柚皮苷對(duì)骨細(xì)胞的作用以及負(fù)載柚皮苷的羥基磷灰石復(fù)合支架治療骨缺損的研究

梁 健 蘇 睿 宋泉生 伍 亮

骨缺損(bone defect)是指因感染、創(chuàng)傷、腫瘤等因素引起的骨質(zhì)短缺、骨的結(jié)構(gòu)完整性破壞,增加了骨折不愈合、延遲愈合及骨不連的風(fēng)險(xiǎn),提高了患肢功能障礙及殘疾概率的疾病[1]。骨骼對(duì)于較小的缺損具有自我修復(fù)的能力,但較大面積缺損會(huì)嚴(yán)重影響骨骼的完整性,導(dǎo)致骨骼無法自我修復(fù)[2]。骨移植技術(shù)被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損的有效方式,常見的骨移植材料有自體骨、同種異體骨和人工骨,其中自體骨因具有良好的組織相容性,移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng),是治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn),但因其供應(yīng)的骨量有限,且容易引起供體部位的感染、不愈合等并發(fā)癥,難以應(yīng)用于大面積骨缺損的修復(fù),限制了其在臨床上的應(yīng)用[3,4]。異體骨移植會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng),增加傳染病的風(fēng)險(xiǎn),且價(jià)格相對(duì)昂貴,難以普及臨床[5]。隨著組織工程的飛速發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn),負(fù)載中藥活性單體的復(fù)合支架對(duì)于骨缺損的治療具有明顯的促進(jìn)作用[6,7]。

柚皮苷(naringin, NAR)是一種黃酮類化合物,是中藥骨碎補(bǔ)的主要有效活性單體成分,可以通過提高堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性、Runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)等成骨相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化,促進(jìn)成骨細(xì)胞的鈣化,并可改變核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)相互作用和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡來抑制破骨細(xì)胞生成[8,9]。此外,還具有良好的促進(jìn)血管生成的作用。將柚皮苷與生物支架制成復(fù)合物,可以有效修復(fù)骨缺損。本文通過總結(jié)應(yīng)用負(fù)載柚皮苷的支架材料修復(fù)骨缺損的相關(guān)研究進(jìn)行綜述,以期為后續(xù)的臨床和科研工作者提供相應(yīng)依據(jù)。

一、柚皮苷對(duì)骨細(xì)胞的影響

1.柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞的影響:骨組織的穩(wěn)定依賴于成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞分化和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)這種平衡被打破,將會(huì)導(dǎo)致骨代謝疾病的發(fā)生[10]。成骨細(xì)胞是調(diào)節(jié)骨形成的細(xì)胞,對(duì)骨骼的生長和維持至關(guān)重要,通過分泌相關(guān)活性物質(zhì)骨鈣素、硬化素等,促進(jìn)骨形成,維持骨量的相對(duì)穩(wěn)定[11]。

劉小坡等[12]應(yīng)用柚皮苷灌服老年大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型發(fā)現(xiàn),4周后能明顯觀察到大鼠股骨組織骨小梁數(shù)量明顯增加,并且出現(xiàn)較多的成熟小梁狀骨,同時(shí)BMP-7的表達(dá)量明顯上調(diào),表明柚皮苷可以促進(jìn)新骨形成。侯婷婷等[8]通過使用含有柚皮苷的復(fù)合支架對(duì)人牙髓干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),應(yīng)用含有柚皮苷的復(fù)合支架可以增加ALP的活性,提高RUNX2、BMP-2蛋白的表達(dá)量,促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成,表明柚皮苷可以促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增殖以及成骨分化。覃浩然等[13]通過使用不同濃度的柚皮苷對(duì)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外干預(yù)發(fā)現(xiàn),48h后細(xì)胞內(nèi)有明顯的鈣沉積物形成,并且可增加細(xì)胞內(nèi)骨保護(hù)素(osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG)、RUNX2 mRNA和蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化。

