cAMP/Epac信號通路在ARDS中的作用研究進展

陳洪流 李超乾

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指各種肺內和肺外致病因素所導致的急性彌漫性肺損傷和進而發展的急性呼吸衰竭。雖然ARDS的發病機制尚未完全闡明,但主流的觀點認為炎性反應介導的肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞損傷是促進ARDS發生、發展的重要因素。盡管經過了幾十年的研究,ARDS的病死率依舊高達40%左右[1]。而目前ARDS的治療仍以病因控制和支持治療為主,尚缺乏有效的治療藥物。近年來研究發現,cAMP/Epac信號通路參與炎性反應、血管內皮和肺上皮屏障功能、凝血功能、肺成纖維細胞分化等調控過程,這些作用可能與ARDS的發生、發展有所關聯。因此本文就cAMP/Epac信號通路在ARDS中的作用做一綜述,以尋找ARDS防治的新靶點。

一、cAMP/Epac信號通路概述

環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)是作用最廣泛的第二信使,參與調控一系列不同的生理過程,包括鈣轉運、門控離子通道、骨骼肌和平滑肌收縮、學習和記憶、細胞生長、分化、凋亡和炎癥等[2]。多種細胞外配體與G蛋白偶聯受體結合,可激活膜結合型腺苷酸環化酶,從而催化三磷酸腺苷生成cAMP。G蛋白偶聯受體通過腺苷酰基環化酶和cAMP磷酸二酯酶密切調控細胞內cAMP含量。早期的研究認為cAMP主要通過激活下游信號分子蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)實現其生物學效應,而de Rooij 等[3]在1998年發現了一種新的cAMP下游信號分子,即環磷酸腺苷活化交換蛋白(exchange protein directly activated by cAMP,Epac),從此針對cAMP/Epac信號通路的研究拉開序幕。

Epac包含兩個亞型,即Epac1和Epac2。Epac1在生物體內廣泛表達,Epac2主要在大腦和腎上腺表達,在心臟、血管系統、腎臟和肺部的也有表達。Epac主要由N端的調節區和C端的催化區組成,cAMP核苷酸結合位點位于調節區,Epac1存在1個結合位點,而Epac2存在兩個結合位點;催化區存在兩個重要的結構域,分別被稱為REM和RA,前者為Ras交換基序,后者為Ras結合基序。Epac在質膜、核周區域、核膜和線粒體均有表達,細胞內Epac空間區隔化表達在細胞周期中似乎受到嚴格的調控,這一特征與Epac在多種信號轉導中能發揮廣泛的差異性作用密切相關。近年的研究證實Epac參與調控一系列不同的效應因子和關鍵信號轉導過程,包括鈣離子轉運和離子運輸、細胞增殖和分化、細胞生存和凋亡、基因轉錄和染色體完整性、囊泡的運輸和分泌、屏障功能和神經元反應等[4]。

二、cAMP/Epac信號通路在ARDS中的作用

1.cAMP/Epac在炎性反應中的作用:人們對炎性反應在ARDS中的作用進行了大量的研究,各種肺內或肺外因素引起的損傷可導致炎性細胞的激活,這是ARDS的啟動因素。過度炎性反應可引起肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞受損,從而導致以彌漫性肺間質和肺泡水腫為主要特征的ARDS的發生。因此,控制失衡的炎性反應對于ARDS的防治是至關重要的。

cAMP/Epac信號通路與炎癥調節密切相關。Wang等[5]研究發現,槲皮素通過增加肺組織的cAMP和Epac含量,抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的肺內炎性細胞因子的釋放,阻斷中性粒細胞的募集,并以劑量依賴的方式減少肺內白蛋白的滲漏。此外,槲皮素通過激活cAMP/Epac信號通路,抑制LPS誘導的小鼠肺上皮細胞分泌角質形成細胞衍生的趨化因子。Wang等[6]研究發現,Epac激動劑8CPT可減少LPS誘導的小鼠肺泡灌洗液白細胞數量,減少肺組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6和IL-1β等炎性細胞因子的表達。Xing等[7]研究認為心鈉素可通過激活Epac/ Ras相關蛋白1(ras-related protein 1,Rap1)/T淋巴瘤侵襲誘導基因1(T lymphoma invasion and metastasis gene1,TIAM1)/Rac信號通路減輕LPS和TNF-α誘導的肺微血管內皮細胞炎性反應。近年來研究認為,Epac激動劑可通過激活cAMP/Epac/Rap1信號通路,減輕LPS誘導的人肺動脈內皮細胞的炎性反應,減少中性粒細胞的黏附和遷移[8]。

