細胞自噬在急性呼吸窘迫綜合征中的研究進展

黃承軍，徐宇，秘樂，王秀軍，劉振峰，王紅嫚△

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是繼發于內皮-上皮屏障破壞、白細胞過度跨上皮遷移、促炎細胞因子過度產生的急性呼吸系統疾病，以毛細血管通透性過度增加導致雙肺非心源性水腫伴嚴重低氧血癥為特征［1］。該病總病死率高達35%～46%，但目前尚無統一且有效的治療措施［2］。因此，深入研究ARDS 的發病機制，尋找有效的治療靶點對ARDS 的防治具有重要意義。炎癥反應的失控是ARDS 進展的關鍵。有研究發現，細胞自噬通過調節細胞功能、介導細胞因子的表達釋放對炎癥進程有重要影響［3］。Liu等［4］在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）氣管滴注構建的小鼠肺泡巨噬細胞炎癥模型中，采用間充質干細胞外泌體抑制細胞自噬后，發現炎癥反應減輕。然而，Li等［5］在盲腸結扎穿孔誘導的膿毒性小鼠急性肺損傷（acute lung injury，ALI）中，予以細胞外囊泡抑制細胞自噬后，小鼠肺損傷加重。自噬對ARDS 炎癥反應是促進還是抑制作用，可能與ARDS的誘因和各個病理階段最適自噬程度有關。本文就細胞自噬發生機制及其在ARDS中的作用進行綜述。

1 自噬及其主要機制

自噬是真核細胞中老化細胞器或侵入胞內病毒、細菌等大分子物質的唯一降解途徑［6］。因此，自噬為細胞的生長肅清了障礙［7］。自噬包括巨自噬、微自噬及伴侶介導的自噬，其中巨自噬最常見，其過程大致可分為自噬誘導、自噬體的組裝和形成、自噬體與溶酶體的融合以及囊內產物的降解4個階段［8］。20 世紀90 年代隨著調控自噬相關基因ATG1-16的發現［9］，自噬機制的研究進入分子水平。研究發現自身免疫疾病、癌癥、神經退行性病變等均與自噬缺陷或過度自噬密切相關，尤其對宿主防御至關重要，自噬一方面通過自噬小泡對胞內病原體包裹，將其輸送到溶酶體進行降解；另一方面可通過介導炎性細胞因子的產生調節炎癥反應［10］。然而，自噬異常或失控也可使部分功能正常的細胞器受損或功能蛋白降解，細胞發生自噬性死亡，導致相關組織器官發生功能障礙。因此，探討自噬的發生機制及其在疾病發生發展中的作用，對疾病防控具有重要意義。目前，自噬的發生機制尚不完全明確，可能與細胞能量代謝失衡相關，而參與調控自噬的細胞信號通路錯綜復雜，包括雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路；同時，自噬調節還與活性氧（ROS）的氧化作用和內質網應激密切相關。

1.1 mTOR信號通路 mTOR是調節細胞自噬上游信號通路的交匯點。mTOR包括mTOR1和mTOR2兩個蛋白信號復合體，其中mTOR1參與調節細胞代謝、自噬、凋亡等，mTOR2與細胞骨架重組相關［11］。mTOR1的活性受細胞氨基酸及能量攝入的影響，當攝入營養充足時，mTOR1發生磷酸化并抑制自噬啟動蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）的活化；而攝入缺乏時，mTOR1去磷酸化，解除了對ULK1的抑制作用；ULK1通過活化beclin1 激活磷酸肌醇3-激酶催化亞基Ⅲ型（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）復合物，PI3K 將自噬相關蛋白（autophagy-related protein，Atg）16 復合物募集到自噬體前體結合位點，促進磷脂酰乙醇胺（ptdEth，PE）與微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein1 light chain 3，LC3）結合，使LC3 被修飾成為LC3Ⅱ，并被錨定于脂質雙分子層，PE-LC3復合物通過不斷募集脂質使隔離膜延伸，最終形成封閉的雙膜脂質結構的自噬體，在SNARE 跨膜蛋白的介導下，自噬體與溶酶體融合，自噬體內容物被多種溶酶體水解酶降解釋放至細胞質中再利用［12］。另外，mTOR1 也可以通過磷酸化AMBRA1（自噬/Beclin1 調控因子）降低ULK1穩定性［13］、磷酸化ATG14及調節溶酶體相關基因的轉錄［14］，從而負向調節細胞自噬。

