國產與進口兩種商品化NBB培養基檢測啤酒有害菌的效果比較

李艷艷 劉小燕 趙琳娜 白繼超 崔生輝 徐中清

摘 要：目的：比較國產和進口NBB培養基對啤酒有害菌的檢測效果。方法：將干酪乳桿菌、短乳桿菌、四聯球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種、植物乳桿菌植物亞種6株乳酸菌接種到NBB-B和NBB-A培養基中，28 ℃厭氧培養24～72 h，測定OD值，觀察培養基變色、菌落生長狀態等。同時，用不同濃度麥芽啤酒配制NBB培養基，確定配制培養基用啤酒的最適麥芽度。結果：6株乳酸菌在國產和進口NBB-B培養基中靈敏度和指示特征無明顯差異。戊糖片球菌在國產NBB-A培養基培養48 h變色情況略差于進口NBB-A，培養72 h后，與進口NBB-A培養基無差異。通過不同麥芽度比對試驗，采用10°P啤酒配制的NBB培養基菌株生長情況最好。結論：國產與進口NBB培養基在靈敏度、指示能力、菌落生長等方面無明顯差異，國產NBB培養基可用于國內啤酒生產企業檢測啤酒有害菌。

關鍵詞：NBB培養基；啤酒有害菌；麥芽度；乳酸菌

Abstract： Objective： To compare the detection effect of domestic and imported NBB culture media on harmful bacteria in beer. Method： Six strains of lactic acid bacteria， including Lactobacillus casei， Lactobacillus brevis， Micrococcustetragenus， Pediococcuspentosaceus， Lactococcus lactis subsp. cremoris， and Lactobacillus plantarum subsp. plantarum， were inoculated into NBB-B and NBB-A media. They were anaerobic cultured at 28 ℃ for 24～72 h， and their OD values were measured. The discoloration of the media and the growth status of the colonies were observed. At the same time， prepare NBB culture medium with different concentrations of malt beer to determine the optimal malt content of the beer used for preparing the culture medium. Result： There was no significant difference in sensitivity and indicator characteristics between the 6 strains of lactic acid bacteria in domestic and imported NBB-B culture media. After 48 hours of cultivation on domestic NBB-A medium， the appearance of Pediococcuspentosaceus turned slightly worse than that on imported NBB-A. After 72 hours of cultivation， there was no difference compared to imported NBB-A medium. Through the comparison experiment of different malt degrees， the NBB culture medium prepared with 10°P beer showed the best growth performance. Conclusion： There is no significant difference in sensitivity， indicator ability， and colony growth between domestic and imported NBB culture media. Domestic NBB culture media can be used for detecting harmful beer bacteria in domestic beer production enterprises.

Keywords： NBB culture medium; harmful bacteria in beer; malt degree; lactic acid bacteria

啤酒是一種以麥芽為原料，經酵母發酵釀制而成的低酒精度釀造酒。啤酒釀造是一個比較復雜的過程，在生產過程中難免會被有害菌污染。這些有害微生物在啤酒中生長繁殖，會影響啤酒的質量和風味，嚴重時會造成巨大的經濟損失。啤酒中有害菌按照生理學分類，主要分為細菌、野生酵母和霉菌[1]；按照對啤酒的有害程度可分為專性啤酒有害菌、潛在啤酒有害菌、間接啤酒有害菌、指示性微生物和潛伏微生物5個等級，其中專性啤酒有害菌對啤酒質量穩定性的影響最大，包括乳酸桿菌、四聯球菌、果膠桿菌和釀酒酵母等。