Jiang等[9]研究發現,Epac1基因敲除的小鼠視網膜高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)-1及IL-1β表達增加,而Epac1激動劑可減少高糖處理的視網膜內皮細胞上述炎性細胞因子的表達。Barker等[10]研究表明,Epac1激動劑I942可上調抑炎性細胞因子信號轉導抑制分子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)表達,進而抑制Janus激酶(janus kinase,JAK)/信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/IL-6信號通路,減輕血管內皮細胞炎癥。由此可見,cAMP/Epac信號通路可通過多種途徑抑制炎性反應,對ARDS防治可能有所幫助。

2.cAMP/Epac對血管內皮細胞的作用:各種致病因素導致機體的損傷可誘導炎性反應的產生,過度炎性反應可引起肺血管內皮細胞受損。受損的內皮細胞不僅是誘發ARDS的主要靶細胞,而且是活躍的效應細胞。由此可見,維持肺血管內皮細胞的屏障功能、減輕內皮細胞的損傷對于ARDS的防治是非常重要的。

肺毛細血管屏障的通透性是由黏附連接、緊密連接、縫隙連接調節的。內皮細胞黏附連接主要由血管內皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、連環蛋白等構成。緊密連接主要由封閉蛋白、閉合蛋白、閉鎖小帶蛋白以及緊密連接黏附分子等構成[11]。β2受體激動劑、前列腺素和佛司可林均可通過提高細胞內cAMP水平,激活下游Epac/Rap1信號通路,調控與緊密連接和黏附連接相關的肌動蛋白-微管網絡,從而增強內皮屏障功能,減少血管滲漏[12]。近年來研究發現,血管內皮細胞cAMP水平上升可通過激活Epac/SOCS3/ STAT3信號通路減輕血管內皮炎性反應、增強內皮屏障功能[13]。另一項研究表明,cAMP/Epac信號通路的活化一方面可通過抑制促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)/細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號通路保護血管內皮細胞并增強其屏障功能;另一方面可通過同時抑制磷脂肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/Akt) 和 MEK/ERK信號通路減少caspase-3/7表達,從而抑制血管內皮細胞凋亡,增加內皮細胞存活[14]。此外,研究者在對人臍靜脈內皮細胞的實驗中發現,Epac激動劑 8CPT-2Me-cAMP可促進肌動蛋白結構重組,增加VE-cadherin和閉鎖小帶蛋白(zonula occludens,ZO)1表達,從而改善再生肺支架的內皮屏障功能[15]。

Wang等[16]研究發現,預防性給予多巴胺或多巴胺D1受體激動劑可通過活化cAMP/Epac信號通路使組蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)失活,抑制機械性拉伸誘導的α-微管蛋白脫乙酰基,從而減輕機械性拉伸誘發的肺內皮屏障功能障礙和肺損傷。貝前列環素可通過激活cAMP/Epac/Rap1信號通路,減少LPS誘導的人肺動脈內IL-8、細胞間黏附分子1以及血管細胞黏附分子1的表達,從而減輕內皮滲漏[8]。前列腺素E2和貝前列環素可通過cAMP活化PKA、Epac/Rap1和TIAM1/Vav2依賴的信號通路,增加外周F-肌動蛋白和連接蛋白表達,從而保護肺動脈內皮細胞屏障功能[17]。綜上所述,研究認為cAMP/Epac信號通路的活化可保護血管內皮細胞、增強血管屏障功能。

3.cAMP/Epac對肺上皮細胞的作用:肺泡上皮作為一個緊密的屏障,限制水、電解質以及小分子親水溶劑的通過,從而維持正常的氣體交換功能。各種致病因素可直接或間接損傷肺泡上皮細胞,破壞上皮屏障功能,致使大分子和蛋白豐富的液體進入肺泡間質和肺泡腔,從而導致ARDS的發生。因此,保護肺泡上皮細胞、維持肺上皮屏障功能是防治ARDS的重要環節之一。

Scheibner等[18]研究認為,內生性的腺苷受體A2活化可抑制高分子透明質酸降解產物誘導的氣道上皮細胞炎癥,這與激活cAMP/Epac信號通路,進而抑制核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)表達有關。Cao等[19]研究發現Epac抑制劑ESI-09可誘導小鼠肺泡上皮細胞應力性纖維形成增多,而連接蛋白降解增加,因此Epac可能有助于增強肺上皮細胞的屏障功能。維持肺泡上皮屏障功能的穩態主要是由黏附連接和緊密連接實現的。