1.2 AMPK 信號通路 AMPK 是真核細胞重要的能量傳感器，可靈敏感知細胞內腺苷一磷酸（adenosine monohosphate，AMP）/腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）比率變化，當能量缺乏、AMP/ATP 比率增加或葡萄糖剝奪時，AMPK 被激活［15］。活化的AMPK不僅可調節能量代謝，而且對線粒體裂變與融合的平衡、細胞自噬均有調節作用。在敲除AMPK的HeLa 細胞中自噬水平明顯降低；自噬早期，AMPK 通過促進ULK1和beclin發生磷酸化抑制mTOR信號通路，從而促進自噬；另外，在葡萄糖剝奪條件下，AMPK與線粒體融合因子之間結合力減弱，胞質內大量活化的AMPK 呈游離狀，促使AMPK與線粒體裂變因子結合并使其發生磷酸化，從而調節線粒體裂變融合平衡和線粒體自噬［16］。Guo等［17］研究發現，煙堿通過靶向GPR109A 基因，激活AMPK 信號通路，從而促進細胞自噬和核因子-E2 相關因子2（nuclearfactor erythroidderived 2-like 2，Nrf2）核輸入，最終起到防治乳腺炎、修復血乳屏障的作用。

1.3 ROS 與自噬 ROS 是一種高活性的小分子物質，對DNA、蛋白質及脂質均有氧化作用，ROS 可通過氧化相關蛋白，在自噬的激活中發揮重要作用。Fang 等［18］研究發現，三氧化二砷可誘導細胞產生ROS，而ROS 的氧化作用可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路中AKT和mTOR的磷酸化，從而負向調節該通路，激活細胞自噬，最終對動脈粥樣硬化發揮保護性作用。另有研究報道，自噬可通過促進細胞抗氧化反應、減少線粒體的產生，從而抑制ROS的生成［19］。因此，ROS與自噬可相互影響，ROS 可促進自噬，而自噬可減少ROS 的產生。

1.4 內質網應激 內質網是蛋白質折疊、組裝為成熟蛋白的場所。當機體處于應激狀態或細胞內環境改變時，機體對功能成熟蛋白的需求增加，此時內質網的蛋白修飾功能相對不足，導致錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白的累積；當細胞受到的刺激過強或呈持續狀態，可造成內質網損傷，受損內質網被自噬囊泡吞噬降解，自噬是恢復內質網穩態最后的手段［20］。Wang 等［21］在顆粒物誘導的內皮細胞內質網應激中，給予內質網應激抑制劑4-苯基丁酸干預后，細胞自噬水平降低，細胞凋亡數量減少。Zhang 等［22］研究發現，香菇多糖可通過誘導內質網應激促進細胞自噬，從而抑制結腸癌增殖。

