超高效液相色譜質譜聯用技術測定動物源食品中的11種磺胺類獸藥殘留

李雯雯 杜蒙 王曉軍 孫允超

摘 要：本研究建立了基于超高效液相色譜串聯質譜技術（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）的磺胺類獸藥殘留分析方法。方法學考察表明，11種磺胺類獸藥殘留在10～200 μg·L-1呈現良好的線性關系；方法檢出限為0.84～1.62 μg·kg-1，方法定量限為2.8～5.4 μg·kg-1；在3個濃度水平下，目標化合物的加標回收率為74.5%～109.9%，相對標準偏差為0.09%～8.12%。該方法可用于動物源食品中多種磺胺類獸藥殘留的定性、定量分析及篩查。

關鍵詞：磺胺類獸藥殘留；液相色譜串聯質譜技術；分析篩查

Abstract： In this study， a method for the analysis of sulfa veterinary drug residues based on ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was established. Methodological investigation showed that the residues of 11 sulfonamides showed a good linear relationship in the range of 10～200 μg·L-1. The limits of detection were 0.84～1.62 μg·kg-1， and the limits of quantification were 2.8～5.4 μg·kg-1. The recoveries were 74.5%～109.9% and the relative standard deviations were 0.09%～8.12% at the three concentration levels. The method is suitable for qualitative and quantitative analysis and screening of various sulfonamides veterinary drug residues in animal derived food.

Keywords： sulfonamides veterinary drug residues; ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; analysis and screening

磺胺類藥物是一類以對氨基苯磺酰胺為基本母核結構的化學合成抗菌藥物，具有廣譜、高效、價低等特點，在畜禽養殖過程中，為預防和控制疾病，常被添加到飼料中使用[1]。但磺胺類藥物在人體中代謝時間較長，易在人體內蓄積。隨著近年來獸藥的大量使用，甚至濫用和誤用，出現了耐藥性、藥物殘留過高、部分人群過敏中毒等問題。動物源食品中的磺胺類藥物殘留逐漸引起人們的重視，從2005年起，農業農村部對動物產品中的磺胺類藥物殘留進行重點管控。2022年9月，農業農村部發布了第594號公告，發布了《食品安全國家標準 食品中41種獸藥最大殘留限量》（GB 31650.1—2022）[2]，對磺胺類藥物（總量）和磺胺二甲嘧啶的最大殘留量分別進行了補充。與此同時，磺胺類藥物殘留的檢測技術逐步更新。傳統的磺胺類獸藥殘留檢測方法包括液相色譜質譜法、液相色譜法、酶聯免疫分析法和熒光分析法，其中液相色譜質譜聯用技術因靈敏度高、準確度好、高通量等優點，被廣泛應用于動物源食品中的獸藥多殘留檢測分析[3-4]。

本研究擬建立11種磺胺類獸藥殘留的液相色譜質譜檢測技術，通過對質譜的檢測參數進行優化和方法學評估，形成一種高效、精確的磺胺類獸藥殘留分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺類標準品：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲惡唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶，均購于壇墨質檢科技股份有限公司；Knorth HLB固相萃取柱，北京科德諾思技術有限公司；豬肉，購自聊城華盛超市；HPLC甲醇、HPLC乙腈，美國Fisher Scientific公司；超純水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 儀器與設備

Triple Quad 5500+超高效液相串聯質譜，AB SCIEX公司；氮吹濃縮儀，廣州得泰儀器科技有限公司；冷凍離心機，湖南平凡科技有限公司；渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準儲備溶液和工作液

將11種獸藥標準品（100 mg·L-1）分別移取100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1 mg·L-1的磺胺混合標準溶液；稱取（1.00±0.02）g不含11種獸藥殘留的空白豬肉樣品，提取和凈化，得到空白基質溶液；混合標準溶液用空白基質溶液逐級稀釋，分別得到10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、150 μg·L-1和200 μg·L-1的基質混合標準工作液，用于繪制基質匹配校準曲線。

1.3.2 上機溶液制備

取豬肉樣品，絞碎并均質，稱取試樣（1.00±0.02）g，加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋振蕩、超聲、離心，取上清液，殘渣用磷酸鹽緩沖液重復提取，合并兩次上清液備用；采用Knorth HLB固相萃取柱對上清液進行凈化和洗脫，洗脫液渦旋混勻、氮吹至干，用10%甲醇-10%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）復溶過膜，得到待上機樣品溶液。

1.3.3 儀器檢測條件

（1）色譜條件。Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱，柱溫35 ℃，流速0.3 mL·min-1，進樣量1 μL，流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的甲醇∶乙腈（2∶8，體積比）溶液，洗脫方式為梯度洗脫，見表1。