Young等[20]研究發現脫細胞細胞外基質(decellularized extracellular matrix,dECM)添加層粘連蛋白后,可明顯增強肺泡上皮屏障功能。這些作用與其活化Epac/Rap1通路,從而上調緊密連接蛋白(claudin)-18、連接黏附分子(junctional adhesive molecule,JAM)-A表達密切相關。另有研究表明A型激酶錨定蛋白9(A-kinase anchoring protein9,AKAP9)是內皮屏障和上皮屏障的關鍵調節因子。COPD誘導劑香煙煙霧可通過下調氣道上皮細胞AKAP9的表達,進而減少上皮E-鈣粘蛋白的表達,從而導致上皮屏障功能受損[21,22]。而近年來研究證實Epac1抑制劑ESI-09可使AKAP9在上皮細胞的定位錯誤和功能降低[23]。由此筆者推測cAMP/Epac1信號通路參與AKAP9對上皮屏障功能的調控。因此, 筆者認為cAMP/Epac1信號通路活化具有保護肺泡上皮細胞、維持肺上皮屏障功能的作用。

4.cAMP/Epac對凝血功能的影響:凝血激活和過度炎性反應是 ARDS 病理生理的基本特征之一。過度炎性反應可引起血管內皮細胞損傷,促進血小板活化并聚集到損傷的內皮,同時中性粒細胞以及其他吞噬細胞被招募到微血管中,與血小板相互作用,放大促凝和炎性反應,導致微血管血栓(免疫血栓)形成。免疫血栓形成有助于病原體的清除和血管內皮的修復,然而,失控的免疫血栓形成會引起附帶的組織損傷,從而導致器官功能障礙。目前已證實ARDS的發生與肺泡和肺間質中凝血活動增強及纖維蛋白溶解活動減弱有關[1]。因此抗凝和抑制血小板活化可能有助于ARDS的防治。

He等[24]通過人類心臟活檢發現Epac1表達降低與心房附壁血栓形成具有一定的相關性。隨后的動物實驗證實,Epac1基因缺失的小鼠對化學誘導的頸動脈閉塞更敏感。而Epac1抑制劑可減少血管內皮細胞促纖維蛋白溶解復合物(ANXA2-S100A10)2的形成。Chu等[25]在大腦中動脈閉塞的小鼠實驗中發現,安菲博肽(一種特異性的血小板膜糖蛋白Ⅰb受體拮抗劑)可通過激活cAMP/Epac信號通路減少腦梗死面積、減輕腦缺血再灌注損傷。血管性血友病因子(von willebrand factor,VWF)是凝血途徑激活的主要成分之一,也是血管炎癥的重要介質,在血栓炎癥中發揮重要作用。Xiao等[26]研究發現,Epac1基因缺失的LPS誘導小鼠血漿VWF水平較野生型小鼠增高,且肺組織內出現微血栓。此外,體外實驗發現Epac1通過PI3K/內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)依賴的方式抑制TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞VWF的分泌。以上的研究表明,cAMP/Epac通路的活化可促進纖維蛋白溶解、抑制血栓形成,可能有助于ARDS防治。

5.cAMP/Epac對肺成纖維細胞的作用:ARDS的病理生理過程一般包括3個階段。早期為滲出期,以彌漫性肺間質和肺泡水腫為主要特征,這一階段與肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷以及肺泡內炎癥細胞的激活密切相關。約1周后進入第2階段即增殖期,此時肺水腫減輕,出現Ⅱ型肺泡上皮增生、膠原纖維沉積,炎性細胞及成纖維細胞浸潤等改變。急性損傷后存活的患者有一部分進入第3階段即慢性纖維化期。因此,阻止肺纖維的進展可改善ARDS患者預后。

研究表明,Epac作為一種新興的cAMP下游分子,對成纖維細胞增殖、應力性纖維形成以及上皮細胞黏附均有抑制作用,在遏制肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)發展的過程中扮演著重要角色,因此它有可能成為PF藥物開發和治療的新靶點。肺成纖維細胞負責膠原蛋白的生成和細胞外基質的沉積,與纖維化過程直接相關。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是目前誘導成纖維細胞活化的最重要因子之一,在TGF-β的刺激下,成纖維細胞表達α-平滑肌肌動蛋白和膠原蛋白,分化成更具收縮力、增生性和分泌性的肌成纖維細胞。所有這些過程均涉及Epac和PKA的中介作用。

三、展 望

炎性反應是ARDS的啟動因素,炎性細胞可通過分泌細胞因子、氧自由基、蛋白水解酶等損傷肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞,而受損的上皮和內皮細胞通過分泌細胞因子和黏附分子,促進血小板、中性粒細胞以及巨噬細胞等在微血管聚集形成免疫血栓,失控的免疫血栓進一步加重炎性反應和凝血功能失衡,它們相互作用的惡性循環,最終導致ARDS的發生、發展。cAMP/Epac信號通路的激活,具有抑制炎性反應,增強肺血管內皮屏障功能,保護肺上皮細胞,促進纖維蛋白溶解、抑制血栓形成以及抑制肺纖維化等作用。由此推測,在ARDS防治進程中,cAMP/Epac信號通路有可能成為新的干預靶點。