啤酒廠十分重視對啤酒有害菌的檢測，主要采用傳統平板計數法檢測，使用的培養基主要有VLB-S7、ABD、MRS和NBB等，其中NBB培養基是一種能生長啤酒有害菌和多種野生酵母的選擇性和鑒別性培養基[2]。成品化NBB培養基的主要產品有NBB-A（NBB固體培養基）、NBB-B（NBB液體培養基）、NBB-C（NBB濃縮液體培養基）3種。NBB培養基添加了啤酒液體，為污染微生物的生長提供了相似的生長環境，NBB含有的半胱氨酸鹽酸鹽可以降低培養基的氧化還原電位，有利于乳酸菌的生長。NBB-A和NBB-B中含有酸性指示劑，如果細菌產酸，培養基的顏色將由紅色變成黃色；NBB-C不含指示劑，為濃縮液體培養基，適用于已發現的所有啤酒有害菌的檢測，是目前啤酒廠使用最多的培養基[3]。但目前NBB培養基依賴進口，價格較昂貴，供貨周期較長，增加了啤酒生產在檢測過程中的成本。目前國產商品化NBB培養基并不多，本研究將國產的啤酒有害細菌培養基與進口品牌NBB-B培養基進行比對驗證，旨在為國內啤酒生產企業進行培養基選擇時提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ABX0009、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）ABX0010、四聯球菌（Micrococcustetragenus）ABX0011、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）ABX0013、乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris）ABX0012、植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）ABX0015，由北京奧博星生物技術有限責任公司保存提供；NBB-B培養基（批號20210326）、瓊脂粉（批號0145）、MRS培養基（批號20210326），北京奧博星生物技術有限責任公司；NBB-B培養基（批號：0005399414），德國德樂；10°P啤酒，燕京；12°P啤酒，德國進口；14.5°P啤酒，美國進口；厭氧袋，日本三菱。

1.2 儀器與設備

DHP培養箱，天津中環試驗儀器廠；S20 pH計、XS205DU電子天平，瑞士梅特勒；YX-280D手提式滅菌器，合肥華泰醫療設備有限公司；UV-1800紫外分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司；SY2D超凈工作臺，江蘇博萊爾凈化設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌液制備方法

（1）菌種活化。將保存于-80 ℃條件下的菌種取出，用接種環取一環接種于MRS培養基中，36 ℃厭氧培養72 h，再取單菌落劃線于MRS培養基，36 ℃厭氧培養72 h，二代新鮮培養物備用。

（2）菌液稀釋。用無菌棉簽取MRS平板二代新鮮培養物于無菌生理鹽水中，制成菌懸液，OD值為1.0～1.5，再分別用生理鹽水稀釋至接種水平為20～200 CFU/100 μL的工作菌懸液。

1.3.2 培養基配制方法

（1）不同麥芽度啤酒配制NBB-B培養基。按照進口和國產NBB-B培養基配方說明分別稱取配制500 mL培養基用量干粉于250 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，再分別加入250 mL經脫氣的10°P、12°P和14.5°P不同麥芽度的啤酒，調整pH值為5.8±0.2，分裝10 mL/支，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

（2）NBB-B培養基配制方法。按照進口和國產NBB-B培養基配方說明分別稱取配制500 mL培養基用量干粉于250 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，再加入250 mL經脫氣的10°P啤酒，調整pH值為5.8±0.2，分裝10 mL/支，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

（3）NBB-A培養基配制方法。按照進口和國產NBB-B培養基配方說明分別稱取配制500 mL培養基用量干粉于250 mL去離子水中，加入瓊脂粉7.5 g，加熱煮沸溶解，再加入250 mL經脫氣的10°P啤酒，調整pH值為5.8±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min，冷至50 ℃時無菌環境下制備平板，備用。

1.3.3 微生物生長效果檢驗方法

（1）不同麥芽度啤酒配制培養基微生物生長效果對比。取100 μL工作菌懸液接種至10 mL 10°P、12°P和14.5°P不同麥芽度啤酒配制的培養基中，每株菌接種2支并取1支作為空白對照，28 ℃厭氧培養72 h，培養過程中觀察菌株在培養基中的生長濁度及顏色變化。

（2）國產和進口NBB-B培養基菌株培養效果對比實驗。取100 μL工作菌懸液接種至10 mL NBB-B培養基中，每株菌接種2支并取1支作為空白對照，28 ℃厭氧培養72 h，培養過程中每24 h觀察不同菌種在各培養基中的生長濁度及顏色變化，并檢測菌液OD620值。

（3）國產和進口NBB-A培養基菌株培養效果對比實驗。取100 μL工作菌懸液涂布于國產和進口NBB-A培養基中，每株菌涂布2塊并取1塊作為空白對照，同時用MRS瓊脂培養基進行計數。28 ℃厭氧培養72 h，培養過程中觀察檢測平板的顏色變化情況和菌落形態。