2 細胞自噬與ARDS

2.1 肺泡巨噬細胞（alveolar macrophages，AM）自噬與ARDS AM約占肺泡腔常駐細胞的80%，是肺泡腔最豐富的免疫細胞［23］。AM 具有高度可塑性，可誘導分化為促炎性質的M1型和抗炎性質的M2型細胞，AM主要通過吞噬病原體、釋放細胞因子直接調控炎癥反應或調節其他免疫細胞功能，影響ARDS 炎癥進程。近年研究發現，AM 自噬可調節細胞極化、抗原呈遞和吞噬功能。Liu等［24］研究發現，老年小鼠來源的巨噬細胞自噬水平低于年輕小鼠，在LPS誘導巨噬細胞極化的實驗中，加入3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬后，M1型極化更為明顯，炎癥反應加劇。活化的巨噬細胞高表達組織相容性復合物（MHCⅠ、MHCⅡ）抗原呈遞分子，巨噬細胞加工后的抗原肽段可與抗原呈遞分子結合形成復合物，再將抗原呈遞給CD4+或CD8+T細胞［25］，激活產生效應T細胞，介導細胞免疫反應。Ligeon 等［26］研究發現巨噬細胞自噬通過維持吞噬體的LC3修飾，促進MHCⅡ類分子的抗原加工呈遞功能。LC3 與自噬體結合后可形成一種更易與溶酶體融合的復合物，稱為LC3 相關吞噬體（LC3-associated phagocytosis，LAP）。Gluschko 等［27］研究發現，巨噬細胞通過LAP靶向單核細胞增生李斯特菌，增強小鼠免疫力和巨噬細胞的抗李斯特菌活性。另外，Xu等［28］研究發現，巨噬細胞自噬通過激活NLRP3 炎性小體，增強巨噬細胞吞噬功能，促進病原體的清除。以上研究提示巨噬細胞自噬可減輕ARDS炎癥反應，適當地促進巨噬細胞自噬可能成為減輕ARDS 的有效方法。

2.2 中性粒細胞自噬與ARDS 中性粒細胞是促進炎癥反應和病原體清除的主要免疫細胞之一，活化的中性粒細胞通過吞噬、脫顆粒和中性粒細胞外網陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成發揮促炎和抗菌作用，而自噬對中性粒細胞的產生及其功能的發揮均有重要調節作用［9］。首先，自噬促進造血干細胞中損傷和老化線粒體的清除，降低干細胞中ROS 的累積，維持干細胞正常代謝而使其能夠分化為成熟的中性粒細胞［29］。Jung 等［30］通過ATG5 基因敲除構建自噬缺陷小鼠，發現小鼠骨髓造血干細胞中線粒體過度累積，細胞出現功能障礙，外周血有核細胞數量明顯減少。另外，中性粒細胞對病原體的殺傷依賴于細胞吞噬作用和ROS 的產生釋放，而自噬與吞噬功能密切相關，膜識別受體在抗原刺激下被激活，誘導選擇性自噬的發生，自噬蛋白LC3與單模的吞噬體結合促進吞噬溶酶體形成和成熟，吞噬功能明顯增強，同時自噬有助于病原體碎片的消除［31］。研究還發現，中性粒細胞ATG5基因沉默后，細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬能力明顯降低［32］。脫顆粒是指活化的中性粒細胞釋放含有大量炎性蛋白和堿性磷酸酶的顆粒至細胞質，該顆粒物質具有病原體殺傷作用［33］。Bhattacharya等［34］研究發現，抑制自噬后中性粒細胞脫顆粒減少，而自噬基因敲除小鼠中，由中性粒細胞介導的炎癥反應減弱。當中性粒細胞受到一定強度刺激后，細胞內膜失去完整性，核膜崩解，釋放出細胞組蛋白和DNA 形成NETs，該纖維網絡上密集分布著高活性的中性粒細胞彈性蛋白酶和過氧化物酶等，具有捕獲并殺滅病原體的作用［33］，而自噬有助于該纖維網的形成。Guo等［35］使用海藻糖誘導中性粒細胞發生自噬后，NETs 形成增加；相反，用3-甲基腺嘌呤抑制自噬后不能有效形成NETs。以上研究提示中性粒細胞自噬可促進中性粒細胞成熟，促進病原體的清除，對ARDS有保護性作用。