2.柚皮苷對(duì)破骨細(xì)胞的影響:破骨細(xì)胞是骨組織中唯一的骨吸收細(xì)胞。RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、成熟的重要信號(hào)通路[14]。破骨細(xì)胞分泌的受體RANK是成骨細(xì)胞所分泌的RANKL的信號(hào)受體,兩者相互結(jié)合可促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化和成熟,并且抑制其凋亡[15]。OPG是一種調(diào)節(jié)骨吸收的可溶性蛋白,又稱破骨細(xì)胞生成抑制因子,具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡、抑制骨吸收的作用[16]。OPG可競爭性結(jié)合RANK,阻斷RANKL與RANK結(jié)合,阻止破骨細(xì)胞的分化和成熟,發(fā)揮骨保護(hù)因子的作用[15]。

秦紅霞等[16]對(duì)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)進(jìn)行培養(yǎng),3天后檢測OPG和RANKL的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在脂多糖刺激下OPG表達(dá)水平均較低,RANKL表達(dá)水平較高,而加入柚皮苷后能明顯增加成骨細(xì)胞增殖能力、ALP活性,同時(shí)提高OPG/RANKL的比值,表明柚皮苷通過上調(diào)成骨細(xì)胞OPG/RANKL的比值,抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收。此外,趙志虎等[15]研究顯示,在成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,柚皮苷可以促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG、RANKL的表達(dá),提高OPG/RANKL的比值,抑制破骨細(xì)胞的分化。

二、負(fù)載柚皮苷的羥基磷灰石復(fù)合材料

羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)和納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite, n-HAP)具有良好的生物相容性、生物活性、生物降解性、無毒性和骨傳導(dǎo)性,在體內(nèi)能夠與骨骼形成強(qiáng)有力的結(jié)合,并讓藥物緩慢結(jié)合并釋放到骨骼上,在降解同時(shí)釋放的無機(jī)離子可誘導(dǎo)骨生長,促進(jìn)骨缺損的修復(fù),作為促進(jìn)骨再生的藥物輸送載體而受到骨組織工程的廣泛關(guān)注[17,18]。

1.柚皮苷復(fù)合納米羥基磷灰石-膠原蛋白:nHAp是人體骨、牙無機(jī)組成的主要成分,植入體內(nèi)后可被人體組織吸收和取代,有效促進(jìn)骨骼的生長,是一種理想的骨修復(fù)材料,被廣泛應(yīng)用于骨科、口腔組織工程等領(lǐng)域[19,20]。膠原具有良好的生物相容性,有助于促進(jìn)細(xì)胞的增殖和成骨分化[21]。納米羥基磷灰石/膠原(collagen, COL)復(fù)合材料結(jié)合了納米羥基磷灰石、膠原的優(yōu)勢(shì),具有良好的生物相容性、可降解性以及骨傳導(dǎo)性,通過提高血管內(nèi)皮生長因子水平促進(jìn)局部微血管的形成,加速骨缺損部位修復(fù),是一種相對(duì)理想的、新型可降解的骨替代材料[22]。侯婷婷等[8]研究發(fā)現(xiàn),柚皮苷-羥基磷灰石/膠原復(fù)合支架(NAR-HAP/COL)具有良好的結(jié)構(gòu)和生物性能,在體內(nèi)不易降解,能夠?yàn)榉N子細(xì)胞的生長、增殖、分化和黏附提供優(yōu)良條件,在體外可促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增殖以及成骨分化。左艷萍等[23]采用原位合成法制備柚皮苷-納米羥基磷灰石膠原復(fù)合材料(NAR-nHAP/COL),發(fā)現(xiàn)該材料抗壓強(qiáng)度為119.74MPa,與人體骨骼接近,且柚皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定,性能良好,有利于柚皮苷生物活性的發(fā)揮。然而,李晉玉等[24]將骨碎補(bǔ)總黃酮置于納米羥基磷灰石-膠原復(fù)合材料與成骨細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均表現(xiàn)出良好貼附、生長和增殖能力,但骨碎補(bǔ)總黃酮并不能促進(jìn)該共培養(yǎng)體系中血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖可能與成骨細(xì)胞分泌成纖維細(xì)胞生長因子-2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2)有關(guān)。