2 結果與分析

2.1 不同麥芽度啤酒對NBB-B培養基的影響

將6株乳酸菌分別接種于3種麥芽度啤酒配制的國產和進口NBB-B培養基中，28 ℃厭氧培養72 h，觀察菌液濃度和培養基顏色。由表1可知，6株乳酸菌在10°P啤酒配制的國產和進口NBB-B培養基中生長特征和靈敏度均無差異；短乳桿菌在12°P啤酒配制的進口NBB-B培養基不變色，戊糖片球菌在12°P啤酒配制的國產和進口NBB-B培養基中均微變黃色，其他4株乳酸菌在12°P啤酒配制的國產和進口NBB-B培養基中生長濃度均無明顯差異；但在14.5°P啤酒配制的國產和進口NBB-B培養基中除戊糖片球菌在國產培養基中微變黃色，其他菌株在培養基中生長均不變色，四聯球菌在兩種培養基中均不生長，短乳桿菌在進口NBB-B培養基中生長濁度低，乳酸乳球菌乳脂亞種在兩種培養基中生長濁度低。

麥芽度濃度越高培養基靈敏度越差，麥芽度濃度增高對四聯球菌和乳酸乳球菌乳脂亞種菌株的生長存在抑制作用，戊糖片球菌培養基變色差。結果顯示采用麥芽度為10°P啤酒配制培養基效果較好。

2.2 國產和進口NBB-B培養基菌株生長對比實驗結果

6株乳酸菌接種至國產和進口NBB-B培養基中，28 ℃厭氧培養24 h，均可見菌株微弱生長，但培養基顏色均未發生變色；培養36 h，培養基均明顯渾濁，肉湯均由紅色變微黃色；培養至48 h，菌株均生長良好，培養基均變黃色。

根據6株乳酸菌在國產和進口NBB-B培養基中不同生長時間菌液OD620值繪制曲線，圖1結果顯示，在培養24 h、36 h、48 h后，短乳桿菌和乳酸乳球菌乳脂亞種在國產培養基中OD620值均高于進口培養基，其他4株菌無明顯差異。

2.3 國產和進口NBB-A培養基菌株生長對比實驗結果

6株乳酸菌接種至國產和進口NBB-A培養基中，28 ℃厭氧培養48 h，戊糖片球菌在國產和進口培養基中菌落生長數量無差異，在國產NBB-A平板中菌落周圍培養基變黃，平板上有少量紅色區域；在進口培養基中菌落周圍培養基變黃，平板上紅色區域多。其他5株乳酸菌在國產和進口培養基中菌落圓潤、生長豐滿，均為乳白色菌落，培養基全部變黃，詳見圖2。培養72 h，6株乳酸菌在國產和進口NBB-A培養基中菌落生長數量和形態均無明顯差異，培養基全部變黃，菌落計數結果詳見表2。

3 討論

啤酒生產過程中微生物污染會嚴重影響產品質量，造成產品變質[4]。啤酒中有害菌會影響啤酒質量穩定性，其中乳酸桿菌、四聯球菌對啤酒的危害最大，能使啤酒產生渾濁和異味，它們能耐受啤酒中特殊的條件，在低pH值、厭氧、含有一定量的酒精、缺乏一定量營養物質和低溫的環境下仍能在啤酒中很好地生長[5]。研究發現，啤酒中必然有害菌中短乳桿菌出現概率約為40%，干酪乳桿菌出現概率約為3%，片球菌出現概率約為17%[6]；有研究從工藝啤酒中分離出23株啤酒腐敗菌，經鑒定為15株短乳桿菌、3株植物乳桿菌、1株副布氏乳桿菌、2株副干酪乳桿菌和2株達氏片球菌[7-8]。本研究使用干酪乳桿菌、短乳桿菌、四聯球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種和植物乳桿菌植物亞種6種啤酒中必然有害菌對國產和進口NBB進行驗證，結果顯示6種乳酸菌在國產和進口NBB培養基中均能生長良好。