（2）質譜條件。電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓為正離子模式（ESI+）5 500 V；離子源溫度350 ℃，氣簾氣（Curtain gas）35 psi，離子源氣體1（Gas Ⅰ）和氣體2（Gas Ⅱ）分別設置為50和60，檢測方式MRM。

2 結果與分析

2.1 凈化方法選擇

動物源食品的基質比較復雜，易對液質聯用的電噴霧離子化過程中形成的目標化合物分子信號造成干擾，影響檢測靈敏度和準確性。有效的基質凈化前處理方法能減弱和消除基質效應。其中，固相萃取技術在動物源性食品基質凈化領域中應用廣泛，能夠快速、簡便、高效地去除各類食品中的干擾基質，達到分離和富集待測組分的目的[5]。故本試驗選擇固相萃取柱凈化樣品，通過方法學評估，能滿足磺胺類獸藥殘留的檢測需求。

2.2 質譜條件優化及譜圖

將200 μg·L-1的11種磺胺混合標準溶液以針泵的方式連續進樣，在正離子模式下，采用一級質譜掃描（Q1 Scan）確定母離子質荷比；采用碎片離子掃描（Product Ion Scan）確定干擾少、信噪比高的1～2個子離子，分別作為定性離子和定量離子；采用多反應監測掃描（Multiple Reaction Monitoring，MRM）優化定性離子和定量離子的去簇電壓（Declustering Potential，DP）和碰撞能量（Collision Energy，CE），最終建立質譜采集參數，結果見表2。以優化的質譜參數為方法，獲得11種磺胺類化合物的總離子流圖（見圖1）和磺胺甲噁唑質譜圖（見圖2、圖3）。

2.3 方法學評估

2.3.1 線性關系和檢出限、定量限

使用基質空白溶液配制10～200 μg·L-1的標準工作液，以磺胺類化合物的濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線，本試驗在豬肉空白基質中加入10 μg·kg-1混合標準物質，參考章萍萍等[6]的計算方法，按試驗方法進行6次平行試驗，計算檢測結果的標準偏差（Standard Deviation，SD）、3SD（檢出限）、10SD（定量限），結果見表3。11種磺胺類化合物在10～200 μg·L-1呈現良好的線性關系，相關系數大于0.994 8，檢出限為0.84～1.62 μg·kg-1，定量限為2.8～5.4 μg·kg-1，均滿足《食品安全國家標準 動物性食品中四環素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB 31658.17—2021）[7]的要求，且低于標準。

2.3.2 精密度和回收率

準確稱取空白基質樣品，在低、中、高3個濃度水平下，采用優化后的檢測方法，進行6次平行試驗，根據結果計算回收率和精密度，用于評價方法。由表4可知，3個水平下，回收率為74.5%～109.9%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.09%～8.12%，本方法的回收率和精密度均符合獸藥多殘留分析要求。

3 結論

本研究建立了一種同時測定11種磺胺類化合物的UPLC-MS/MS獸藥多殘留分析方法，采用固相萃取法凈化，通過優化質譜參數，用電噴霧正離子（ESI+）多反應監測模式對目標化合物進行定性定量分析。通過方法學考察評估，證明該方法靈敏、快速、高效，可以滿足實際工作需要。

參考文獻

[1]王曉茵，宋翠平，孫曉亮，等.改良柱前熒光胺衍生化-高效液相色譜法測定豬肉中11種磺胺類藥物殘留[J].肉類研究，2022，36（2）：33-38.

[2]中華人民共和國農業農村部，國家衛生健康委員會，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準 食品中41種獸藥最大殘留限量：GB 31650.1—2022[S].北京：中國標準出版社，2022.

[3]KANDA M，NAKAJIMAT，HAYASHIH，et al.Multi-residue determination of polar veterinary drugs in livestock and fishery products by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Journal of AOAC International，2015，98（1）：230-247.

[4]DESMARCHELIER A，FAN K，MINH TIEN M，et al.Determination of 105 antibiotic， anti-inflammatory， antiparasitic agents and tranquilizers by LC-MS/MS based on an acidic QuEChERS-like extraction[J].Food Additives & Contaminants： Part A，2018，35（4）：647-661.

[5]季寶成，楊瀾瑞，韓雨，等.動物源性食品獸藥多殘留檢測中基質凈化與液相色譜-質譜聯用技術研究進展[J/OL].輕工學報：1-9[2023-07-20].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/41.1437.ts.20230625.0928.006.html.

[6]章萍萍，方如意，任可.動物源性食品中十三種磺胺類藥物檢測方法優化[J].中國食品工業，2023（5）：62-66.

[7]中華人民共和國農業農村部，國家衛生健康委員會，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準 動物性食品中四環素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法：GB 31658.17—2021[S].北京：中國標準出版社，2021.