2.柚皮苷復(fù)合羥基磷灰石-殼聚糖:殼聚糖是一種具備良好的生物相容性、吸附性、生物降解性以及骨傳導(dǎo)性的聚合物,在促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、傷口愈合、藥物運(yùn)輸方面具有較大優(yōu)勢(shì),是治療骨缺損的理想材料[25]。梁衛(wèi)寰等[26]采用共沉淀的方法制備載柚皮苷的羥基磷灰石/殼聚糖人工骨載藥體系,發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物具有良好的抗壓強(qiáng)度以及藥物緩釋作用,在降解的過程中可以緩慢釋放柚皮苷,可持續(xù)地發(fā)揮促進(jìn)成骨的作用,并且其藥物釋放速率以及降解速率隨殼聚糖含量的增大而增大。盧育南等[27]將柚皮苷-殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合支架植入大鼠顱骨骨缺損模型中,4周后發(fā)現(xiàn)該支架可提高缺損部位骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá),同時(shí)CT掃描顯示新生骨廣泛填充了缺損孔隙,骨缺損修復(fù)良好,與對(duì)照組比較,殼聚糖/羥基磷灰石為柚皮苷提供了良好的載體,加速新生骨組織的形成。

3.柚皮苷復(fù)合羥基磷灰石-絲素蛋白:絲素蛋白(silk fibroin, SF)作為一種天然聚合物,具有優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度、良好的生物相容性、可塑性以及生物可降解性,可與其他生物材料結(jié)合形成復(fù)合支架,模擬自然骨環(huán)境,誘導(dǎo)成骨,是目前組織工程中的研究熱點(diǎn)材料之一[28]。Zhao等[29]研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)用鑲嵌柚皮苷的復(fù)合絲素蛋白/羥基磷灰石 (NG/SF/HAP) 支架培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,與不含柚皮苷的SF/HAP支架比較,柚皮苷可以促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞長入SF/HAP支架并促進(jìn)成骨分化,并且在 NG/SF/HAP支架中培養(yǎng)的細(xì)胞的成骨和血管生成能力優(yōu)于在 SF/HAP支架中培養(yǎng)的細(xì)胞,表明摻入柚皮苷的SF/HAP復(fù)合支架具有具有骨誘導(dǎo)性、血管生成活性以及骨再生的潛力。Yu等[30]先把柚皮苷加載到明膠微球(GM)中,在將這些微球被封裝在絲素蛋白 (SF)/納米羥基磷灰石 (nHAP) 支架中制成柚皮苷/明膠微球/納米羥基磷灰石/絲素蛋白 (NG/GMs/nHAP/SF)三維支架,并指出該支架具有良好的生物相容性、生物力學(xué)強(qiáng)度,并促進(jìn)BMSCs黏附、增殖和體外鈣結(jié)節(jié)的形成,植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后可促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。

三、展 望

柚皮苷是中藥骨碎補(bǔ)的主要有效單體成分,是一類天然存在的二氫黃酮類化合物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),柚皮苷可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和抑制破骨細(xì)胞的分化,進(jìn)而促進(jìn)骨形成,調(diào)節(jié)骨代謝,可用于治療骨質(zhì)疏松癥、骨缺損等骨科疾病。羥基磷灰石是一種天然的生物材料,是人體骨骼中的主要無機(jī)成分之一,具有良好的生物相容性、降解性和骨傳導(dǎo)性,可與膠原蛋白、殼聚糖、絲素蛋白等生物材料結(jié)合形成復(fù)合支架,并作為藥物載體負(fù)載柚皮苷,增強(qiáng)成骨分化、促進(jìn)骨形成的能力,是組織工程的研究熱門材料,可用于骨缺損的修復(fù)。目前,負(fù)載柚皮苷的羥基磷灰石復(fù)合支架材料修復(fù)骨缺損仍處于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,均取得明顯的修復(fù)骨缺損的治療效果,在理論和實(shí)踐上表明了負(fù)載柚皮苷的羥基磷灰石復(fù)合支架材料的安全性和有效性,然而,尚未有關(guān)于臨床應(yīng)用的報(bào)道。隨著骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展,期望今后深入開展負(fù)載柚皮苷的羥基磷灰石復(fù)合支架研究,為骨缺損的治療提供更多途徑。