一種酶系缺陷型醬用曲種的篩選、擴培及應用

◎ 陳 執

（廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山 528400）

黃豆醬是我國傳統的調味醬，通常是以黃豆、面粉為原料，將黃豆炒熟磨碎后經過米曲霉等微生物發酵而制成的一種更容易被人體消化吸收的半流動狀態的發酵調味食品。現有的黃豆醬在生產及貯藏過程中，經常出現形狀不規則的白色結晶，俗稱白點，并且隨著黃豆醬商品貨架期的延長，白點還會有增多的趨勢，嚴重影響黃豆醬成品的外觀。因此，黃豆醬白點問題成為行業亟待解決的難題。

黃豆醬釀造用主力菌種為米曲霉，其在制曲過程中分泌大量的蛋白質水解酶系，大豆蛋白在蛋白酶的作用下水解成小分子肽，進而分解為多種氨基酸和少量短肽，其中含有酪氨酸末端的肽鏈會在酪氨酸羧肽酶的作用下生成酪氨酸。因游離的酪氨酸難溶于水，當酪氨酸超出水的溶解度時就會先析出微小的晶核，隨著蛋白質水解酶系的催化和水解，釋放出更多的酪氨酸，使析出的晶體逐漸增大，累積形成肉眼可見的白點。本文通過篩選產游離酪氨酸肽酶的缺陷型菌株，降低黃豆醬發酵過程中游離酪氨酸含量，進而抑制白點的析出。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

釀造黃豆醬生產原料黃豆、面粉、食鹽從市場采購；米曲霉As3.951，由廣東美味鮮調味食品有限公司提供。

超凈工作臺、培養箱、種曲機、NK 式旋轉蒸煮鍋、發酵池和60 m3發酵罐等。

1.2 方法

1.2.1 酶系缺陷型醬用菌株的篩選

從菌種庫中選取20 株不同的米曲霉菌株，以黃豆醬常用曲精為對照組，將20 株米曲霉試管菌種轉接三角瓶中，35 ℃培養72 h。取1 g 三角瓶菌種，加99 g面粉，混合均勻，制作成菌種粉，再將100 g 熟豆、10 g 面粉和8 g 菌種粉置于1 L 三角瓶中，混合均勻，放置在濕度為100%、溫度為35 ℃培養箱中，充分吸附面粉，最后將充分吸附面粉的黃豆，放在濕度為100%、溫度為30 ℃培養箱培養44 h[1]。大曲成熟后，送檢大曲的中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力[2-3]，選取其中中性蛋白酶活力明顯低于酸性蛋白酶活力的大曲作為目標菌種，跟進游離酪氨酸指標。

1.2.2 酶系缺陷型醬用菌株發酵關鍵參數的驗證

將上述20 株成熟大曲充分搖散，稱重。與306 g濃度為25%的鹽水混合，補水至600 g，制成醬醪，在培養箱中30 ℃發酵10 d，每天攪拌，發酵完成后，送檢醬豆的游離酪氨酸、生醬油理化指標，確認上述目標菌種的游離酪氨酸指標是否明顯低于其他菌株[4]。其中，篩選出中性蛋白酶活力明顯低于酸性蛋白酶活力，且游離酪氨酸指標較低的菌種作為酶系缺陷型醬用菌種，進入中、大試驗證。

1.2.3 米曲霉中、大試降酪氨酸效果驗證試驗

（1）種曲培養基制作。選用干凈無雜質的麩皮，按麩皮∶水∶面粉=1 ∶1 ∶0.2 的配方，將麩皮加至拌料機內，加入對應比例的自來水，攪拌1 min，停機。潤水5 min 后，均勻撒入相應比例的面粉，攪拌2 min，倒出，均勻鋪于曲盤中，送入種曲機內，121 ℃滅菌30 min。