2.3 上皮細胞自噬與ARDS 上皮細胞是肺暴露于外界的主要細胞，是保護肺組織免受環境侵害的機械屏障［36］。機械通氣是當前治療ARDS 的主要措施，長時間的呼吸機治療會造成上皮細胞的應激性損傷，導致并發癥發生率及病死率增加［37］。Tsai等［38］研究發現，在過氧化氫誘導的上皮細胞炎癥反應中，補體調節蛋白CD46可增強細胞自噬，從而減輕炎癥反應并減少細胞凋亡；而給予3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，氧化應激反應增強，白細胞介素前體（pro-IL-6、pro-IL-1β）和NLRP3 炎性小體表達水平升高，細胞凋亡數量增多，提示上皮細胞自噬可抑制氧化應激介導的炎癥反應。LPS可誘導支氣管上皮細胞mTOR 蛋白磷酸化，抑制細胞自噬，造成細胞炎性損傷；給予自噬抑制劑干預后促炎因子表達水平升高，細胞損傷加劇［39］。然而，也有研究發現小鼠氣道上皮細胞和人支氣管上皮細胞暴露于顆粒物后，細胞自噬能力增強；敲低mTOR 基因促進細胞自噬后，炎癥反應加重［40］。Tan 等［41］通過抑制LPS 誘導的肺泡上皮細胞A549 過度自噬后，細胞活力增加，細胞凋亡數量減少，白細胞介素和腫瘤壞死因子等促炎因子表達水平降低。以上研究提示上皮細胞自噬在ARDS進程中具有雙重作用，可以減輕或加重肺損傷，該結果取決于誘導因素及自噬程度。

2.4 血管內皮細胞自噬與ARDS 血管內皮細胞是血液與下層組織之間的一道屏障，控制血液與組織液之間的物質交換。相鄰內皮細胞間的鈣黏蛋白是內皮屏障的結構基礎，鈣黏蛋白減少可使肺組織蛋白液集聚或多種炎性細胞浸潤，導致ARDS 的發生［42］。Slavin 等［43］在LPS 誘導的ARDS 小鼠模型中加入3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，肺組織中性粒細胞滲出減少，肺血管損傷減輕；在凝血酶誘導的血管內皮細胞屏障障礙模型中加入自噬抑制劑后發現，鈣黏蛋白的降解被抑制，應力纖維的形成減少，有效恢復了內皮屏障功能，提示自噬可促進鈣黏蛋白的降解，加重肺損傷。然而，Reglero-Real等［44-45］研究發現血管內皮細胞自噬可調節細胞黏附分子的表達及降解，以降低血管通透性，有效防止中性粒細胞的過度跨上皮遷移。此外，內皮細胞自噬可通過抑制ROS的產生降低血管的通透性，從而維持內皮屏障的完整［46］。Kong等［47］研究發現，內皮細胞自噬可激活AMPK 信號通路，促進受損線粒體的降解及重新合成，維持內皮細胞自身正常的能量代謝，進而減輕LPS對內皮黏附連接功能的損害。以上研究提示內皮細胞自噬通過調節血管通透性對ARDS炎癥進程有重要影響，但其是發揮保護性作用還是損傷性作用，需進一步研究論證。

3 小結與展望

自噬是應激狀態下維持細胞穩態的主要適應性反應，作為固有免疫的重要組成，在炎癥調節及免疫穩態中發揮關鍵作用。自噬可通過調節相應細胞功能促進病原體的清除，同時也可通過抑制促炎細胞因子的產生而減輕ARDS；相反，過度自噬會使細胞發生自噬性死亡，加劇ARDS。因此，維持適度的細胞自噬有助于減輕炎癥反應。目前已開發的自噬調節劑包括PI3K抑制劑、mTOR抑制劑、氯喹與羥氯喹等，其中PI3K 抑制劑3-甲基腺嘌呤、氯喹等在抗腫瘤方面的應用已進入臨床試驗階段［48］，但是其在ARDS炎癥性疾病方面作用的研究仍處于動物或細胞實驗階段。未來有待深入研究細胞自噬機制以及自噬對炎癥的調節作用，為ARDS 的防治提供新思路。