NBB配制說明中使用水和啤酒按照1∶1比例配制NBB-B培養基。有研究發現啤酒濃度越高，對啤酒有害菌的抑制能力越強[9]。本次驗證實驗采用10°P、12°P、14.5°P 3種麥芽度啤酒配制NBB-B培養基，結果顯示6株乳酸菌在10°P麥芽啤酒配制的國產和進口NBB-B培養基中生長靈敏度和特征無明顯差異；戊糖片球菌在12°P麥芽啤酒配制的國產和進口培養基中變色均差，生長濃度無差異；短乳桿菌在12°P麥芽啤酒配制的國產培養基中變黃色，在進口培養基中不變色，生長濃度無差異；在14.5°P麥芽啤酒配制的國產和進口NBB-B培養基中除戊糖片球菌在國產培養基中微變黃色，其他菌株在培養基中生長均不變色，四聯球菌在兩種培養基中均不生長，短乳桿菌在進口NBB-B培養基中生長濁度低，乳酸乳球菌乳脂亞種在兩種培養基中生長濁度低。由此可見，麥芽度濃度越高培養基靈敏度越差，濃度增高對四聯球菌和乳酸乳球菌乳脂亞種菌株的生長存在抑制作用，戊糖片球菌培養基變色差。本研究采用麥芽度為10°P的啤酒配制的培養基效果較好。

啤酒工廠用于啤酒有害菌檢測的培養基主要有R-R培養基、NBB系列培養基以及MRS培養基[10]。R-R培養基主要選擇性檢測乳酸菌和片球菌，對巨球菌不能檢出[11]；MRS培養基主要選擇性檢測乳酸菌和片球菌；NBB系列培養基檢測范圍較廣，基本可以檢測所有啤酒有害菌[12]。國內學者比較了乳酸短桿菌、四聯球菌、醋化醋酸桿菌在NBB、MRS、Raka-Ray、VLB-S7、番茄汁培養基、自配培養基A和自配培養基UBA上的生長情況，結果顯示NBB對乳酸桿菌的檢測效果最好[13-14]。本研究選用國產NBB與進口NBB進行了比較，結果顯示6株乳酸菌在國產NBB培養基中生長72 h靈敏度和菌落特征與進口NBB培養基無明顯差異。

4 結論

通過不同麥芽度比對試驗，采用10°P啤酒配制的NBB培養基菌株生長情況最好。6株乳酸菌在國產和進口NBB-B培養基中生長靈敏度和指示特征無明顯差異，在國產NBB-A培養基與進口NBB-A培養基培養72 h菌落生長特征無明顯差異。目前NBB培養基依賴進口，價格較昂貴，供貨周期較長，國產NBB培養基可供于國內啤酒生產企業，降低檢測成本。

參考文獻

[1]倪守仟，江歡.啤酒生產常見微生物的鑒別研究[J].中外酒業·啤酒科技，2020（5）：40-44.

[2]葉青，孫培龍.啤酒有害菌檢測培養基的比較[J].食品與發酵工業，2005，31（1）：27-30.

[3]郭秀青.厭氧菌檢測中NBB使用情況匯總[J].啤酒科技，2008（3）：6.

[4]楊祥根.啤酒有害菌的預防與控制[J].啤酒科技，2012（6）：55.

[5]張俊川，戚芬，劉繼聲.啤酒有害菌檢測及NBB的使用[J].啤酒科技，2004（4）：50-51.

[6]葉子豪.啤酒釀造過程中有害微生物污染因素及防治策略[J].現代農業科技，2011（9）：370-371.

[7]JANAGAMA H K，MAI T，HAN S，et al.Dipstick assay for rapid detection of beer spoilage organisms[J].J AOAC Int，2018，101（6）：1913-1919.

[8]EL SHERIF Z A，MOHAMED A O，WALASH M I，et al.Spectrophotometric determination of loperamide hydrochloride by acid-dye and charge-transfer complexation methods in the presence of its degradation products[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2000，22（1）：13-23.

[9]嚴偉杰，王德良，曹健，等.啤酒有害菌檢測培養基優化研究[J].釀酒科技，2009（11）：58-61.

[10]尹麗霞.R-R和NBB培養基檢測啤酒有害菌的對比[J].啤酒科技，2011（10）：50.

[11]葉青，孫培龍.啤酒有害菌檢測培養基的比較[J].食品與發酵工業，2005，31（1）：27-30.

[12]汪玉梅.啤酒微生物檢測中幾種培養基的對比[J].啤酒科技，2004（7）：35-36.

[13]袁雪萍.啤酒有害菌培養基和檢測技術的研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2012.

[14]林佳，陸健.啤酒污染微生物檢驗培養基的比較研究[J].食品科學，2008，29（5）：279-282.