:0.687～0.784),miRNA-150聯合SOFA評分的模型預測病死的AUC為0.886(95%CI:0.857～0.916),靈敏度為86.2%,特異度為80.6%。Trung等[34]針對細菌感染所致膿毒癥患者外周循環中的miRNA表達情況進行了篩查,發現了4種miRNA(miRNA-146-3p、miRNA-147b、miRNA-155及miRNA-223)在膿毒癥休克及膿毒癥患者之間存在差異。其中血漿miRNA-147b水平單獨用于預測膿毒癥休克的AUC為0.85(P<0.05),miRNA-147b聯合PCT預測膿毒癥休克的AUC為0.86(P<0.05)。Nour等[35]的基于兒童膿毒癥患者的研究顯示,在膿毒癥早期患者外周血中即可出現miRNA-122及miRNA-181b表達水平的升高,而miRNA-223及miRNA-146a表達則存在顯著下降。此外血清miRNA-223水平可用于預測膿毒癥兒童的預后,預測患者30 d病死率的靈敏度為70%,特異度為75%。上述研究結果均提示了特異性miRNA用于膿毒癥患者的預后評估具有潛在的重要價值。

3 靶向miRNA的治療膿毒癥的臨床價值

基于特異性miRNA在膿毒癥及其相關并發癥中發揮著十分重要的調控作用,臨床學者也逐漸關注基于靶向miRNA的治療方法來改進對膿毒癥的治療,從而達到改善患者臨床預后的目的。然而由于藥物設計及安全性的原因,目前并無靶向miRNA治療膿毒癥及其并發癥的藥物或方法被批準應用于臨床或進入臨床試驗,相關的研究也僅停留在細胞及動物模型層面。相關的研究方面,如Sun等[36]發現,與健康對照相比,膿毒癥患者外周循環中miRNA-23a-3p的表達存在顯著降低,同時高遷移率組盒1(HMGB1)、IL-6及TNF-α則顯著升高。研究者同時在模型細胞(LPS處理的小鼠巨噬細胞RAW264.7)也觀察到相似的結果[36]。通過增強miRNA-23a-3p(在培養細胞系中加入miRNA-23a-3p微粒)的表達可以抑制模型細胞分泌炎性細胞因子,機制分析也顯示,miRNA-23a-3p的這一調控作用主要通過直接靶向結合到HMGB1的3’-UTR來抑制HMGB1表達實現。這也提示了miRNA-23a-3p具有抑制膿毒癥相關炎性反應的潛在臨床治療價值。He等[37]的研究也發現,LPS誘導的THP-1細胞系存在miRNA-135a的表達升高,而MYOM1蛋白表達則顯著升高。通過在細胞系中加入miRNA-135a抑制劑可以降低其靶向靶標基因 MYOM1及其編碼蛋白的表達,從而有效降低IL-6、IL-8及TNF-α等炎性因子的合成,減輕細胞焦亡作用及炎癥損害。上述研究提示了通過調節特異性miRNA的表達可以達到緩解膿毒癥相關免疫炎癥反應的效果,為臨床開發治療膿毒癥的方法提供了一定參考。

隨著研究的深入,在靶向miRNA治療膿毒癥相關并發癥方面也取得了一些進展。一方面,特異性miRNA可能作為膿毒癥相關AKI的潛在治療靶點。相關的研究方面,如Zhang等[38]的研究也發現,在模型細胞(LPS誘導的HK-2細胞)及動物模型(CLS誘導的小鼠)均存在miRNA-181a-5p表達的顯著降低,而NLRP3、NEK7、ASC、caspase-1、N-GSDMD等細胞凋亡調控因子及IL-18、IL-1β、TNF-α等炎性因子均存在表達升高。通過增強miRNA-181a-5p的表達可以抑制NEK7基因轉錄,從而降低NEK7蛋白調控的細胞凋亡作用及緩解膿毒癥時的炎性損害。同時研究者在膿毒癥相關AKI的動物模型中也驗證了miRNA-181a-5p的上述作用效果,為治療膿毒癥相關AKI提供了重要參考。Zhang等[39]基于模型動物的研究發現,存在膿毒癥相關AKI的大鼠外周循環中的miRNA-122表達存在顯著降低,而HMBG1表達則顯著升高。熒光素酶實驗顯示HMBG1時miRNA-122的靶向調控基因。同時研究者還在體外模型細胞中使用miRNA-22模擬物微粒來增強miRNA-122的表達,結果顯示,HBZY-1細胞中的HMGB1/TLR4/NK-κB信號通路及相關炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表達可以得到顯著降低,提示了miRNA-122具有控制膿毒癥相關炎性風暴并減弱AKI損害的治療價值。Wang等[40]的研究也發現,存在膿毒癥相關AKI的患者miRNA-338-3p表達存在顯著降低,基于LPS誘導HK-2細胞模型的研究也發現類似情況,同時IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子則存在顯著升高。通過升高模型細胞的miRNA-338-3p表達則可以降低相應炎性因子的表達,緩解LPS誘發的膿毒癥相關AKI所致的損害。Yang等[41]開展的相似研究也顯示,在LPS誘導的模型細胞(16HBE細胞)中存在miRNA-338-3p表達的顯著降低,而OIP-AS1及ATF4蛋白則存在顯著升高。機制分析顯示,miRNA-338-3p可以直接靶向作用OIP-AS1基因,從而抑制其功能蛋白OIP-AS1的表達,并影響ATF4蛋白表達,從而增強模型細胞活性,并緩解炎性反應及細胞凋亡。