（2）種曲培養。滅菌好的培養基，接種篩選出的酶系缺陷型醬用菌種，接種量5‰。接種后，按以下工藝進行種曲擴大培養。①0 ～30 min 只開風機，風機頻率30 Hz，30 min 后關閉風機。②0.5 ～6.0 h 打開罐體排污閥，一直通氣，通氣量為6 m3·h-1，控制料溫為30 ～34 ℃。③6 ～14 h 加濕10 min·h-1（隔一小時加濕10 min，下同），一直通氣，通氣量為6 m3·h-1，料溫為30 ～34 ℃。④14 ～18 h 加濕10 min·h-1，一直通氣，通氣量為10 m3·h-1，料溫為30 ～34 ℃。⑤18 ～46 h，連續通氣、加濕，通氣量為10 m3·h-1，控制料溫為30 ～34 ℃。⑥46 ～54 h 加濕30 min·h-1，連續通氣，通氣量8 m3·h-1，料溫為30 ～34 ℃。⑦60 ～72 h，連續通氣，通氣量6 m3·h-1，料溫28 ～30 ℃，培養種曲72 h 得到成熟的種曲。送檢培養成熟的種曲，測定其中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力。

1.2.4 酶系缺陷型醬用菌株降酪氨酸效果驗證

篩選出低產酪氨酸的米曲霉，與黃豆、面粉進行混合制曲，接種量為5‰，制曲時間為42 ～44 h；送檢成熟大曲的中性和酸性蛋白酶活力；成熟大曲與17 Bé 的鹽水按照1 ∶2.5 的比例制醪，發酵罐進行曬露發酵[5-6]，以黃豆醬常用大曲S1 為對照，按生產規模驗證菌株降酪氨酸的效果。

1.2.5 指標測定方法

醬豆中的中、酸性蛋白酶的活力按《蛋白酶活力測定法》（SB/T 10317 1999）測定；總酸按《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》（GB 12456 2021）測定；氨基酸態氮按《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》（GB 5009.235 2016）測定；酪氨酸按《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》（GB 5009.124 2016）測定；鹽分按《醬油衛生標準的分析方法》（GB 5009.39 2003）測定。

2 結果與分析

2.1 酶系缺陷型醬用菌株的篩選

由表1 可知，本輪共篩選了菌種庫中的20 株米曲霉菌株，與對照菌種（曲精）相比，米曲霉菌株M13的中性蛋白酶活低于對照菌株，酸性蛋白酶活略高于對照菌株，且酸性蛋白酶活力遠遠高于中性蛋白酶活[7-8]。由表2 可知，M13 菌株釀造醬胚的游離酪氨酸生成率遠低于對照菌種，且氨基酸態氮亦可滿足黃豆醬的需求，將該菌株進行大試效果驗證。

表1 大曲中性和酸性蛋白酶活力表 單位：U·g-1

表2 生醬油理化及醬豆游離酪氨酸表

2.2 酶系缺陷型醬用菌株大試規模性能驗證結果

由表3 和表4 可知，篩選出的米曲霉M13 菌株制得大曲的中性蛋白酶活力遠低于對照組。將其成熟大曲按照黃豆醬發酵工藝進行發酵，檢測不同發酵時間醬胚的理化指標及游離酪氨酸含量可知，發酵60 d 醬胚中的游離酪氨酸含量為38 mg/100 mL，遠低于黃豆醬白點析出的警戒線（內部試驗多次驗證結果為100 mg/100 mL），大大降低了產生白點的風險，該菌株能穩定降低醬豆中游離酪氨酸。

表3 目標菌株和對照菌種制得大曲的中性和酸性蛋白酶活力對比表 單位：U·g-1

表4 發酵不同時間對照樣和試驗樣醬胚的理化指標對比表

3 結論

從菌種庫中篩選出低中性蛋白酶活、低游離酪氨酸產率的酶系缺陷型米曲霉菌株，經黃豆醬發酵確定了低游離酪氨酸產率的酶系缺陷型的米曲霉菌株的應用效果，該菌株能滿足醬豆中低產酪氨酸的需求、性能穩定。