另一方面,如ALI、心肌損傷、凝血功能紊亂等均是膿毒癥相關的嚴重并發癥,而基于靶向特異性miRNA的治療方面也為探索控制膿毒癥相關嚴重并發癥的新方法提供了重要參考。如Shen等[42]的最新研究發現,在膿毒癥相關ALI及LPS誘導的人肺微血管內皮細胞(HPVECS)培養系中,miRNA-374a-5p的表達程度均存在顯著下調,通過在細胞培養系中加入miRNA-374a-5p模擬物微粒來增高其表達,可有效的恢復細胞活力,同時抑制細胞凋亡及炎性因子的產生,從而緩解膿毒癥所致的ALI。熒光素酶實驗顯示鋅指E-box結合同型盒子1 (ZEB1)是miRNA-374a-5p的靶向調控基因,增高的miRNA-374a-5p可以靶向抑制ZEB1表達,從而減弱下游p38/MAPK信號通路的激活,來實現上述作用效果。心肌損傷是敗血癥的常見并發癥。Yan等[43]基于膿毒癥相關心肌損傷細胞模型(LPS誘導AC16細胞)的研究顯示,模型細胞中miRNA-214-3p表達存在顯著下降,而caspase-3、Bax、肌球蛋白-6,、肌球蛋白-7、心房鈉肽等反應心肌細胞損害及凋亡的蛋白則存在顯著升高。通過在模型細胞中增高miRNA-214-3p的表達則可以降低上述因子的表達,從而緩解LPS處理的心肌炎性損害機制分析顯示,miRNA-214-3p主要是通過靶向抑制組織蛋白酶B(CTSB)基因的表達,從而發揮上述功能作用。這也為臨床治療膿毒癥 相關心肌損害提供了參考。相似的如Liu等[44]基于細胞模型(LPS誘導的H9C2細胞,模擬膿毒癥相關心肌細胞)的研究研究發現,H9C2細胞存在活力降低及miRNA-702-3p表達降低,通過在培養系中加入miRNA-702-3p模擬物微粒,可以顯著降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表達,從而抑制炎性反應及增強細胞活力。熒光素酶實驗分析顯示miRNA-702-3p的靶標基因為NOD1。這也為治療膿毒癥相關心肌損害提供了新的治療方法。Hu等[45]的研究發現,在LPS誘導的細胞模型中,miRNA-539-5p的表達存在顯著降低,通過增強miRNA-539-5p的表達水平可以顯著抑制細胞炎性反應及凋亡,同時增強細胞活力和增殖能力,熒光素酶實驗顯示,白介素1受體相關激酶3(IRAK3)是miRNA-539-5p的靶向調控基因,miRNA-539-5p的這種調控功能主要通過影響IRAK3的表達來實現。Shen等[46]的研究也發現,與呼吸道感染患者相關,發生膿毒癥的患者(n=34)外周循環中的miRNA-186-5p表達存在顯著降低,而煙酰胺磷酸核糖轉移酶(NAMPT)水平則顯著升高。研究者在動物模型(盲腸結扎穿刺的小鼠)中也發現了上述現象,此外通過注射miRNA-186-5p微粒的方法來增高miRNA-186-5p的表達則可以降低PT及PAI-1,同時增高PLT計數及纖維蛋白原濃度,從而達到改善膿毒癥小鼠凝血功能紊亂的效果。機制分析顯示,miRNA-186-5p的這一功能主要是通過靶向調節NAMPT的表達,從而抑制NF-κB信號通路激活來實現。這也為治療膿毒癥相關凝血功能紊亂提供了重要參考。

4 問題及展望

綜上所述,在膿毒癥及其相關嚴重并發癥中,特異性miRNA發揮著十分重要的調控功能,尤其是參與對膿毒癥時炎性應答調控。特異性miRNA作為膿毒癥診斷及預后評估等的指標具有無創、便捷的優點,相關的研究方面也積累了很多臨床證據。基于動物或細胞模型的研究顯示靶向特定miRNA的治療方法可以緩解膿毒癥時的炎性損傷,但是這種分子靶向治療方法距離臨床實際應用還有許多困難需要克服。下步的研究仍需深入探討miRNA在膿毒癥復雜致病機制中的功能作用,從而為篩選臨床診斷評估指標及探索安全有效的分子靶向治療方法提供參考。